АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Циркадные ритмы, существующие у большинства организмов, регулируют временную организацию биологических процессов. В последнее время 3D-органоиды стали физиологически актуальной моделью in vitro . Этот протокол описывает использование биолюминесцентных репортеров для наблюдения за циркадными ритмами в органоидах, что позволяет проводить исследования циркадных ритмов в многоклеточных системах in vitro .

Аннотация

Большинство живых организмов обладают циркадными ритмами, которые представляют собой биологические процессы, происходящие в течение примерно 24 часов и регулирующие разнообразный репертуар клеточных и физиологических процессов, начиная от циклов сна и бодрствования и заканчивая метаболизмом. Этот часовой механизм приводит в действие организм на основе изменений окружающей среды и координирует временную регуляцию молекулярных и физиологических событий. Ранее было продемонстрировано, что автономные циркадные ритмы поддерживаются даже на уровне отдельных клеток с использованием клеточных линий, таких как фибробласты NIH3T3, которые сыграли важную роль в раскрытии механизмов циркадных ритмов. Однако эти клеточные линии представляют собой гомогенные культуры, лишенные многоклеточности и устойчивых межклеточных коммуникаций. В последнее десятилетие была проведена обширная работа по разработке, характеристике и применению 3D-органоидов, которые представляют собой многоклеточные системы in vitro , напоминающие морфологические структуры и функции in vivo . В данной работе описан протокол детектирования циркадных ритмов с использованием биолюминесцентного репортера в кишечных энтероидах человека, что позволяет исследовать циркадные ритмы в многоклеточных системах in vitro.

Введение

Циркадные часы
Все организмы, от бактерий до млекопитающих, имеют сложные и динамичные отношения с окружающей средой. В рамках этой взаимосвязи адаптация к изменениям окружающей среды имеет решающее значение для выживания организмов. Большинство организмов обладают циркадными ритмами, которые позволяют им адаптироваться и оптимизировать свои функции к суточным циклам продолжительностью около 24 часов. Циркадные часы представляют собой иерархическую сеть центральных и периферических часов, которые работают в сотрудничестве для поддержания физиологического гомеостаза и синхронизации организмов с ежедневнымиизменениями. У млекопитающих центральные или главные часы, расположенные в супрахиазматическом ядре (СХЯ), получают внешние сигналы, такие как свет, и передают информацию периферическим часам посредством усовершенствованного взаимодействия нейронных и гуморальных сигнальныхпутей. В дополнение к центральным часам, периферические ткани обладают собственным клеточным автономным механизмом циркадных часов, поддерживаемым транскрипционно-трансляционной петлей отрицательной обратной связи (TTFL), регулирующей тканеспецифические гены, управляемые часами (CCG)4,5. Этот молекулярный механизм обеспечивает примерно 24-часовую ритмичность в клеточных и физиологических событиях, таких как экспрессия генов, сигнальные пути, иммунные реакции и пищеварение. Циркадные часы присутствуют почти во всех клетках млекопитающих, и было продемонстрировано, что до 50% паттернов экспрессии генов демонстрируют циркаднуюритмичность. Учитывая обилие ККИ, нарушение этого часового механизма может привести к критическим физиологическим проблемам. Следовательно, исследования циркадных ритмов необходимы для выяснения основных биологических механизмов и разработки новых терапевтических стратегий.

Репортерная система с люциферазой
В циркадных исследованиях мониторинг в режиме реального времени имеет решающее значение для лучшего понимания клеточного поведения и реакций, поскольку он позволяет отслеживать временные изменения в экспрессии генов и/или уровнях белка, обеспечивая понимание молекулярных механизмов, регулируемых циркадными часами. Кроме того, мониторинг в режиме реального времени позволяет исследователям изучать влияние изменений окружающей среды на молекулярные механизмы 7,8. Существует множество методов мониторинга в режиме реального времени, в том числе биолюминесцентный анализ, который широко используется для отслеживания экспрессии генов или уровней белка с течением времени. Биолюминесцентный анализ — это метод обнаружения биологических процессов с использованием светового излучения в качестве считывания. В этом анализе окислительный фермент, вызывающий биолюминесценцию (например, люцифераза), либо временно или стабильно трансфицируется в клетки, представляющие интерес, и показания биолюминесценции измеряются в присутствии субстрата (например, люциферина) с течением времени. Например, фермент люцифераза производит биолюминесценцию путем окисления субстрата люциферина в присутствии АТФ9. Благодаря короткому периоду полураспада, 3-4 ч10, люцифераза светлячков является мощным инструментом для исследований циркадных ритмов с точки зрения обеспечения динамического мониторинга в реальном времени с минимальным фоновым шумом 11,12,13. Для вставки ДНК с помощью промотора, меченного люциферазой, или открытой рамки считывания (ORF), система доставки генов лентивирусной инфекции является надежным методом, обеспечивающим высокую эффективность трансдукции, стабильную интеграцию и низкую иммуногенность. Стабильная трансдукция биолюминесцентного репортера обеспечивает устойчивую экспрессию в делящихся и неделящихся клетках, генерируя согласованные данные для циркадных исследований14.

Органоид как модель
Традиционные иммортализированные двумерные клеточные линии сыграли важную роль в биологических исследованиях, начиная от раскрытия фундаментальных молекулярных механизмов циркадных ритмов и заканчивая скринингом лекарств. Несмотря на удобство использования гомогенизированных клеточных линий, в них отсутствуют многоклеточные структуры и межклеточные взаимодействия. В отличие от них, органоиды представляют собой in vitro 3D многоклеточные «органоподобные» структуры, которые имитируют структуру органа в чашке, демонстрируя сходство с архитектурой тканей in vivo и многоклеточными, включая стволовые, прогениторные и дифференцированные типы клеток15,16. Обладая способностью к самоорганизации, многоклеточности и функциональностью, органоиды являются замечательной моделью in vitro, представляющей клеточные и физиологические процессы, происходящие в реальных тканях. Различные типы органоидов могут быть получены из плюрипотентных стволовых клеток путем направленной дифференцировки или из взрослых стволовых клеток, собранных из различных органов, включая тонкую кишку, мозг, печень, легкие и почки18,19. Поскольку органоидные структуры обладают реальной тканеподобной архитектурой и функционируют с многоклеточностью и динамическим межклеточным взаимодействием, они превосходят гомогенизированные клеточные линии для понимания клеточных событий, происходящих в тканях in vivo. Органоидами также легко манипулировать и их можно выращивать в контролируемых условиях, что делает их полезными для исследований циркадных ритмов.

Основной целью данной работы является внедрение метода мониторинга в реальном времени с использованием биолюминесцентного анализа, специально предназначенного для изучения циркадных ритмов в многоклеточных 3D-органоидах. Мониторинг клеточных событий в режиме реального времени с использованием метода биолюминесцентного анализа широко применяется для клеточных культур, в которых отсутствует многоклеточная сложность и межклеточные коммуникации, которые существуют в реальных тканях. 3D органоиды предоставляют уникальные возможности для исследования функций циркадных ритмов в многоклеточных системах in vitro. Например, можно исследовать циркадные ритмы в органоидах с измененным клеточным составом или органоидах, полученных из пораженных тканей пациентов. Этот протокол позволяет использовать биолюминесцентный анализ для исследования различных аспектов циркадных ритмов в более физиологически значимой модели in vitro , органоидах, что поможет нам лучше понять роль циркадных ритмов в периферических органах.

протокол

Все эксперименты с использованием человеческих тканей для создания HIE были одобрены IRB в CCHMC (IRB#2014-0427). Подробные сведения обо всех материалах, используемых в этом протоколе, см. в Таблице материалов .

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проиллюстрировать процедуру, описанную в этом протоколе, мы использовали кишечные энтероиды Bmal1-luc человека (HIEs). Эти энтероиды подвергались стабильной лентивирусной трансдукции22 с репортерной плазмидой pABpuro-BluF, которая содержит промотор Bmal1, слитый с люциферазой, демонстрируя активность промотора 21 Bmal1.

1. Лентивирусная трансдукция

  1. Проводят лентивирусную трансдукцию22 в условиях, обогащенных стволовыми клетками, для ГИЭ. В частности, обеспечить образование сфероидов в ГИЭ в течение 3-4 дней после прохождения в питательной среде кишечника, что создает условия, обогащенные стволовыми клетками.
  2. После лентивирусной трансдукции22 проводят селекцию антибиотика с 2 мкг/мл пуромицина, восстанавливают пуромицин-резистентные ГИЭ и пропускают их с относительно высокой плотностью (т.е. 1 лунку в 2 лунки) в 2-3 раза. Если скорость роста HIE медленная, добавьте 10 μM ингибиторов ROCK (Y-27632) и 10 μM ингибитора GSK-3 (CHIR-99021) в кишечную органоидную среду для роста.

2. Подготовка органоидов для биолюминесцентного анализа

  1. День 1: Переход ГИЭ к 35 мм круглым тарелкам.
    1. Вкратце, для расширения HIE смешайте HIE с 3D-матрицей культуры с пониженным фактором роста (GFR) и засейте их на 24-луночные планшеты с тремя каплями по 10 мкл 3D-матрицы культуры на лунку. Добавьте 350 мкл питательной среды HIE и меняйте ее через день.
      Примечание: Плотность HIE в 3D-культуральной матрице имеет решающее значение для роста энтероидов. Ориентировочно количество сфероидов должно превышать более 50 в каждой капле. Если число низкое, это негативно сказывается на темпах роста ГИЭ.
    2. Когда HIE достаточно вырастут (примерно через 7 дней после пассажа), соберите HIE из четырех лунок в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
    3. Промойте HIE холодной PBS с помощью настольной мини-центрифуги (2 000 × г) в течение 40 секунд для быстрого отжима для удаления мусора и излишков 3D-матрицы культуры с помощью пипетки.
    4. Добавьте 0,5 мл холодного PBS в гранулу и примените физическую турбулентность путем спринцевания до 10 раз инсулиновым шприцем объемом 1 мл для диссоциации HIEs.
    5. Раскрутите диссоциированные ГИЭ с помощью настольной мини-центрифуги, как показано в шаге 2.1.3, и аккуратно удалите надосадочную жидкость с помощью пипета. Затем поместите микроцентрифужную пробирку с гранулой HIE на лед, чтобы она остыла примерно на 3 минуты.
    6. Добавьте культуральную матрицу GFR 3D в микроцентрифужную пробирку и смешайте ее с гранулой HIE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитайте количество 3D-матрицы культуры на основе количества круглых чашек диаметром 35 мм, которые будут использоваться для эксперимента. Обычно мы засеваем 30 μл капель 3D матрицы культуры на круглую чашку.
    7. Засейте смесь HIE и 3D-матрицы культуры в центре круглой чашки диаметром 35 мм и инкубируйте чашку при 37 °C в течение 20 минут для затвердевания матрицы 3D-культуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность посева HIE должна быть определена экспериментально. Основываясь на интенсивности биолюминесценции, можно определить количество ГИЭ в ходе этого процесса.
    8. Добавьте 2 мл предварительно подогретой кишечной органоидной среды для роста в каждое блюдо и инкубируйте блюда в инкубаторе сСО2 до следующего этапа.
  2. День 3: Начало дифференциации
    1. Чтобы начать дифференцировку HIEs, удалите питательную среду и добавьте 2 мл предварительно подогретой среды для дифференцировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 приведены рецепты дифференцировочных средHIE 23.
  3. День 4: Никакой дополнительной процедуры не требуется.
  4. День 5: Замените среду энтероидов 2 мл предварительно подогретой дифференцировочной среды.
  5. День 6: Синхронизация часов и запись биолюминесценции
    1. Чтобы синхронизировать молекулярные часы энтероидов, добавьте 2 мкл 100 мкМ дексаметазона (Dex), чтобы получить конечную концентрацию 100 нМ в каждой чашке, а затем инкубируйте чашки в инкубаторе сCO2 (37 °C, 5%CO2) в течение 1 ч24.
    2. Во время сброса Dex подготовьте инкубационный люминометрик. ПроверьтеCO2 и температуру инкубационного люминометра и установите значение 5% и 37 °C соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется протирать внутреннюю часть инкубационного люминометра 70% спиртом до и после каждого использования машины, чтобы сохранить его стерильным.
    3. После синхронизации часов восполните энтероиды 3 мл предварительно подогретой дифференцировочной среды, содержащей 200 мкМ D-люциферина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку люциферин светочувствителен, содержащую люциферин среду следует обернуть фольгой и предварительно разогреть в тепловой бане при температуре 37 °C перед нанесением на блюдо.
    4. Поместите посуду в 8-луночный стол с инкубационным люминометром и накройте стол с образцом блюд его крышкой. Поместите две увлажняющие камеры с влажной салфеткой или губкой на верхнюю часть стола для образцов. Это разовый процесс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После начала эксперимента крышку инкубационного люминометра следует держать закрытой до тех пор, пока эксперимент не будет завершен. Убедитесь, что салфетки/губки достаточно смочились.
    5. Закройте крышку аппарата и запустите программу измерения биолюминесценции за нужное количество дней и разрешение.
      1. В программном обеспечении выберите настройки состояния, нажав на вкладку Условие , и настройте параметры на этой панели: количество блюд, время измерения, фоновую обработку и тип фильтра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой демонстрации мы выбрали все блюда от А до Н; время измерения по умолчанию, которое определяется программным обеспечением на основе количества блюд; время ожидания фоновой обработки и фильтр типа F0. Поскольку существует три варианта фильтров, можно одновременно измерять три люминесцентных цвета.
      2. После ввода всех подходящих настроек на основе эксперимента сохраните настройки, нажав OK.
      3. Чтобы начать выполнение эксперимента, перейдите на вкладку Выполнить | Кнопка «Пуск » (значок зеленого треугольника). Наблюдайте за данными как необработанные, отфильтрованные по шуму или удаленные из тренда, делая соответствующие выборки в верхней части экрана программного обеспечения во время проведения экспериментов. Нажмите на вкладки «Сырое», «Фильтрация по шуму» или «Без тренда », чтобы просмотреть выбранные данные.
      4. Наблюдайте за сигналами до 5 дней.
        Примечание: После 5 дней наблюдения в инкубационном люминометре энтероиды могут начать умирать из-за истощения среды. Чтобы предотвратить возможные нарушения циркадных ритмов во время эксперимента, мы не производим смену среды на протяжении всего эксперимента.
      5. В конце эксперимента остановите выполнение, нажав кнопку «Стоп » (значок синего квадрата), перейдите на вкладку «Файл » и нажмите «Сохранить как». Сохраните данные в формате Kronos; экспортируйте данные в электронную таблицу в разделе Файл , нажав на опцию Файл , а затем выбрав Экспорт в формате Excel в разделе Файл для дальнейшего анализа.

Результаты

Биолюминесцентная регистрация проводилась для оценки циркадной ритмичности кишечных энтероидов человека (ГИЭ) в двух различных условиях: условиях, обогащенных стволовыми клетками с использованием кишечной органоидной питательной среды (рис. 3), и условиях, индуцирующ?...

Обсуждение

Биолюминесцентный анализ имеет ряд преимуществ для исследования циркадных ритмов, что требует сбора данных в ходе долгосрочных экспериментов. Во-первых, это позволяет исследователям отслеживать экспрессию генов или белка, представляющих интерес, по мере движения и пролиферации клет?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Кишечные энтероиды человека были получены из лаборатории доктора Майкла Хелмрата в Медицинском центре детской больницы Цинциннати (CCHMC). Эта работа была поддержана R01 DK11005 (CIH) и пилотным финансированием Онкологического центра Университета Цинциннати. Мы благодарны за поддержку в области визуализации от Центра живой микроскопии Университета Цинциннати (NIH S10OD030402).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
35 x 10 Falcon tissue culture dishesFisher Scientific08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin SyringesFisher Scientific14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122GSK-3 inhibitor
DexamethasoneSigma AldrichD4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)Cayman Chemical14681
Gastrin I HumanSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
Growth Factor reduced (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stemcell Technologies06010Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer MachineATTO CorporationAB-2550
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF reporter plasmidAddgene46824
PBS without Calcium and MagnesiumCorning21-040-CV
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Recombinant murine EGFPeproTech315-09
Y-27632R&D Systems1254/10ROCK inhibitor

Ссылки

  1. Cox, K. H., Takahashi, J. S. Circadian clock genes and the transcriptional architecture of the clock mechanism. J Mol Endocrinol. 63 (4), R93-R102 (2019).
  2. Ayyar, V. S., Sukumaran, S. Circadian rhythms: Influence on physiology, pharmacology, and therapeutic interventions. J Pharmacokinet Pharmacodyn. 48 (3), 321-338 (2021).
  3. Reppert, S., Weaver, D. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  4. Takahashi, J. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nat Rev Genet. 18 (3), 164-179 (2017).
  5. Wolff, C. A., et al. Defining the age-dependent and tissue-specific circadian transcriptome in male mice. Cell Rep. 42 (1), 111982 (2023).
  6. Ruben, M. D., et al. A database of tissue-specific rhythmically expressed human genes has potential applications in circadian medicine. Science Trans Med. 10 (458), 8806 (2018).
  7. Huang, S., Lu, Q., Choi, M. H., Zhang, X., Kim, J. Y. Applying real-time monitoring of circadian oscillations in adult mouse brain slices to study communications between brain regions. STAR Protoc. 2 (2), 100416 (2021).
  8. Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnol. 10 (3), (2010).
  9. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1030 (2003).
  10. Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), 590-598 (2000).
  11. Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring cell-autonomous circadian clock rhythms of gene expression using luciferase bioluminescence reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
  12. Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
  13. Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
  14. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1 (1), 241-245 (2006).
  15. Lee, S., Hong, C. I. Organoids as model systems to investigate circadian clock-related diseases and treatments. Front Genet. 13, 874288 (2022).
  16. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  17. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. J Mol Med. 95 (7), 729-738 (2017).
  18. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  19. Rosselot, A. E., et al. Ontogeny and function of the circadian clock in intestinal organoids. EMBO J. 41 (2), 106973 (2021).
  20. Corrò, C., Novellasdemut, L., Li, V. S. W. A brief history of organoids. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (1), C151-C165 (2020).
  21. Brown, S. A., et al. The period length of fibroblast circadian gene expression varies widely among human individuals. PLos Biol. 3 (10), e338 (2005).
  22. Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L. M., Montenegro-Miranda, P. S., Vanden Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. J Vis Exp. (98), e52531 (2015).
  23. Criss, Z. K., et al. Drivers of transcriptional variance in human intestinal epithelial organoids. Physiol Genomics. 53 (11), 486-508 (2021).
  24. Izumo, M., Sato, T. R., Straume, M., Johnson, C. H. Quantitative analyses of circadian gene expression in mammalian cell cultures. PLoS Comput Biol. 2 (10), e136 (2006).
  25. Hara-Miyauchi, C., et al. Bioluminescent system for dynamic imaging of cell and animal behavior. Biochem Biophys Res Commun. 419 (2), 188-193 (2012).
  26. Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
  27. Xu, P., Elizalde, M., Masclee, A., Pierik, M., Jonkers, D. Corticosteroid enhances epithelial barrier function in intestinal organoids derived from patients with Chron's disease. J Mol Med (Berl). 99 (6), 805-815 (2021).
  28. AlMusawi, S., Ahmed, M., Nateri, A. S. Understanding cell-cell communication and signaling in the colorectal cancer microenvironment. Clin Transll Med. 11 (2), 308 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vitroNIH3T33D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены