Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Résumé

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Résumé

La plupart des organismes vivants possèdent des rythmes circadiens, qui sont des processus biologiques qui se produisent sur une période d’environ 24 heures et régulent un répertoire varié de processus cellulaires et physiologiques allant des cycles veille-sommeil au métabolisme. Ce mécanisme d’horloge entraîne l’organisme en fonction des changements environnementaux et coordonne la régulation temporelle des événements moléculaires et physiologiques. Auparavant, il a été démontré que les rythmes circadiens autonomes sont maintenus même au niveau de la cellule unique en utilisant des lignées cellulaires telles que les fibroblastes NIH3T3, qui ont joué un rôle déterminant dans la découverte des mécanismes des rythmes circadiens. Cependant, ces lignées cellulaires sont des cultures homogènes dépourvues de multicellularité et de communications intercellulaires robustes. Au cours de la dernière décennie, des travaux approfondis ont été réalisés sur le développement, la caractérisation et l’application d’organoïdes 3D, qui sont des systèmes multicellulaires in vitro qui ressemblent à des structures et des fonctions morphologiques in vivo . Cet article décrit un protocole de détection des rythmes circadiens à l’aide d’un rapporteur bioluminescent dans les entéroïdes intestinaux humains, ce qui permet d’étudier les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires in vitro.

Introduction

Horloge circadienne
Tous les organismes, des bactéries aux mammifères, ont une relation complexe et dynamique avec leur environnement. Dans cette relation, l’adaptation aux changements environnementaux est essentielle à la survie des organismes. La plupart des organismes possèdent des rythmes circadiens qui leur permettent d’adapter et d’optimiser leurs fonctions aux cycles diurnes d’environ 24 h. L’horloge circadienne est un réseau hiérarchique d’horloges centrales et périphériques qui travaillent en coopération pour maintenir l’homéostasie physiologique et maintenir les organismes synchronisés avec les changements quotidiens

Protocole

Toutes les expériences utilisant des tissus humains pour la génération d’EIH ont été approuvées par un CEE du CCHMC (IRB#2014-0427). Voir le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole.

REMARQUE : Pour illustrer la procédure décrite dans ce protocole, nous avons utilisé des entéroïdes intestinaux humains (HIE) Bmal1-luc . Ces entéroïdes ont subi une transduction lentivirale stable²² avec le plasmide rapporteur pABpuro-BluF, qui contient le promoteur Bmal1 fusionné à la luciférase, montrant l’activité du promoteur Bmal1

Discussion

Le test de bioluminescence offre plusieurs avantages pour l’étude des rythmes circadiens, ce qui nécessite la collecte de données à partir d’expériences à long terme. Tout d’abord, il permet aux chercheurs de surveiller l’expression génique ou la protéine d’intérêt au fur et à mesure que les cellules se déplacent et prolifèrent. Sans faire d’ajustements inutiles ni perturber les fonctions des cellules, les événements cellulaires intéressés ou l’expression des gènes peuvent être enregistr?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor