ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

Summary

מקצבים צירקדיים, הקיימים ברוב האורגניזמים, מווסתים את הארגון הזמני של תהליכים ביולוגיים. אורגנואידים תלת-ממדיים התגלו לאחרונה כמודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה . פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכתבים ביולומינסנטיים כדי לצפות במקצבים צירקדיים באורגנואידים, ומאפשר חקירות חוץ גופיות של מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות.

Abstract

לרוב האורגניזמים החיים יש מקצבים צירקדיים, שהם תהליכים ביולוגיים המתרחשים בפרק זמן של כ-24 שעות ומווסתים רפרטואר מגוון של תהליכים תאיים ופיזיולוגיים, החל ממחזורי שינה-ערות ועד חילוף חומרים. מנגנון שעון זה מאמן את האורגניזם בהתבסס על שינויים סביבתיים ומתאם את הוויסות הזמני של אירועים מולקולריים ופיזיולוגיים. בעבר, הוכח כי מקצבים צירקדיים אוטונומיים נשמרים אפילו ברמת התא הבודד באמצעות קווי תאים כגון פיברובלסטים NIH3T3, אשר סייעו בחשיפת המנגנונים של מקצבים צירקדיים. עם זאת, קווי תאים אלה הם תרביות הומוגניות חסרות רב-תאיות ותקשורת בין-תאית חזקה. בעשור האחרון נעשתה עבודה נרחבת על פיתוח, אפיון ויישום של אורגנואידים תלת-ממדיים, שהם מערכות רב-תאיות במבחנה המזכירות מבנים ופונקציות מורפולוגיות in vivo . מאמר זה מתאר פרוטוקול לזיהוי מקצבים צירקדיים באמצעות כתב ביולומינסנטי באנטרואידים של מעיים אנושיים, המאפשר לחקור מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות במבחנה.

Introduction

שעון ביולוגי
לכל האורגניזמים, מחיידקים ועד יונקים, יש מערכת יחסים מורכבת ודינמית עם סביבתם. בתוך מערכת יחסים זו, הסתגלות לשינויים סביבתיים היא קריטית להישרדותם של אורגניזמים. לרוב האורגניזמים יש מקצבים צירקדיים המאפשרים להם להסתגל ולייעל את תפקודיהם למחזורים יומיים של כ-24 שעות. השעון הצירקדי הוא רשת היררכית של שעונים מרכזיים והיקפיים הפועלים בשיתוף פעולה כדי לשמור על הומאוסטזיס פיזיולוגי ולשמור על אורגניזמים מסונכרנים עם שינויים יומיים ^1,2. ביונקים, השעון המרכזי או השעון הראשי הממוקם בגרעין העל-תצלומי (SCN) מקבל רמזים חיצוניים, כגון אור, ומעביר את המידע לשעונים ההיקפיים באמצעות משחק גומלין מתקדם של מסלולי איתות עצביים והומורליים³. בנוסף לשעון המרכזי, לרקמות היקפיות יש מנגנון שעון ביולוגי תאי אוטונומי משלהן, המתוחזק על ידי לולאת משוב שלילי שעתוק תרגומי (TTFL) המווסתת גנים מבוקרי שעון ספציפיים לרקמות (CCGs)^4,5. מנגנון מולקולרי זה מייצר ריתמיות של כ-24 שעות באירועים תאיים ופיזיולוגיים, כגון ביטויי גנים, מסלולי איתות, תגובות חיסוניות ועיכול. השעון הצירקדי קיים כמעט בכל תאי היונקים, והוכח כי עד 50% מדפוסי הביטוי של הגנים מפגינים שעון ביולוגי⁶. בהתחשב בשפע של CCGs, שיבוש של מנגנון שעון זה עלול לגרום לבעיות פיזיולוגיות קריטיות. לפיכך, חקירות של מקצבים צירקדיים נחוצות כדי להבהיר מנגנונים ביולוגיים חיוניים ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות.

מערכת הכתבים Luciferase
במחקרים צירקדיים, ניטור בזמן אמת הוא קריטי להבנה טובה יותר של התנהגויות ותגובות תאיות מכיוון שהוא מאפשר מעקב אחר שינויים זמניים בביטוי גנים ו / או ברמות החלבון, ומספק תובנות לגבי המנגנונים המולקולריים המווסתים על ידי השעון הצירקדי. יתר על כן, ניטור בזמן אמת מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות של שינויים סביבתיים על מנגנונים מולקולריים ^7,8. ישנן טכניקות רבות למחקרי ניטור בזמן אמת, כולל בדיקת ביולומינסנציה, אשר נמצאת בשימוש נרחב כדי לעקוב אחר ביטוי גנים או רמות חלבון לאורך זמן. בדיקת ביולומינסנציה היא שיטה לזיהוי תהליכים ביולוגיים באמצעות ייצור אור כקריאה. בבדיקה זו, אנזים חמצוני המייצר ביולומינסנציה (למשל, לוציפראז) מועתק באופן זמני או יציב לתאים מעניינים, וקריאת הביולומינסנציה נמדדת בנוכחות מצע (למשל, לוציפרין) לאורך זמן. לדוגמה, האנזים luciferase מייצר bioluminescence על ידי חמצון המצע luciferin בנוכחות ATP⁹. בשל זמן מחצית החיים הקצר שלו, 3-4 שעות¹⁰, Firefly luciferase הוא כלי רב עוצמה למחקרים צירקדיים במונחים של מתן ניטור דינמי בזמן אמת עם רעש רקע מינימלי 11,12,13. עבור החדרת DNA עם מקדם מתויג luciferase או מסגרת קריאה פתוחה (ORF), מערכת העברת גנים lentiviral היא שיטה אמינה המספקת יעילות התמרה גבוהה, אינטגרציה יציבה, אימונוגניות נמוכה. התמרה יציבה של כתב ביולומינסנט מספקת ביטוי חזק בתאים מתחלקים ולא מתחלקים, ומייצרת נתונים עקביים עבור מחקרים צירקדיים¹⁴.

אורגנואיד כמודל
קווי תאים דו-ממדיים מסורתיים בני אלמוות סייעו במחקרים ביולוגיים, החל מחשיפת מנגנונים מולקולריים בסיסיים של מקצבים צירקדיים וכלה בבדיקת תרופות. למרות הנוחות של ניצול קווי תאים הומוגניים, הם חסרים מבנים רב-תאיים ואינטראקציות בין-תאיות. לעומת זאת, אורגנואידים הם מבנים "דמויי איברים" רב-תאיים במבחנה תלת-ממדית המחקים את מבנה האיברים בצלוחית על ידי הצגת דמיון לארכיטקטורה ורב-תאית של רקמות in vivo, כולל גזע, אב וסוגי תאים ממוינים^15,16. תכונות של ארגון עצמי, רב-תאיות ופונקציונליות הופכות את האורגנואידים למודל יוצא דופן במבחנה המייצג את התהליכים התאיים והפיזיולוגיים המתרחשים ברקמות אמיתיות¹⁷. ניתן להפיק סוגים שונים של אורגנואידים מתאי גזע פלוריפוטנטיים באמצעות התמיינות מכוונת או מתאי גזע בוגרים שנקצרו מאיברים שונים, כולל המעי הדק, המוח, הכבד, הריאות והכליות^18,19. מאחר שלמבנים אורגנואידים יש ארכיטקטורה אמיתית דמוית רקמה והם מתפקדים עם רב-תאיות ואינטראקציה דינמית בין תאים, הם עדיפים על קווי תאים הומוגניים להבנת האירועים התאיים המתרחשים ברקמות in vivo. אורגנואידים גם ניתנים למניפולציה בקלות וניתן לגדל אותם בתנאים מבוקרים, מה שהופך אותם לשימושיים למחקרים צירקדיים²⁰.

המטרה העיקרית של עבודה זו היא להציג שיטת ניטור בזמן אמת באמצעות בדיקת ביולומינסנציה המותאמת במיוחד לחקר מקצבים צירקדיים באורגנואידים תלת-ממדיים רב-תאיים. ניטור בזמן אמת של אירועים תאיים באמצעות טכניקת בדיקת ביולומינסנציה בוצע באופן נרחב עבור תרביות תאים חסרות את המורכבות הרב-תאית והתקשורת הבין-תאית הקיימת ברקמות אמיתיות. אורגנואידים תלת-ממדיים מציגים הזדמנויות ייחודיות לחקור את תפקודי המקצבים הצירקדיים במערכות רב-תאיות במבחנה. לדוגמה, אפשר לחקור מקצבים צירקדיים באורגנואידים עם הרכב תאים שונה או אורגנואידים שמקורם ברקמות החולות של החולים. פרוטוקול זה מאפשר שימוש בבדיקת ביולומינסנציה כדי לחקור היבטים שונים של מקצבים צירקדיים במודל מבחנה רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית, אורגנואידים, אשר יסייע לנו להבין טוב יותר את תפקידי המקצבים הצירקדיים באיברים היקפיים.

Protocol

כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות ליצירת HIEs אושרו על ידי IRB ב- CCHMC (IRB #2014-0427). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

הערה: כדי להמחיש את ההליך המתואר בפרוטוקול זה, השתמשנו באנטרואידים של המעי האנושי Bmal1-luc (HIEs). אנטרואידים אלה עברו התמרה לנטיויראלית יציבה²² עם פלסמיד כתב pABpuro-BluF, המכיל את מקדם Bmal1 מאוחה ללוציפראז, המראה את הפעילות של מקדם Bmal1 ²¹.

1. התמרה Lentiviral

1. בצע את ההתמרה הלנטיויראלית²² בתנאים מועשרים בתאי גזע עבור HIEs. באופן ספציפי, יש לוודא היווצרות ספרואידים ב-HIE תוך 3-4 ימים לאחר המעבר במצע גדילת המעי, מה שיוצר תנאים מועשרים בתאי גזע.
2. לאחר הטרנסדוקציה הלנטיויראלית²², בצע סלקציה אנטיביוטית עם 2 מיקרוגרם / מ"ל פורומיצין, לשחזר את HIE עמיד puromycin, ולהעביר אותם עם צפיפות גבוהה יחסית (כלומר, 1 באר לתוך 2 בארות) עבור 2-3x. אם קצב הגדילה של HIEs איטי, הוסף מעכבי ROCK של 10 מיקרומטר (Y-27632) ומעכב GSK-3 של 10 מיקרומטר (CHIR-99021) למדיום הגידול של אורגנואיד המעי.

2. הכנת אורגנואידים לבדיקת ביולומינסנציה

1. יום 1: מעבר לכלים עגולים בקוטר 35 מ"מ.
   1. בקצרה, להרחבת HIEs, ערבבו את ה-HIEs עם מטריצת תרבית תלת-ממדית מופחתת גורמי גדילה (GFR) וזרעו אותם על לוחות של 24 בארות עם שלוש טיפות של 10 μL של מטריצת תרבית תלת-ממדית לכל באר. מוסיפים 350 μL של מדיום הגידול HIE ומשנים אותו כל יומיים.
      הערה: צפיפות HIE במטריצת התרבית התלת-ממדית היא קריטית לצמיחת אנטרואידים. בערך, מספר הספרואידים צריך לעלות על יותר מ -50 בכל טיפה. אם המספר נמוך, קצב הצמיחה של HIE מושפע לרעה.
   2. כאשר HIEs גדלים מספיק (כ -7 ימים לאחר המעבר), לאסוף HIEs מארבע בארות לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.5 מ"ל.
   3. שטפו את ה-HIEs עם PBS הקר באמצעות מיני צנטריפוגה (2,000 × גרם) לסחרור מהיר של 40 שניות כדי להסיר פסולת ומטריצת תרבית תלת-ממדית מוגזמת על ידי פיפט.
   4. הוסף 0.5 מ"ל של PBS קר לתוך הגלולה ולהחיל מערבולות פיזיות על ידי מזרק עד 10x עם מזרק אינסולין 1 מ"ל כדי לנתק את HIEs.
   5. סובב את ה- HIE המנותקים עם מיני צנטריפוגה כמו בשלב 2.1.3 והסר בעדינות את הסופרנאטנט באמצעות פיפט. לאחר מכן, הניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה עם גלולת HIE על קרח כדי להתקרר למשך כ-3 דקות.
   6. הוסף מטריצת תרבית תלת ממדית GFR לצינור המיקרוצנטריפוגה וערבב אותה עם גלולת HIE.
      הערה: חשב את כמות מטריצת התרבית התלת-ממדית בהתבסס על מספר הכלים העגולים בקוטר 35 מ"מ שישמשו לניסוי. בדרך כלל אנו זורעים 30 μL של טיפות מטריצת תרבית תלת ממדית לכל מנה עגולה.
   7. זרעו את תערובת ה-HIE ואת מטריצת התרבית התלת-ממדית במרכז התבנית העגולה בקוטר 35 מ"מ ודגרו על המנה בטמפרטורה של 37°C למשך 20 דקות כדי לחזק את מטריצת התרבית התלת-ממדית.
      הערה: צפיפות הזריעה צריכה להיקבע באופן ניסיוני. בהתבסס על עוצמת הביולומינסנציה, ניתן לקבוע את מספר ה-HIE במהלך תהליך זה.
   8. מוסיפים 2 מ"ל של מצע גידול אורגנואיד מעיים שחומם מראש לכל מנה ודגרים על הכלים באינקובטור CO₂ עד לשלב הבא.
2. יום 3: התחלת בידול
   1. כדי ליזום בידול של HIEs, להסיר את מדיום הגידול ולהוסיף 2 מ"ל של מדיום בידול מחומם מראש.
      הערה: ראה טבלה 1 למתכונים של אמצעי הבידול HIE²³.
3. יום 4: אין צורך בתהליך נוסף.
4. יום 5: להחליף את המדיום של enteroids עם 2 מ"ל של מדיום התמיינות מחומם מראש.
5. יום 6: סנכרון שעון ורישום ביולומינסנציה
   1. כדי לסנכרן את השעון המולקולרי של אנטרואידים, הוסף 2 μL של 100 μM dexamethasone (Dex) כדי להפוך את הריכוז הסופי 100 ננומטר בכל צלחת ולאחר מכן לדגור את הכלים באינקובטור CO₂ (37 ° C, 5% CO₂) במשך 1 שעות²⁴.
   2. במהלך איפוס Dex, הכינו את לומנומטר הדגירה. בדוק את CO₂ ואת הטמפרטורה של לומנומטר הדגירה ולהגדיר 5% ו 37 ° C, בהתאמה.
      הערה: מומלץ לנגב את החלק הפנימי של לומנומטר הדגירה עם 70% אלכוהול לפני ואחרי כל שימוש במכונה כדי לשמור על סטריליות.
   3. לאחר סנכרון השעון, לחדש את enteroids עם 3 מ"ל של מדיום הבחנה מחומם מראש המכיל 200 מיקרומטר D-luciferin.
      הערה: מכיוון שלוציפרין רגיש לאור, יש לעטוף את המדיום המכיל לוציפרין בנייר כסף ולחמם אותו מראש באמבט חום של 37 מעלות צלזיוס לפני החלתו על המנה.
   4. מניחים את הכלים בשולחן כלים בן 8 בארות של הלומנומטר הדוגר ומכסים את שולחן הכלים לדוגמה במכסה. הניחו שני תאי אדים עם רקמה רטובה או ספוג על החלק העליון של שולחן הכלים לדוגמה. זהו תהליך חד פעמי.
      הערה: לאחר תחילת הניסוי, יש לשמור על מכסה הלומנומטר הדוגר סגור עד לסיום הניסוי. הקפידו להרטיב מספיק את הרקמות/ספוגים.
   5. סגור את מכסה המכונה והתחל את התוכנית למדידת ביולומינסנציה למספר הימים והרזולוציה הרצוי.
      1. בתוכנה, בחר את הגדרות התנאי על ידי לחיצה על הכרטיסייה תנאי והתאם את ההגדרות בחלונית זו: מספר מנות, זמן מדידה, עיבוד רקע וסוג סינון.
         הערה: עבור הדגמה זו, בחרנו את כל הכלים מ A עד H; זמן מדידה ברירת מחדל, אשר נקבע על ידי התוכנה בהתבסס על מספר המנות; זמן המתנה לעיבוד רקע, וסוג מסנן F0. מכיוון שיש שלוש אפשרויות סינון, ניתן למדוד שלושה צבעים זוהרים בו זמנית.
      2. לאחר הזנת כל ההגדרות המתאימות בהתבסס על הניסוי, שמור את ההגדרות בלחיצה על אישור.
      3. כדי להתחיל להפעיל את הניסוי, לחץ על הכרטיסיה הפעלה | לחצן התחל (סמל משולש ירוק). התבונן בנתונים כגולמיים, מסוננים לרעש או כלא מגמתיים על-ידי ביצוע בחירות מתאימות בחלק העליון של מסך התוכנה בעת הפעלת ניסויים. לחץ על הכרטיסיות Raw, Noise Filtered או Detrended כדי לצפות בנתונים שנבחרו.
      4. שימו לב לאותות עד 5 ימים.
         הערה: לאחר 5 ימים של ניטור בלומינומטר דגירה, אנטרואידים עלולים להתחיל למות עקב דלדול מדיה. כדי למנוע הפרעה צירקדית אפשרית במהלך הניסוי, איננו מבצעים שינוי מדיה למשך הניסוי.
      5. בסוף הניסוי, עצור את הריצה על-ידי לחיצה על לחצן עצור (סמל הריבוע הכחול), עבור אל הכרטיסיה קובץ ולחץ על שמירה בשם. שמור את הנתונים בפורמט Kronos; יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני במקטע קובץ על-ידי לחיצה על האפשרות קובץ ולאחר מכן בחירה באפשרות יצא כתבנית Excel תחת קובץ לניתוח נוסף.

תוצאות

רישום ביולומינסנציה נערך כדי להעריך את השעון הביולוגי של אנטרואידים במעי אנושי (HIEs) בשני תנאים נפרדים: תנאים מועשרים בתאי גזע באמצעות מדיום גידול אורגנואיד במעי (איור 3) לעומת תנאים מעוררי התמיינות, שהושגו על-ידי החלפת מדיום הגידול של אורגנואיד המעי במדיום התמיינות. ביום ה?...

Discussion

בדיקת Bioluminescence מציעה מספר יתרונות לחקר מקצבים צירקדיים, הדורשים איסוף נתונים מניסויי מסלול ארוכי טווח. ראשית, הוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר ביטוי הגן או החלבון המעניין בזמן שתאים נעים ומתרבים. מבלי לבצע התאמות מיותרות או לשבש את תפקודי התאים, ניתן לתעד אירועים תאיים מתעניינים או ביטוי גנים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor