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요약

대부분의 유기체에 존재하는 일주기 리듬은 생물학적 과정의 시간적 조직을 조절합니다. 3D 오가노이드는 최근 생리학적으로 유의미한 in vitro 모델로 부상했습니다. 이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 오가노이드의 일주기 리듬을 관찰하는 방법을 설명하며, 이를 통해 다세포 시스템의 일주기 리듬에 대한 체외 조사를 가능하게 합니다.

초록

대부분의 살아있는 유기체는 약 24 시간의 기간 내에 발생하는 생물학적 과정 인 일주기 리듬을 가지고 있으며 수면-각성주기에서 신진 대사에 이르기까지 세포 및 생리적 과정의 다양한 레퍼토리를 조절합니다. 이 시계 메커니즘은 환경 변화에 따라 유기체를 동반하고 분자 및 생리적 사건의 시간적 조절을 조정합니다. 이전에는 NIH3T3 섬유아세포와 같은 세포주를 사용하여 단일 세포 수준에서도 자율적인 일주기 리듬이 유지된다는 것이 입증되었으며, 이는 일주기 리듬의 메커니즘을 밝히는 데 중요한 역할을 했습니다. 그러나 이러한 세포주는 다세포성(multicellularity)과 강력한 세포 간 통신(intercellular communication)이 결여된 균질한 배양물입니다. 지난 10년 동안 생체 내 형태학적 구조 및 기능을 유사한 체외 다세포 시스템인 3D 오가노이드의 개발, 특성화 및 적용에 대한 광범위한 작업이 수행되었습니다. 이 논문은 인간의 장 장류에서 생물 발광 리포터를 사용하여 일주기 리듬을 감지하는 프로토콜을 설명하며, 이를 통해 시험관 내 다세포 시스템의 일주기 리듬을 조사할 수 있습니다.

서문

생체 시계
박테리아에서 포유류에 이르기까지 모든 유기체는 환경과 복잡하고 역동적인 관계를 맺고 있습니다. 이러한 관계 내에서 환경 변화에 대한 적응은 유기체의 생존에 매우 중요합니다. 대부분의 유기체는 약 24시간의 일주기 주기에 적응하고 기능을 최적화 할 수있는 일주기 리듬을 가지고 있습니다. 생체 시계는 생리적 항상성을 유지하고 유기체가 일상적인 변화에 동기화되도록 협력하는 중앙 및 주변 시계의 계층적 네트워크입니다 1,2. 포유류의 경우, 시상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에 위치한 중심시계(central clock) 또는 주시계(master clock)는 빛과 같은 외부 신호를 수신하고, 신경 및 체액성 신호전달 경로(neural and humoral signaling pathways)의 고급 상호작용을 통해 정보를 주변시계(peripheral clocks)로 전송한다3. 중앙 시계 외에도 주변 조직은 조직 특이적 시계 제어 유전자(CCG)를 조절하는 전사-번역 음성 피드백 루프(TTFL)에 의해 유지되는 자체 세포 자율 일주기 시계 메커니즘을 가지고 있습니다4,5. 이 분자 기계는 유전자 발현, 신호 전달 경로, 면역 반응 및 소화와 같은 세포 및 생리적 이벤트에서 약 24시간의 리듬을 생성합니다. 생체 시계는 거의 모든 포유류 세포에 존재하며, 유전자 발현 패턴의 최대 50%가 생체 리듬을 나타내는 것으로 입증되었습니다6. CCG의 풍부함을 고려할 때, 이 clock 메커니즘의 중단은 심각한 생리학적 문제를 초래할 수 있습니다. 따라서 일주기 리듬에 대한 연구는 필수 생물학적 메커니즘을 밝히고 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 필요합니다.

루시페라아제 리포터 시스템
생체 주기 연구에서 실시간 모니터링은 유전자 발현 및/또는 단백질 수준의 시간적 변화를 추적하고 생체 시계에 의해 조절되는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하기 때문에 세포 행동과 반응을 더 잘 이해하는 데 매우 중요합니다. 또한 실시간 모니터링을 통해 연구자들은 환경 변화가 분자 메커니즘에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다 7,8. 시간 경과에 따른 유전자 발현 또는 단백질 수준을 추적하는 데 널리 사용되는 생물 발광 분석을 포함하여 실시간 모니터링 연구를 위한 다양한 기술이 있습니다. 생물 발광 분석은 광 생성을 판독값으로 사용하여 생물학적 과정을 검출하는 방법입니다. 이 분석에서는 생물 발광(예: 루시페라아제)을 생성하는 산화 효소(예: 루시페라아제)를 관심 세포에 일시적 또는 안정적으로 transfection하고, 생체 발광 판독값은 시간 경과에 따른 기질(예: 루시페린)의 존재 하에 측정됩니다. 예를 들어, 루시페라아제 효소는 ATP9의 존재 하에서 기질 루시페린을 산화시킴으로써 생물 발광을 생성합니다. 반감기가 3-4 h10으로 짧기 때문에 반딧불이 루시페라아제는 배경 소음을 최소화하면서 실시간 동적 모니터링을 제공한다는 점에서 일주기 연구를 위한 강력한 도구입니다 11,12,13. 루시페라아제 태그 프로모터 또는 ORF(Open Reading Frame)를 이용한 DNA 삽입의 경우, 렌티바이러스 유전자 전달 시스템은 높은 transduction efficacy, stable integration 및 low immunogenicity를 제공하는 신뢰할 수 있는 방법입니다. 생물 발광 리포터의 안정적인 transduction은 분열하는 세포와 분열하지 않는 세포에서 강력한 발현을 제공하여 일주기 연구를 위한 일관된 데이터를 생성합니다14.

모델로서의 오가노이드
기존의 불멸화된 2차원 세포주는 일주기 리듬의 기본 분자 메커니즘을 밝히는 것부터 약물 스크리닝에 이르기까지 생물학 연구에서 중요한 역할을 해왔습니다. 균질화된 세포주를 활용하는 편리함에도 불구하고 다세포 구조와 세포 간 상호 작용이 부족합니다. 대조적으로, 오가노이드는 in vivo 조직 구조 및 줄기, 전구 세포 및 분화된 세포 유형15,16을 포함한 다세포성과 유사성을 보임으로써 접시의 장기 구조를 모방하는 in vitro 3D 다세포 "장기 유사" 구조입니다. 자기 조직화(self-organization), 다세포성(multicellularity) 및 기능적 특징을 가진 오가노이드는 실제 조직에서 발생하는 세포 및 생리적 과정을 나타내는 주목할 만한 시험관 모델(in vitro model)이 되었다17. 지시 분화를 통해 만능 줄기 세포에서 다양한 유형의 오가노이드를 유도하거나 소장, 뇌, 간, 폐 및 신장을 포함한 다양한 장기에서 채취한 성체 줄기 세포를 유도할 수 있습니다18,19. 오가노이드 구조는 다세포성 및 동적 세포 간 상호 작용을 통해 실제 조직과 같은 구조와 기능을 가지고 있기 때문에 생체 내 조직에서 발생하는 세포 이벤트를 이해하는 데 균질화된 세포주보다 우수합니다. 오가노이드는 또한 쉽게 조작할 수 있고 통제된 조건에서 성장할 수 있어 일주기 연구에 유용하다20.

이 연구의 주요 목적은 다세포 3D 오가노이드의 일주기 리듬을 연구하기 위해 특별히 맞춤화된 생물 발광 분석을 활용하는 실시간 모니터링 방법을 소개하는 것입니다. 생물 발광 분석 기법을 사용한 세포 이벤트의 실시간 모니터링은 실제 조직에 존재하는 다세포 복잡성 및 세포 간 통신이 부족한 세포 배양에 대해 널리 수행되었습니다. 3D 오가노이드는 in vitro에서 다세포 시스템에서 일주기 리듬의 기능을 조사할 수 있는 고유한 기회를 제공합니다. 예를 들어, 세포 조성이 변경된 오가노이드 또는 환자의 병든 조직에서 유래한 오가노이드의 일주기 리듬을 조사할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하면 생물 발광 분석을 사용하여 생리학적으로 더 관련성이 높은 체외 모델인 오가노이드에서 일주기 리듬의 다양한 측면을 조사할 수 있으며, 이는 말초 장기에서 일주기 리듬의 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

HIE 생성을 위해 인체 조직을 이용한 모든 실험은 CCHMC의 IRB에 의해 승인되었다(IRB#2014-0427). 이 프로토콜에 사용된 모든 재료와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

참고: 이 프로토콜에 설명된 절차를 설명하기 위해 Bmal1-luc 인간 장 장내골(HIE)을 사용했습니다. 이들 엔테로이드는 루시페라아제에 융합된 Bmal1 프로모터를 함유하는 pABpuro-BluF 리포터 플라스미드로 안정적인 렌티바이러스 형질주입(22 )을 거쳤으며, 이는 Bmal1 프로모터(21)의 활성을 보여주었다.

1. 렌티바이러스 형질도입

  1. HIE에 대한 줄기 세포가 풍부한 조건에서 렌티바이러스 transduction22 를 수행합니다. 특히, 장 성장 배지를 통과한 후 3-4일 이내에 HIE에서 스페로이드가 형성되도록 하여 줄기 세포가 풍부한 조건을 만듭니다.
  2. 렌티바이러스 transduction22 후, 2μg/mL puromycin으로 항생제 선별을 수행하고, puromycin-resistant HIEs를 회수하고, 상대적으로 높은 밀도로(즉, 1웰을 2웰로) 2-3배 동안 통과시킵니다. HIE의 성장 속도가 느린 경우 10μM ROCK 억제제(Y-27632)와 10μM GSK-3 억제제(CHIR-99021)를 장내 오가노이드 성장 배지에 추가합니다.

2. 생물발광 분석을 위한 오가노이드 준비

  1. 1일차: 35mm 원형 접시로 통과합니다.
    1. 간단히 말해서, HIE의 확장을 위해 HIE를 GFR(growth factor-reduced) 3D 배양 매트릭스와 혼합하고 웰당 10μL의 3D 배양 매트릭스 3방울이 있는 24웰 플레이트에 파종합니다. HIE 성장 배지 350μL를 추가하고 격일로 교체합니다.
      참고: 3D 배양 매트릭스에서 HIE의 밀도는 엔테로이드의 성장에 매우 중요합니다. 대략적으로 스페로이드의 수는 각 방울에서 50개 이상을 초과해야 합니다. 숫자가 낮으면 HIE의 성장률에 부정적인 영향을 미칩니다.
    2. HIE가 충분히 성장하면(통과 후 약 7일 후) 4개의 웰에서 HIE를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 수집합니다.
    3. 벤치탑 미니 원심분리기(2,000× g)를 사용하여 40초 동안 빠르게 회전하여 피펫으로 이물질과 과도한 3D 배양 매트릭스를 제거하기 위해 차가운 PBS로 HIE를 세척합니다.
    4. 0.5mL의 차가운 PBS를 펠릿에 넣고 1mL 인슐린 주사기로 최대 10배까지 주사하여 물리적 난류를 가하여 HIE를 해리합니다.
    5. 2.1.3단계에서와 같이 탁상용 미니 원심분리기로 해리된 HIE를 회전시키고 피펫으로 상층액을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 HIE 펠릿이 있는 미세 원심분리기 튜브를 얼음 위에 올려 약 3분 동안 식힙니다.
    6. GFR 3D 배양 매트릭스를 마이크로 원심분리기 튜브에 추가하고 HIE 펠릿과 혼합합니다.
      참고: 실험에 사용될 35mm 원형 접시의 수를 기준으로 3D 배양 매트릭스의 양을 계산합니다. 일반적으로 원형 접시당 30μL의 3D 배양 매트릭스 방울을 파종합니다.
    7. HIE와 3D 배양 매트릭스의 혼합물을 35mm 원형 접시 중앙에 파종하고 37°C에서 20분 동안 접시를 배양하여 3D 배양 매트릭스를 응고시킵니다.
      참고: 시딩 HIE의 밀도는 실험적으로 결정해야 합니다. 생물 발광의 강도에 따라 이 과정에서 HIE의 수를 결정할 수 있습니다.
    8. 각 접시에 미리 예열된 장 오가노이드 성장 배지 2mL를 추가하고 다음 단계까지 CO2 인큐베이터에서 접시를 배양합니다.
  2. 3일차: 차별화의 시작
    1. HIE의 분화를 시작하려면 성장 배지를 제거하고 2mL의 예열된 분화 배지를 추가합니다.
      참고: HIE 분화 매체1의 조리법은 표 23을 참조하십시오.
  3. 4일차: 추가 절차가 필요하지 않습니다.
  4. 5일차: 장내 배지를 2mL의 예열된 분화 배지로 교체합니다.
  5. 6일차: 시계 동기화 및 생물 발광 기록
    1. 엔테로이드의 분자 시계를 동기화하려면 2μL의 100μM 덱사메타손(Dex)을 첨가하여 각 접시에 최종 농도를 100nM로 만든 다음 CO2 인큐베이터(37 °C, 5% CO2)에서 1시간24분 동안 접시를 배양합니다.
    2. Dex 재설정 중에 배양 광도계를 준비합니다. 배양 광도계의 CO2 와 온도를 확인하고 각각 5% 및 37°C로 설정합니다.
      알림: 기계를 사용할 때마다 배양 광도계 내부를 70% 알코올로 닦아 멸균 상태를 유지하는 것이 좋습니다.
    3. clock synchronization 후 200μM D-luciferin을 함유한 3mL의 예열된 분화 배지로 장류를 보충합니다.
      참고: 루시페린은 빛에 민감하기 때문에 루시페린 함유 매체는 호일로 싸서 접시에 바르기 전에 37°C 열탕에서 예열해야 합니다.
    4. 배양 광도계의 8웰 접시 테이블에 접시를 놓고 샘플 접시 테이블을 뚜껑으로 덮습니다. 젖은 티슈나 스폰지가 있는 두 개의 가습기 챔버를 샘플 접시 테이블 위에 놓습니다. 이것은 일회성 프로세스입니다.
      알림: 실험이 시작된 후에는 실험이 종료될 때까지 배양 광도계의 뚜껑을 닫아 두어야 합니다. 티슈/스폰지를 충분히 적셔야 합니다.
    5. 기계의 뚜껑을 닫고 원하는 일수와 해상도 동안 생물 발광을 측정하는 프로그램을 시작합니다.
      1. 소프트웨어에서 조건 탭을 클릭하여 조건 설정을 선택하고 이 패널에서 접시 수, 측정 시간, 백그라운드 처리 및 필터 유형과 같은 설정을 조정합니다.
        참고: 이 데모를 위해 A에서 H까지의 모든 요리를 선택했습니다 . 기본 측정 시간은 접시 수에 따라 소프트웨어에 의해 결정됩니다. 백그라운드 처리를 위한 대기 시간 및 필터 유형 F0. 세 가지 필터 옵션이 있기 때문에 세 가지 발광 색상을 동시에 측정할 수 있습니다.
      2. 실험에 따라 적합한 설정을 모두 입력한 후 확인을 클릭하여 설정을 저장합니다.
      3. 실험 실행을 시작하려면 실행 탭 | 시작 버튼(녹색 삼각형 아이콘). 실험을 실행하는 동안 소프트웨어 화면 상단에서 적절한 선택을 하여 데이터를 원시, 노이즈 필터링 또는 추세 제거로 관찰합니다. Raw, Noise Filtered 또는 Detrended 탭을 클릭하여 선택한 데이터를 관찰합니다.
      4. 최대 5일 동안 신호를 관찰합니다.
        참고: 배양 광도계에서 5일 동안 모니터링한 후 장내염부는 매체 고갈로 인해 죽기 시작할 수 있습니다. 실험 중 발생할 수 있는 일주기 교란을 방지하기 위해 실험 기간 동안 매체 교체를 수행하지 않습니다.
      5. 실험이 끝나면 중지 단추(파란색 사각형 아이콘)를 클릭하여 실행을 중지하고 파일 탭으로 이동한 다음 다른 이름으로 저장을 클릭합니다. 데이터를 크로노스 형식으로 저장합니다. 파일 옵션을 클릭하여 파일 섹션의 스프레드시트로 내보낸 다음 추가 분석을 위해 파일 아래에서 Excel 형식으로 내보내기를 선택합니다.

결과

생물 발광 기록은 장 오가노이드 성장 배지를 사용한 줄기 세포 농축 조건(그림 3)과 장 오가노이드 성장 배지를 분화 배지로 대체하여 달성된 분화 유도 조건의 두 가지 뚜렷한 조건에서 인간 장 장내(HIE)의 일주기 리듬을 평가하기 위해 수행되었습니다. 실험 당일, 우리는 100nM 덱사메타손(Dexamethasone)으로 1시간 치료를 수행하여 생체 시계를 동기화했습니다. 그 후, 배지를 3m...

토론

생물 발광 분석은 일주기 리듬 조사에 몇 가지 이점을 제공하며, 이를 위해서는 장기 과정 실험에서 데이터를 수집해야 합니다. 첫째, 연구자는 세포가 이동하고 증식함에 따라 관심 유전자 발현 또는 단백질을 모니터링할 수 있습니다. 불필요한 조정을 하거나 세포의 기능을 방해하지 않고 신뢰할 수 있는 실시간 데이터를 제공하는 생물 발광 판독을 사용하여 관심 있는 세포 이벤트나 유전자 발...

공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

인간 장 장내염은 신시내티 아동 병원 의료 센터(CCHMC)의 마이클 헬름라스 박사의 실험실에서 획득했습니다. 이 연구는 R01 DK11005(CIH)와 University of Cincinnati Cancer Center Pilot Funding의 지원을 받았습니다. University of Cincinnati Live Microscopy Core(NIH S10OD030402)의 이미징 지원에 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
35 x 10 Falcon tissue culture dishesFisher Scientific08-772A
A 83-01Sigma AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-028
B-27 Supplement (50x)Gibco17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin SyringesFisher Scientific14-829-1BbMfrn: BD 329424
CHIR99021Cayman Chemical13122GSK-3 inhibitor
DexamethasoneSigma AldrichD4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)Cayman Chemical14681
Gastrin I HumanSigma AldrichG9020
GlutaMAXGibco35050061
Growth Factor reduced (GFR) MatrigelCorningCB-40230C
HEPESGibco15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)Stemcell Technologies06010Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer MachineATTO CorporationAB-2550
N-2 Supplement (100x)Gibco17502-048
N-Acetyl-L-cysteineSigma AldrichA9165
pABpuro-BluF reporter plasmidAddgene46824
PBS without Calcium and MagnesiumCorning21-040-CV
Penicillin-StreptomycinGibco15140122
Recombinant murine EGFPeproTech315-09
Y-27632R&D Systems1254/10ROCK inhibitor

참고문헌

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