Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Özet

Çoğu organizmada bulunan sirkadiyen ritimler, biyolojik süreçlerin zamansal organizasyonunu düzenler. 3D organoidler son zamanlarda fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, organoidlerde sirkadiyen ritimleri gözlemlemek için biyolüminesan raportörlerin kullanımını açıklar ve çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlar.

Özet

Çoğu canlı organizma, yaklaşık 24 saatlik bir süre içinde meydana gelen ve uyku-uyanıklık döngülerinden metabolizmaya kadar çeşitli hücresel ve fizyolojik süreçler repertuarını düzenleyen biyolojik süreçler olan sirkadiyen ritimlere sahiptir. Bu saat mekanizması, çevresel değişikliklere dayalı olarak organizmayı sürükler ve moleküler ve fizyolojik olayların zamansal düzenlemesini koordine eder. Daha önce, otonom sirkadiyen ritimlerin, sirkadiyen ritimlerin mekanizmalarını ortaya çıkarmada etkili olan NIH3T3 fibroblastları gibi hücre hatları kullanılarak tek hücre düzeyinde bile korunduğu gösterilmişti. Bununla birlikte, bu hücre hatları, çok hücrelilik ve sağlam hücreler arası iletişimden yoksun homojen kültürlerdir. Son on yılda, in vivo morfolojik yapılara ve işlevlere benzeyen in vitro çok hücreli sistemler olan 3D organoidlerin geliştirilmesi, karakterizasyonu ve uygulanması üzerine kapsamlı çalışmalar yapılmıştır. Bu makale, çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlayan, insan bağırsak enteroidlerinde bir biyolüminesan raportör kullanarak sirkadiyen ritimleri tespit etmek için bir protokolü açıklamaktadır.

Giriş

Sirkadiyen saat
Bakterilerden memelilere kadar tüm organizmaların çevreleri ile karmaşık ve dinamik bir ilişkisi vardır. Bu ilişki içinde, çevresel değişikliklere adaptasyon, organizmaların hayatta kalması için kritik öneme sahiptir. Çoğu organizma, işlevlerini yaklaşık 24 saatlik günlük döngülere adapte etmelerini ve optimize etmelerini sağlayan sirkadiyen ritimlere sahiptir. Sirkadiyen saat, fizyolojik homeostazı korumak ve organizmaları günlük değişikliklerle senkronize tutmak için işbirliği içinde çalışan hiyerarşik bir merkezi ve periferik saatler ağıdır ^1,2. Memelilerde, suprakiazmati....

Protokol

HİE'lerin üretilmesi için insan dokularını kullanan tüm deneyler, CCHMC'deki bir IRB tarafından onaylandı (IRB # 2014-0427). Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

NOT: Bu protokolde özetlenen prosedürü göstermek için Bmal1-luc insan bağırsak enteroidlerini (HIE'ler) kullandık. Bu enteroidlere, lusiferaza kaynaşmış Bmal1 promotörü içeren ve Bmal1 promotörü^21'in aktivitesini gösteren pABpuro-BluF raportör plazmidi ile stabil lentiviral transdüksiyon²² uygulandı.

1. Lentiviral ....

Tartışmalar

Biyolüminesans testi, uzun süreli zaman kursu deneylerinden veri toplanmasını gerektiren sirkadiyen ritimlerin araştırılması için çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, araştırmacıların, hücreler hareket ettikçe ve çoğaldıkça ilgilenilen gen ekspresyonunu veya proteini izlemelerini sağlar. Gereksiz ayarlamalar yapmadan veya hücrelerin işlevlerini bozmadan, ilgili hücresel olaylar veya gen ekspresyonu, güvenilir gerçek zamanlı veriler sağlayan biyolüminesans okuması kullanılarak kaydedilebi.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor