使用类器官中的生物发光报告基因监测昼夜节律振荡

摘要

存在于大多数生物体中的昼夜节律调节着生物过程的时间组织。3D类器官最近作为一种生理学相关的 体外 模型出现。该协议描述了使用生物发光报告基因来观察类器官中的昼夜节律，从而能够对多细胞系统中的昼夜节律进行 体外 研究。

摘要

大多数生物体都具有昼夜节律，昼夜节律是在大约 24 小时内发生的生物过程，调节从睡眠-觉醒周期到新陈代谢的各种细胞和生理过程。这种时钟机制根据环境变化夹带生物体，并协调分子和生理事件的时间调节。以前，已经证明，即使在单细胞水平上，使用诸如NIH3T3成纤维细胞之类的细胞系也可以维持自主昼夜节律，这些细胞系有助于揭示昼夜节律的机制。然而，这些细胞系是均一培养物，缺乏多细胞性和强大的细胞间通讯。在过去的十年中，在3D类器官的开发、表征和应用方面进行了广泛的工作，3D类器官是 体外 多细胞系统，类似于 体内 形态结构和功能。本文描述了一种在人肠道肠道中使用生物发光报告基因检测昼夜节律的方案，该方案可以在 体外研究多细胞系统中的昼夜节律。

引言

生物钟
所有生物体，从细菌到哺乳动物，都与环境有着复杂而动态的关系。在这种关系中，适应环境变化对于生物体的生存至关重要。大多数生物体具有昼夜节律，使它们能够适应和优化其功能以适应大约 24 小时的昼夜周期。生物钟是由中央钟和外围钟组成的分层网络，它们协同工作以维持生理稳态并使生物体与日常变化保持同步 ^1,2。在哺乳动物中，位于视交叉上核 （SCN） 的中央或主时钟接收外部信号（例如光），并通过神经和体液信号通路的高级相互作用将信息传输到外周时钟³。除了中央时钟外，外周组织还拥有自己的细胞自主生物钟机制，由转录翻译负反馈回路 （TTFL） 维持，该机制调节组织特异性时钟控制基因 （CCG）^4,5。这种分子机制在细胞和生理事件中产生大约 24 小时的节律性，例如基因表达、信号通路、免疫反应和消化。昼夜节律时钟几乎存在于所有哺乳动物细胞中，并且已经证明高达 50% 的基因表达模式表现出昼夜节律性⁶。考虑到CCGs的丰富性，这种时钟机制的破坏可能会导致严重的生理问题。因此，有必要对昼夜节律进行研究，以阐明基本的生物学机制并开发新的治疗策略。

研究方案

所有使用人体组织产生HIE的实验均已获得CCHMC的IRB批准（IRB#2014-0427）。有关与本协议中使用的所有材料有关的详细信息 ，请参阅材料表 。

注意：为了说明本协议中概述的程序，我们使用了 Bmal1-luc 人肠样蛋白 （HIE）。这些肠道样蛋白使用 pABpuro-BluF 报告质粒进行了稳定的慢病毒转导²² ，该质粒含有与荧光素酶融合的 Bmal1 启动子，显示了 Bmal1 启动子²¹ 的活性。

1. 慢病毒转导

1. 在干细胞富集的条件下进行慢病毒转导²² 以检测 HIEs。具体来说，确保在肠道生长培养基中传代后 3-4 天内在 HIE 中形成球状体，从而创造富含干细胞的条件。
2. 慢病毒转导²²后，用2μg/ mL嘌呤霉素进行抗生素筛选，回收嘌呤霉素耐药的HIEs，并以相对较高的密度（即1孔进入2孔）传代2-3x。如果HIEs的生长速度缓慢，则向肠道类器官生长培养基中加入10μM ROCK抑制剂（Y-27632）和10μM GSK-3抑制剂（CHIR-99021）。
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讨论

生物发光测定为昼夜节律的研究提供了几个优点，这需要从长期时间进程实验中收集数据。首先，它使研究人员能够在细胞移动和增殖时监测感兴趣的基因表达或蛋白质。在不进行不必要的调整或破坏细胞功能的情况下，可以使用生物发光读数来记录感兴趣的细胞事件或基因表达，从而提供可靠的实时数据。重要的是，与荧光测定相比，生物发光测定产生的背景噪声最小，因为它是在恒定的黑暗?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor