Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Résumé

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Résumé

La plupart des organismes vivants possèdent des rythmes circadiens, qui sont des processus biologiques qui se produisent sur une période d’environ 24 heures et régulent un répertoire varié de processus cellulaires et physiologiques allant des cycles veille-sommeil au métabolisme. Ce mécanisme d’horloge entraîne l’organisme en fonction des changements environnementaux et coordonne la régulation temporelle des événements moléculaires et physiologiques. Auparavant, il a été démontré que les rythmes circadiens autonomes sont maintenus même au niveau de la cellule unique en utilisant des lignées cellulaires telles que les fibroblastes NIH3T3, qui ont joué un rôle déterminant dans la découverte des mécanismes des rythmes circadiens. Cependant, ces lignées cellulaires sont des cultures homogènes dépourvues de multicellularité et de communications intercellulaires robustes. Au cours de la dernière décennie, des travaux approfondis ont été réalisés sur le développement, la caractérisation et l’application d’organoïdes 3D, qui sont des systèmes multicellulaires in vitro qui ressemblent à des structures et des fonctions morphologiques in vivo . Cet article décrit un protocole de détection des rythmes circadiens à l’aide d’un rapporteur bioluminescent dans les entéroïdes intestinaux humains, ce qui permet d’étudier les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires in vitro.

Introduction

Horloge circadienne
Tous les organismes, des bactéries aux mammifères, ont une relation complexe et dynamique avec leur environnement. Dans cette relation, l’adaptation aux changements environnementaux est essentielle à la survie des organismes. La plupart des organismes possèdent des rythmes circadiens qui leur permettent d’adapter et d’optimiser leurs fonctions aux cycles diurnes d’environ 24 h. L’horloge circadienne est un réseau hiérarchique d’horloges centrales et périphériques qui travaillent en coopération pour maintenir l’homéostasie physiologique et maintenir les organismes synchronisés avec les changements quotidiens ^1,2. Chez les mammifères, l’horloge centrale ou maîtresse située dans le noyau suprachiasmatique (SCN) reçoit des signaux externes, tels que la lumière, et transmet l’information aux horloges périphériques via une interaction avancée de voies de signalisation neuronales et humorales³. En plus de l’horloge centrale, les tissus périphériques possèdent leur propre mécanisme d’horloge circadienne autonome cellulaire, maintenu par une boucle de rétroaction négative transcriptionnelle-traductionnelle (TTFL) régulant les gènes contrôlés par l’horloge (CCG) spécifiques aux ^tissus4,5. Cette machinerie moléculaire produit une rythmicité d’environ 24 heures dans les événements cellulaires et physiologiques, tels que les expressions géniques, les voies de signalisation, les réponses immunitaires et la digestion. L’horloge circadienne est présente dans presque toutes les cellules de mammifères, et il a été démontré que jusqu’à 50% des modèles d’expression des gènes présentent une rythmicité circadienne⁶. Compte tenu de l’abondance des CCG, la perturbation de ce mécanisme d’horloge peut entraîner des problèmes physiologiques critiques. Par conséquent, des recherches sur les rythmes circadiens sont nécessaires pour élucider les mécanismes biologiques essentiels et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Système de rapporteur luciférase
Dans les études circadiennes, la surveillance en temps réel est essentielle pour une meilleure compréhension des comportements et des réponses cellulaires, car elle permet de suivre les changements temporels dans l’expression des gènes et/ou les niveaux de protéines, fournissant ainsi des informations sur les mécanismes moléculaires régulés par l’horloge circadienne. De plus, la surveillance en temps réel permet aux chercheurs d’étudier les effets des changements environnementaux sur les mécanismes moléculaires ^7,8. Il existe de nombreuses techniques pour les études de surveillance en temps réel, y compris le test de bioluminescence, qui est largement utilisé pour suivre l’expression des gènes ou les niveaux de protéines au fil du temps. Le test de bioluminescence est une méthode de détection des processus biologiques en utilisant la production de lumière comme lecture. Dans cet essai, une enzyme oxydative qui produit une bioluminescence (par exemple, la luciférase) est transfectée de manière transitoire ou stable dans les cellules d’intérêt, et la lecture de la bioluminescence est mesurée en présence d’un substrat (par exemple, la luciférine) au fil du temps. Par exemple, l’enzyme luciférase produit une bioluminescence en oxydant le substrat luciférine en présence d’ATP⁹. En raison de sa courte demi-vie, 3-4 h¹⁰, la luciférase de luciole est un outil puissant pour les études circadiennes en termes de surveillance dynamique en temps réel avec un bruit de fond minimal 11,12,13. Pour l’insertion d’ADN avec un promoteur marqué à la luciférase ou un cadre de lecture ouvert (ORF), le système d’administration de gènes lentiviraux est une méthode fiable qui offre une efficacité de transduction élevée, une intégration stable et une faible immunogénicité. La transduction stable d’un rapporteur bioluminescent fournit une expression robuste dans les cellules en division et non divisées, générant des données cohérentes pour les études circadiennes¹⁴.

Organoïde comme modèle
Les lignées cellulaires bidimensionnelles immortalisées traditionnelles ont joué un rôle déterminant dans les études biologiques, allant de la découverte des mécanismes moléculaires fondamentaux des rythmes circadiens au criblage de médicaments. Malgré la commodité de l’utilisation de lignées cellulaires homogénéisées, elles manquent de structures multicellulaires et d’interactions intercellulaires. En revanche, les organoïdes sont des structures multicellulaires in vitro 3D « semblables à des organes » qui imitent la structure d’un organe dans une boîte en présentant une similitude avec l’architecture tissulaire in vivo et la multicellularité, y compris les types de cellules dérivées, progénitrices et différenciées^15,16. Possédant des caractéristiques d’auto-organisation, de multicellularité et de fonctionnalité fait des organoïdes un modèle in vitro remarquable représentant les processus cellulaires et physiologiques se produisant dans les tissus réels¹⁷. Différents types d’organoïdes peuvent être dérivés de cellules souches pluripotentes par différenciation dirigée ou de cellules souches adultes prélevées dans divers organes, notamment l’intestin grêle, le cerveau, le foie, les poumons et les reins^18,19. Étant donné que les structures organoïdes possèdent une architecture et une fonction réelles de type tissulaire avec une multicellularité et une interaction dynamique de cellule à cellule, elles sont supérieures aux lignées cellulaires homogénéisées pour comprendre les événements cellulaires qui se produisent dans les tissus in vivo. Les organoïdes sont également facilement manipulables et peuvent être cultivés dans des conditions contrôlées, ce qui les rend utiles pour les études circadiennes²⁰.

L’objectif principal de ce travail est d’introduire une méthode de surveillance en temps réel utilisant un test de bioluminescence spécifiquement conçu pour l’étude des rythmes circadiens dans les organoïdes 3D multicellulaires. La surveillance en temps réel des événements cellulaires à l’aide d’une technique de test de bioluminescence a été largement réalisée pour des cultures cellulaires dépourvues de la complexité multicellulaire et des communications intercellulaires qui existent dans les tissus réels. Les organoïdes 3D offrent des opportunités uniques pour étudier les fonctions des rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires in vitro. Par exemple, on pourrait étudier les rythmes circadiens dans les organoïdes dont la composition cellulaire est modifiée ou les organoïdes dérivés des tissus malades des patients. Ce protocole permet l’utilisation d’un test de bioluminescence pour étudier différents aspects des rythmes circadiens dans un modèle in vitro plus pertinent sur le plan physiologique, les organoïdes, ce qui nous aidera à mieux comprendre les rôles des rythmes circadiens dans les organes périphériques.

Protocole

Toutes les expériences utilisant des tissus humains pour la génération d’EIH ont été approuvées par un CEE du CCHMC (IRB#2014-0427). Voir le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux utilisés dans ce protocole.

REMARQUE : Pour illustrer la procédure décrite dans ce protocole, nous avons utilisé des entéroïdes intestinaux humains (HIE) Bmal1-luc . Ces entéroïdes ont subi une transduction lentivirale stable²² avec le plasmide rapporteur pABpuro-BluF, qui contient le promoteur Bmal1 fusionné à la luciférase, montrant l’activité du promoteur Bmal1 ²¹.

1. Transduction lentivirale

1. Effectuer la transduction lentivirale²² dans des conditions enrichies en cellules souches pour les HIE. Plus précisément, assurez-vous de la formation de sphéroïdes dans les EHI dans les 3 à 4 jours suivant leur passage dans le milieu de croissance intestinale, ce qui crée des conditions enrichies en cellules souches.
2. Après la transduction lentivirale²², effectuer une sélection d’antibiotiques avec 2 μg/mL de puromycine, récupérer les HIE résistants à la puromycine et les faire passer avec une densité relativement élevée (c’est-à-dire 1 puits dans 2 puits) pour 2-3x. Si le taux de croissance des HIE est lent, ajoutez 10 μM inhibiteurs de ROCK (Y-27632) et 10 μM inhibiteurs de GSK-3 (CHIR-99021) au milieu de croissance des organoïdes intestinaux.

2. Préparation d’organoïdes pour le dosage de la bioluminescence

1. Jour 1 : Passage des HIE à des plats ronds de 35 mm.
   1. En bref, pour l’expansion des HIE, mélangez les HIE avec une matrice de culture 3D à facteur de croissance réduit (DFG) et ensemencez-les sur des plaques de 24 puits avec trois gouttelettes de 10 μL de matrice de culture 3D par puits. Ajoutez 350 μL de milieu de culture HIE et changez-le tous les deux jours.
      REMARQUE : La densité de HIE dans la matrice de culture 3D est essentielle pour la croissance des entéroïdes. Approximativement, le nombre de sphéroïdes doit dépasser plus de 50 dans chaque gouttelette. Si le nombre est faible, le taux de croissance de l’EIH est affecté négativement.
   2. Lorsque les HIE se développent suffisamment (environ 7 jours après le post-passage), collectez les HIE de quatre puits dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
   3. Lavez les HIE avec le PBS froid à l’aide d’une mini-centrifugeuse de paillasse (2 000 × g) pendant 40 secondes pour éliminer les débris et l’excès de matrice de culture 3D à l’aide d’une pipette.
   4. Ajoutez 0,5 mL de PBS froid dans la pastille et appliquez une turbulence physique en seringue jusqu’à 10x avec une seringue d’insuline de 1 mL pour dissocier les HIE.
   5. Faites tourner les HIE dissociés à l’aide d’une mini-centrifugeuse de paillasse comme à l’étape 2.1.3 et retirez doucement le surnageant à l’aide d’une pipette. Ensuite, placez le tube de microcentrifugation avec la pastille HIE sur de la glace pour qu’il refroidisse pendant environ 3 min.
   6. Ajoutez la matrice de culture GFR 3D dans le tube de microcentrifugation et mélangez-la avec la pastille HIE.
      REMARQUE : Calculez la quantité de matrice de culture 3D en fonction du nombre de boîtes rondes de 35 mm qui seront utilisées pour l’expérience. Nous ensemenceons généralement 30 μL de gouttelettes de matrice de culture 3D par plat rond.
   7. Ensemencez le mélange d’EIH et de la matrice de culture 3D au centre de la boîte ronde de 35 mm et incubez la boîte à 37 °C pendant 20 min pour solidifier la matrice de culture 3D.
      REMARQUE : La densité des EIH d’ensemencement doit être déterminée expérimentalement. Sur la base de l’intensité de la bioluminescence, on peut déterminer le nombre d’EIH au cours de ce processus.
   8. Ajoutez 2 ml de milieu de croissance organoïde intestinal préchauffé dans chaque plat et incubez les plats dans un incubateur de_CO2 jusqu’à l’étape suivante.
2. Jour 3 : Initiation de la différenciation
   1. Pour amorcer la différenciation des EHI, retirer le milieu de croissance et ajouter 2 mL de milieu de différenciation préchauffé.
      REMARQUE : Voir le Tableau 1 pour les recettes du milieu de différenciation HIE²³.
3. Jour 4 : Aucun processus supplémentaire n’est requis.
4. Jour 5 : Remplacer le milieu des entéroïdes par 2 mL de milieu de différenciation préchauffé.
5. Jour 6 : Synchronisation de l’horloge et enregistrement de la bioluminescence
   1. Pour synchroniser l’horloge moléculaire des entéroïdes, ajoutez 2 μL de 100 μM de dexaméthasone (Dex) pour porter la concentration finale à 100 nM dans chaque boîte, puis incubez les boîtes dans un incubateur de CO₂ (37 °C, 5 % de CO₂) pendant 1 h²⁴.
   2. Pendant la réinitialisation du Dex, préparez le luminomètre d’incubation. Vérifiez le CO₂ et la température du luminomètre d’incubation et réglez-les à 5 % et 37 °C, respectivement.
      REMARQUE : Il est suggéré d’essuyer l’intérieur du luminomètre à incubation avec de l’alcool à 70% avant et après chaque utilisation de la machine pour le garder stérile.
   3. Après la synchronisation de l’horloge, remplissez les entéroïdes avec 3 mL de milieu de différenciation préchauffé contenant 200 μM de D-luciférine.
      REMARQUE : Comme la luciférine est sensible à la lumière, le milieu contenant de la luciférine doit être enveloppé dans du papier d’aluminium et préchauffé dans un bain de chaleur à 37 °C avant de l’appliquer sur le plat.
   4. Placez les plats dans une table à plat à 8 puits du luminomètre d’incubation et couvrez la table d’échantillon avec son couvercle. Placez deux chambres d’humidificateur avec un mouchoir humide ou une éponge sur le dessus de la table d’échantillons. Il s’agit d’un processus unique.
      REMARQUE : Une fois l’expérience commencée, le couvercle du luminomètre à incubation doit être maintenu fermé jusqu’à la fin de l’expérience. Assurez-vous de mouiller suffisamment les mouchoirs/éponges.
   5. Fermez le couvercle de la machine et lancez le programme de mesure de la bioluminescence pendant le nombre de jours et la résolution souhaités.
      1. Sur le logiciel, sélectionnez les paramètres de condition en cliquant sur l’onglet Condition et ajustez les paramètres sur ce panneau : nombre de plats, temps de mesure, traitement en arrière-plan et type de filtre.
         REMARQUE : Pour cette démonstration, nous avons sélectionné tous les plats de A à H ; temps de mesure par défaut, qui est déterminé par le logiciel en fonction du nombre de plats ; temps d’attente pour le traitement en arrière-plan et le type de filtre F0. Comme il existe trois options de filtre, trois couleurs luminescentes peuvent être mesurées simultanément.
      2. Après avoir saisi tous les paramètres appropriés en fonction de l’expérience, enregistrez les paramètres en cliquant sur OK.
      3. Pour commencer à exécuter le test, cliquez sur l’onglet Exécuter | Bouton Démarrer (icône en forme de triangle vert). Observez les données brutes, filtrées par le bruit ou déconnectées en effectuant les sélections appropriées en haut de l’écran du logiciel pendant l’exécution des expériences. Cliquez sur les onglets Brut, Filtré par le bruit ou Tendance pour observer les données sélectionnées.
      4. Observez les signaux jusqu’à 5 jours.
         REMARQUE : Après 5 jours de surveillance dans un luminomètre en incubation, les entéroïdes peuvent commencer à mourir en raison de l’épuisement du support. Pour éviter toute perturbation circadienne possible pendant l’expérience, nous n’effectuons pas de changement de milieu pendant la durée de l’expérience.
      5. À la fin de l’expérience, arrêtez l’exécution en cliquant sur le bouton Arrêter (icône carrée bleue), accédez à l’onglet Fichier , puis cliquez sur Enregistrer sous. Enregistrez les données au format Kronos ; exportez les données vers une feuille de calcul dans la section Fichier en cliquant sur l’option Fichier , puis en sélectionnant Exporter au format Excel sous Fichier pour une analyse plus approfondie.

Résultats

L’enregistrement par bioluminescence a été effectué pour évaluer la rythmicité circadienne des entéroïdes intestinaux humains (HIE) dans deux conditions distinctes : des conditions enrichies en cellules souches à l’aide d’un milieu de croissance organoïde intestinal (Figure 3) et des conditions induisant la différenciation, ce qui a été réalisé en remplaçant le milieu de croissance organoïde intestinal par un milieu de différenciation. Le jour de l’expérience, nous ...

Discussion

Le test de bioluminescence offre plusieurs avantages pour l’étude des rythmes circadiens, ce qui nécessite la collecte de données à partir d’expériences à long terme. Tout d’abord, il permet aux chercheurs de surveiller l’expression génique ou la protéine d’intérêt au fur et à mesure que les cellules se déplacent et prolifèrent. Sans faire d’ajustements inutiles ni perturber les fonctions des cellules, les événements cellulaires intéressés ou l’expression des gènes peuvent être enregistr?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor