Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تم تطوير بروتوكول محسن لمقايسة تعبئة الكالسيوم مع الخلايا البطانية ، وتستخدم لتحديد روابط المستقبلات المنشطة للبروتياز (PARs). يقلل البروتوكول الجديد من إجمالي وقت الفحص بمقدار 90-120 دقيقة وينتج منحنيات استجابة تركيز قابلة للتكرار.

Abstract

تتم مراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم في الخلايا بسرعة بطريقة عالية الإنتاجية باستخدام الأصباغ داخل الخلايا والفلورسنت وملزمة الكالسيوم وأدوات التصوير التي يمكنها قياس انبعاثات الفلورسنت من ما يصل إلى 1536 بئرا في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن هذه الأدوات أغلى بكثير ويمكن أن يكون من الصعب الحفاظ عليها مقارنة بقارئات اللوحات المتاحة على نطاق واسع والتي تمسح الآبار بشكل فردي. الموصوف هنا هو اختبار محسن لقارئ الألواح للاستخدام مع خط الخلايا البطانية (EA.hy926) لقياس التنشيط المدفوع بمستقبلات تنشيط البروتياز (PAR) لإشارات Gαq وتعبئة الكالسيوم اللاحقة باستخدام صبغة ربط الكالسيوم Fluo-4. تم استخدام هذا الاختبار لتوصيف مجموعة من روابط PAR ، بما في ذلك روابط "البارمودولين" المضادة للالتهابات التي تستهدف PAR1 والتي تم تحديدها في مختبر Dockendorff. يغني هذا البروتوكول عن الحاجة إلى معالج سوائل آلي ويسمح بفحص متوسط الإنتاجية لروابط PAR في لوحات 96 بئرا ويجب أن يكون قابلا للتطبيق على دراسة المستقبلات الأخرى التي تبدأ تعبئة الكالسيوم.

Introduction

المستقبلات المنشطة بالبروتياز (PARs)1،2،3 هي فصيلة فرعية من مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين من الفئة A G (GPCRs) التي يتم التعبير عنها في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الصفائح الدموية والخلايا البطانية4،5،6،7. على عكس غالبية GPCRs ، فإن PARs لها طريقة تنشيط فريدة داخل الجزيئات. يتم تنشيط معظم GPCRs عن طريق الروابط القابلة للذوبان التي تتفاعل مع جيب ربط مميز ، ولكن يتم تنشيط PARs عن طريق الانقسام المحلل للبروتين في N-terminus ، مما ينتج عنه رابط مربوط جديد يمكن أن يتفاعل مع مجال الحلقة 2 خارج الخلية على سطح الخلية6،8،9. ينشط هذا التفاعل المستقبل ويمكنه بدء العديد من مسارات الإشارات ، مما يعزز التأثيرات مثل الالتهاب وتنشيط الصفائح الدموية4،10،11،12. يمكن للبروتياز المختلفة تنشيط PARs من خلال الانقسام في مواقع فريدة على N-terminus ، مما يكشف عن روابط مربوطة مختلفة (TL) تعمل على استقرار توافقات المستقبلات ، والتي تبدأ مسارات إشارات مختلفة9،13،14،15. على سبيل المثال ، في العضو الأكثر دراسة جيدا في الفصيلة الفرعية ، PAR1 ، يتم استخدام الانقسام بواسطة الثرومبين لدعم العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك تنشيط الصفائح الدموية وتجنيد الكريات البيض إلى البطانة ، ولكن يمكن أن يؤدي إلى آثار ضارة عندما يتم التعبير عن المستقبل بشكل مفرط أو مفرطالنشاط 4،16،17،18،19،20،21. على العكس من ذلك ، يمكن أن يؤدي الانقسام بواسطة البروتين المنشط C (aPC) إلى تعزيز التأثيرات المضادة للالتهابات والحفاظ على الحواجز البطانية15،22،23،24،25،26،27،28،29. يمكن أيضا تنشيط PARs عن طريق نظائر الببتيد في TLs بطريقة بين الجزيئات13،30،31. تستخدم هذه الببتيدات بشكل روتيني لقياس تثبيط (تعديل) PAR بدلا من البروتياز الذي يستهدف PAR ، ويتم استخدامها في هذا البروتوكول.

ترتبط العديد من الاضطرابات بإشارات PAR1 المرضية ، بما في ذلك الإنتان22،32 ، وأمراض القلب والأوعية الدموية33،34،35،36،37،38 ، وأمراض الكلى39،40،41،42 ، ومرض فقر الدم المنجلي43 ، والتليف44 ، وهشاشة العظام وهشاشة العظام45، 46 ، التنكس العصبي47،48،49،50،51 ، والسرطان52،53،54،55،56،57،58،59. تمت دراسة مضادات PAR1 منذ تسعينيات القرن العشرين كعوامل مضادة للصفيحات لأمراض القلب والأوعية الدموية ، والقائمة المتزايدة من الأمراض المرتبطة بالمستقبل تستلزم تحديد روابط جديدة لاستخدامها كتحقيقات بيولوجية (مركبات أداة) أو كعلاجات محتملة. حاليا ، لا يوجد سوى مضاد PAR1 واحد معتمد من إدارة الغذاء والدواء ، vorapaxar ، والذي يستخدم لعلاج مرض الشريان التاجي في المرضى المعرضين لمخاطر عالية34،36،37،60. أكمل مضاد بديل ل PAR1 ، pepducin PZ-128 ، دراسة المرحلة الثانية الناجحة لمنع تجلط الدم في مرضى قسطرة القلب38. ركزت مجموعة Dockendorff على الكيمياء الطبية وعلم الأدوية لفئة منفصلة من الجزيئات الصغيرة ، روابط PAR1 المعروفة باسم parmodulins61,62. على عكس مضادات PAR1 المبلغ عنها مثل vorapaxar ، فإن البارمودولين عبارة عن معدلات متحيزة ومتحيزة ل PAR1 تمنع بشكل انتقائي مسار Gαq مع تعزيز التأثيرات الواقية للخلايا المشابهة ل aPC. على عكس مضادات PAR1 التقويمية القوية مثل vorapaxar ، فإن البارمودولين المنشور يمكن عكسه أيضا63،64،65.

في البداية ، تم تحديد البارمودولين من قبل Flaumenhaft وزملائه في العمل لقدرتهم على تثبيط تعبير P-selectin أو إفراز الحبيبات في الصفائح الدموية61,66. ومع ذلك ، كانت هناك حاجة إلى طريقة بديلة لدراسة آثار البارمودولين على الخلايا البطانية. تتمثل إحدى الطرق الشائعة لمراقبة الإشارات المتعلقة ب GPCR في قياس تعبئة Ca2+ داخل الخلايا ، وهو رسول ثانوي مهم يمكن قياسه باستخدام صبغة مناسبة ملزمة للكالسيوم داخل الخلايا67,68. تم تقديم أدلة جوهرية تبين أن تعبئة الكالسيوم التي يسببها PAR1 تتم من خلال تنشيط Gαq69,70. بمجرد تنشيطه بواسطة ليجند مربوط (أو ليجند خارجي مناسب) ، يخضع PAR1 لتغيير توافقي يؤدي إلى استبدال ثنائي فوسفات الجوانوزين (GDP) المرتبط بالوحدة الفرعية Gαq بثلاثي فوسفات جوانوزين (GTP)68. تقوم الوحدة الفرعية Gαq بعد ذلك بتنشيط فوسفوليباز Cβ (PLC-β) ، والذي يحفز التحلل المائي للفوسفاتيديلينوسيتول 4,5 ثنائي الفوسفات (PIP2) ، مكونا 1,4,5-إينوسيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) ودياسيلجليسرول (DAG). أخيرا ، يرتبط IP3 بقنوات Ca2+ الحساسة ل IP3 في غشاء الشبكة الإندوبلازمية ، مما يسمح بإطلاق Ca2+ في السيتوبلازم ، حيث يمكن أن يرتبط بالأصباغ الفلورية المعتمدة على Ca2+ ، مثل Fluo-4 ، التي تضاف إلى الخلايا71. تحدث هذه العملية في غضون ثوان ويمكن أن تزيد من تركيز الكالسيوم2+ 100 ضعف ، مما يؤدي إلى تغيير جذري في كمية الصبغة المرتبطة بالكالسيوم وإشارة مضان قوية.

في عام 2018 ، كشفت مجموعة Dockendorff عن اختبار تعبئة Ca2+ متوسط الإنتاجية يمكن استخدامه لتحديد خصوم مسار Gαq ل PAR172. استخدم الفحص EA.hy92673 ، وهو خط خلية بطانية بشرية هجينة ، والذي يمكن استخدامه لمقاطع متعددة دون تغيير ملحوظ في تعبير PAR1 ، ويتم إنشاؤه للقياسات المختبرية للتأثيرات الواقية للخلايا.

استخدم البروتوكول الأصلي خلايا EA.hy926 في 96 لوحة بئر ومحملة بصبغة Fluo-4 / AM ، والتي تم اختيارها بسبب مضانها الشديد عند 488 نانومتر ونفاذية الخلايا العالية. بمجرد تحميل الصبغة في الخلايا ، تم إجراء خطوات غسيل طويلة باستخدام معالج سائل آلي من 8 قنوات (لم يكن من الممكن الوصول إلى طرق أسرع للتعامل مع السوائل ، مثل غسالة 96 قناة). كانت قابلية استنساخ هذا الفحص متفوقة على ذلك دون تغييرات الوسائط الروبوتية الآلية الدقيقة. ثم تم تحضين المضادات بالخلايا ، وتم تنشيط PAR1 من خلال الإضافة المتسلسلة لناهض انتقائي (16 بئرا في المرة الواحدة) ، وتم قياس التغيرات في التألق الناتجة عن تعبئة الكالسيوم وربط الصبغة لتحديد النشاط.

في حين أن هذا البروتوكول يسمح بقياس تعبئة الكالسيوم بوساطة PAR1 ، إلا أنه محدود بالوقت اللازم لفحص كل لوحة 96 بئرا. تعتبر أوقات التجربة الطويلة مشكلة ليس فقط لأن عدد المركبات التي يمكن فحصها كل يوم محدود ، ولكن أيضا لأن تدفق الصبغة يحدث بمرور الوقت ، مما يضيق نافذة الفحص عن طريق زيادة التألق القاعدي. أحد المساهمين في وقت التجربة الطويل هو استخدام معالج سائل من 8 قنوات لغسل الألواح ، مما يضيف أكثر من 30 دقيقة لكل تجربة. كما أصبح من الصعب الحصول على النصائح المطلوبة بسبب مشاكل سلسلة التوريد. هنا تم الإبلاغ عن بروتوكول محدث لمقايسة تعبئة الكالسيوم بوساطة PAR والتي لا تتطلب معالج سائل ، وبالتالي يمكن تشغيلها في إنتاجية أعلى. يجب أن يكون هذا البروتوكول مناسبا أيضا لقياس الإشارات مع GPCRs الأخرى التي تؤدي إلى تعبئة الكالسيوم داخل الخلايا. يعد بروتوكول قارئ الألواح المحدث هذا مثاليا للمختبرات الأكاديمية والصناعية الصغيرة التي لا تملك الموارد اللازمة لأدوات تصوير الخلايا باهظة الثمن ولكنها تحتاج إلى فحص العديد من المركبات بسرعة. للحصول على مثال على مقايسة تعبئة الكالسيوم باستخدام جهاز تصوير اللوحة ، انظر Caers et al.74.

Protocol

يتم إجراء جميع عمليات التبادل / الإضافات الإعلامية التي تتم في الخطوتين 1 و 2 من البروتوكول التالي في غطاء معقم. ما لم يذكر خلاف ذلك ، يجب شراء جميع الأواني البلاستيكية المستخدمة في غطاء المحرك المعقم معقمة ومختومة أو معقمة بشكل مناسب عبر الأوتوكلاف.

1. بدء خط الخلية EA.hy926

  1. الحصول على خلايا EA.hy926.
  2. قم بتخزين قارورة (قوارير) الخلايا في مرحلة بخار خزان النيتروجين السائل.
  3. قم بإعداد وسط DMEM الكامل عن طريق تسخين DMEM و FBS والقلم / البكتيريا (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل محددة) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. أضف 50 مل من FBS و 1 مل من القلم / البكتيريا إلى 500 مل من DMEM. امزج المحلول برفق عن طريق الانقلاب.
    ملاحظة: يؤدي الخلط بقوة شديدة إلى وجود كميات زائدة من الفقاعات.
  4. أخرج قارورة واحدة من الخلايا من النيتروجين السائل وقم بتسخينها في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. تعقيم قارورة الخلايا وزجاجة DMEM متوسطة كاملة عن طريق الرش بالكحول ، ثم الانتقال إلى غطاء محرك السيارة المعقم.
  6. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لنقل الخلايا بعناية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. أضف 1 مل من DMEM إلى القارورة لشطفها وإضافتها إلى أنبوب الطرد المركزي.
  7. اصنع كرية من الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي (150 × جم ، 5 دقائق ، 22 درجة مئوية). إزالة الوسيط من أنبوب الطرد المركزي عن طريق الشفط ؛ احرص على عدم إزعاج بيليه الخلية.
  8. أضف 3 مل من الوسط الكامل DMEM إلى أنبوب الطرد المركزي وقم بتفكيك الحبيبات برفق عن طريق خلط تعليق الخلية باستخدام ماصة 1,000 ميكرولتر.
    ملاحظة: يجب تجنب التسبب في الفقاعات عن طريق الاختلاط بقوة شديدة لأن ذلك قد ينشط الخلايا أو يتلفها.
  9. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة مع أطراف 20 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر. أضف 10 ميكرولتر من خليط تعليق الخلية / التريبان الأزرق إلى مقياس الدم وعد الخلايا.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي استخدام أطراف ماصة 0.1-10 ميكرولتر إلى قص الخلايا. لا ينبغي استخدام نصائح بهذا الحجم أثناء التعامل مع تعليق الخلية.
  10. أضف وسط DMEM الكامل إلى تعليق الخلية لعمل كثافة 66000 خلية / مل باستخدام ماصة مصلية 10 أو 25 مل. ماصة 15 مل من تعليق الخلية في قارورة (قوارير) ثقافة T-75. تأكد من التشتت المتساوي لتعليق الخلية عن طريق تحريك القارورة من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب.
  11. احتضان الخلايا حتى تصل إلى نقطة التقاء (عادة بعد 4-6 أيام) ، كما هو مقدر عن طريق الفحص تحت المجهر. في هذه المرحلة ، استخدم الخلايا في التجربة (بدءا من القسم 2) أو قم بزرعها في قوارير جديدة للتوسع لإعداد المخزونات المجمدة (بكثافة بذر موصى بها تبلغ 1,000,000 خلية في 15 مل من الوسط الكامل لكل قارورة T-75).
    ملاحظة: يمكن زراعة الخلايا في قوارير الثقافة لمدة تصل إلى 3 أسابيع دون اختلاف ملحوظ في الشكل أو الصحة أو الأداء في الفحص. يجب استبدال الوسيط الكامل كل 3-4 أيام.

2. إضافة خلايا EA.hy926 إلى 96 لوحة بئر

ملاحظة: يمكن استخدام خلايا من قارورة ثقافة T-75 متقاربة واحدة لإعداد لوحين أو ثلاثة ألواح فحص أو توسيعها اختياريا إلى ما يصل إلى 15 قارورة T-75 جديدة. يمكن فحص خمس لوحات فحص على الأقل باستخدام البروتوكول في القسمين 4 و 5 في يوم العمل العادي. تصف التعليمات التالية إعداد واختبار لوحة فحص واحدة ، ولكن يمكن تحضير لوحات إضافية بتكرار الخطوات 2.2 و 2.7 و 2.12 و 3.2 لإعداد العدد المطلوب من لوحات الفحص. الأكثر شيوعا ، يتم إعداد أربع لوحات فحص يوميا لقياس استجابات التركيز مع ما يصل إلى 16 مركبا ، الأمر الذي يتطلب قارورتين من T-75 مع خلايا متقاربة.

  1. دافئ DMEM وسط كامل في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. تعقيم زجاجة DMEM وسط كامل عن طريق رشها بالكحول ، ثم نقلها إلى غطاء معقم.
  2. أضف 100 ميكرولتر من محلول جيلاتين معقم بنسبة 0.4٪ إلى جميع آبار صفيحة ذات جدران سوداء و 96 بئرا وذات قاع شفاف مع غطاء. احتضان اللوحة بمحلول الجيلاتين في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 30 دقيقة.
  3. تأكد من أن الخلايا الموجودة في قارورة ثقافة T-75 متقاربة بنسبة 80-100٪ باستخدام مجهر مقلوب. قم بإزالة الوسط الكامل DMEM من قارورة T-75 عن طريق الشفط.
  4. اغسل الخلايا في القارورة باستخدام 10 مل من برنامج تلفزيوني وحرك القارورة برفق من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب. قم بإزالة PBS من القارورة عن طريق الشفط.
  5. أضف 5 مل من محلول تفكك الخلايا إلى القارورة واحتضان القارورة في حاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة ~ 12 دقيقة. اضغط على القارورة بعد 6 دقائق للمساعدة في تسهيل الانفصال.
    ملاحظة: يؤدي احتضان الخلايا لمدة تزيد عن 15 دقيقة باستخدام عامل تفكك الخلايا المشار إليه إلى بدء الخلايا في التكتل معا ، مما يجعل الحصول على عدد دقيق للخلايا أكثر صعوبة وقد يتداخل مع الفحص.
  6. أضف 5 مل من وسط DMEM الكامل المسخن مسبقا إلى القارورة واخلطه برفق في محلول تفكك الخلية / تعليق الخلية. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، أضف تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل. اصنع كرية من الخلايا باستخدام جهاز طرد مركزي (150 × جم ، 5 دقائق ، 22 درجة مئوية).
  7. أثناء تشكيل الحبيبات ، قم بإزالة محلول الجيلاتين من لوحة 96 بئرا عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور متصلة بالفراغ. قم بإزالة غطاء اللوحة من وقت إزالة الجيلاتين حتى يصبح المحلول جاهزا للطلاء.
    ملاحظة: يمكن اختياريا استخدام ماصة متعددة القنوات أو مشعب معقم متصل بالفراغ.
  8. قم بإزالة الوسط من أنبوب الطرد المركزي عن طريق الشفط باستخدام ماصة باستور متصلة بفراغ أو ماصة مصلية ؛ احرص على عدم إزعاج بيليه الخلية.
  9. أضف وسط DMEM الكامل الطازج إلى أنبوب الطرد المركزي باستخدام ماصة مصلية سعة 5 أو 10 مل. قم بتفتيت حبيبات الخلية برفق عن طريق خلط الوسط الكامل DMEM مع ماصة 1,000 ميكرولتر أو ماصة مصلية سعة 5 مل.
    ملاحظة: عادة ما يتم استخدام ثمانية ملليلتر من DMEM ، ولكن يمكن إضافة كميات أكبر لتسهيل عد الخلايا.
  10. امزج 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق في أنبوب طرد مركزي دقيق باستخدام ماصة مع أطراف 20 ميكرولتر أو 200 ميكرولتر. أضف 10 ميكرولتر من خليط تعليق الخلية / التريبان الأزرق إلى مقياس الدم وعد الخلايا.
  11. أضف وسائط DMEM الكاملة إلى تعليق الخلية لعمل كثافة 600000 خلية / مل باستخدام ماصة مصلية 10 أو 25 مل. سيعطي هذا كثافة نهائية تبلغ 60000 خلية / بئر في صفيحة 96 بئرا (يتم تحديدها لتكون الكثافة المثلى عن طريق التجربة).
    ملاحظة: ستنتج زراعة الخلايا الناجحة الطبيعية ما بين 12,000,000 و 15,000,000 خلية ، والتي يمكن أن تزرع صفيحتين إلى ثلاث صفيحتين من 96 بئرا.
  12. امزج تعليق الخلية عن طريق قلب أنبوب الطرد المركزي برفق وإضافته إلى خزان ماصة متعدد القنوات سعة 50 مل. خلط التعليق في الخزان كل 30 ثانية عن طريق هز الخزان برفق من جانب إلى آخر ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات. استبدل غطاء اللوحة الشفاف وهز اللوحة برفق عن طريق تحريكها على سطح الغطاء المعقم من الشمال إلى الجنوب ومن الشرق إلى الغرب لضمان التوزيع المتساوي للخلايا. احتضان اللوحة في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2) لمدة 16-24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن استخدام تعليق خلية إضافي لإعداد لوحات إضافية ، أو يمكن تكرار الخطوات 1.10-1.11 لمواصلة خط الخلية.

3. إعداد مقايسة تعبئة الكالسيوم

  1. إعداد الكواشف فحص.
    1. تحضير محلول البروبينسيد (250 مللي متر ، مائي) عن طريق إضافة 36 ملغ من البروبينسيد إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإذابته في 0.6 M NaOH (500 ميكرولتر). دوامة الحل.
      ملاحظة: يحسن Probenecid الاحتفاظ بالصبغة في الخلية عن طريق تثبيط ناقلات الأيونات العضوية75،76،77.
    2. لعمل مخزن مؤقت لمقايسة HBSS-HEPES ، أضف HEPES (1.19 جم) إلى زجاجة سعة 500 مل من HBSS الخالي من الكالسيوم / المغنيسيوم / الفينول الأحمر (صنع محلول 10 مللي متر من HEPES). استكمل المخزن المؤقت ب MgCl2 (محلول مائي 1 متر ، 500 ميكرولتر) و CaCl2 (محلول مائي 1 متر ، 500 ميكرولتر). امزج المحلول واحفظه في الثلاجة على حرارة 5 درجات مئوية عندما لا يكون قيد الاستعمال.
      1. لكل لوحة 96 بئرا ، أضف 50 مل من المخزن المؤقت لفحص HBSS-HEPES إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، واستكمل ب 500 ميكرولتر من محلول البروبينسيد ، واخلطه جيدا. قم بتسخين المخزن المؤقت إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
    3. اصنع محلول Pluronic F-127 بنسبة 10٪ في DMSO عن طريق إضافة Pluronic F-127 (20 مجم) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق أو قارورة HPLC وحلها باستخدام 200 ميكرولتر من DMSO.
      ملاحظة: يمكن تخزين هذا المحلول في درجة حرارة الغرفة وهو كاف لحوالي 30 لوحة. يذوب Pluronic F-127 ببطء شديد في درجة حرارة الغرفة ويجب تسخينه برفق لتسهيل الذوبان.
    4. قم بإعداد المخزن المؤقت لتحميل الصبغة عن طريق إضافة 24 ميكرولتر من DMSO أولا إلى قنينة من Fluo-4 / AM (50 ميكروغرام) لإذابة الصبغة. في أنبوب طرد مركزي ملفوف بورق الألمنيوم سعة 15 مل ، أضف 6 مل من محلول فحص HBSS-HEPES وتكملة مع 6 ميكرولتر من 10٪ Pluronic F-127 و 6 ميكرولتر من محلول Fluo-4 / AM. دوامة الحل لفترة وجيزة والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة ، بعيدا عن الضوء ، لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: لمنع التبييض الضوئي ل Fluo-4 ، احتفظ بالصبغة بعيدا عن الضوء عن طريق لف رقائق الألومنيوم حول أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على محلول الصبغة وغطاء لوحة الفحص.
  2. تحضير لوحات الفحص.
    1. قم بإزالة لوحة الفحص من الحاضنة وتأكيد الالتقاء باستخدام مجهر مقلوب. قم بإزالة وسائط DMEM الكاملة يدويا عن طريق تحريكها في الحوض وتنشيف الجزء العلوي من اللوحة بمنشفة ورقية.
      ملاحظة: تتم إزالة الوسط بشكل كاف عن طريق إمساك اللوحة أفقيا وتحريكها ، متبوعا بتدوير اللوحة 180 درجة والتكرار.
    2. أضف محلول فحص HBSS-HEPES بالإضافة إلى محلول البروبينسيد إلى خزان مذيب ماصة متعدد القنوات سعة 50 مل.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذا المحلول لخطوات الغسيل اللاحقة ويجب وضعه جانبا وتغطيته بورق الألمنيوم لحين الحاجة.
    3. أضف 100 ميكرولتر من محلول فحص HBSS-HEPES بالإضافة إلى محلول البروبينسيد إلى كل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات واترك الخلايا تجلس في وجود البروبينسيد لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المخزن المؤقت لمقايسة HBSS-HEPES عن طريق النقر في الحوض بنفس الطريقة كما في الخطوة 3.2.1.
    4. أضف مخزن مؤقت لتحميل الصبغة إلى خزان مذيب ماصة منفصل متعدد القنوات سعة 50 مل. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل الصبغة إلى كل بئر من لوحة الفحص باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضان الطبق لمدة 45 دقيقة (37 درجة مئوية ، 5٪ CO2).
    5. أثناء وجود اللوحة في الحاضنة ، قم بإعداد المحاليل الناهضة / المضادة.
      1. يتم تخزين حلول الخصوم كحلول 31.6 mM في DMSO. في أنبوب PCR ، قم بتخفيف 2 ميكرولتر من محلول المخزون ب 38 ميكرولتر من 0.1٪ BSA / ماء للحصول على محلول 1.58 mM. 2 ميكرولتر من هذا المحلول سيعطي تركيزا نهائيا يبلغ 31.6 ميكرومتر في لوحة الفحص. قم بتخفيف 4 ميكرولتر من محلول مضاد 1.58 mM مع 36 ميكرولتر من 5٪ DMSO / ماء (بدون إضافة BSA) ، وقم بإعداد التركيزات المتبقية من خلال التخفيفات التسلسلية.
      2. قم بإعداد محلول 108.3 ميكرومتر (16.7x) من TFLLRN-NH2 في مخزن مقايسة HBSS-HEPES ، والذي سيعطي تركيزا نهائيا يبلغ 6.5 ميكرومتر عند إضافة 6 ميكرولتر إلى كل بئر من لوحة الفحص. على سبيل المثال ، قم بإذابة حصة 2 ملغ من TFLLRN-NH2 مع 5.244 مل من المخزن المؤقت لفحص HBSS-HEPES لإعطاء محلول مخزون 0.5 مللي متر. امزج 1.083 مل من هذا المحلول مع 3.917 مل من المخزن المؤقت لفحص HBSS-HEPES لإعطاء محلول 108.3 ميكرومتر.
        ملاحظة: يجب تخزين محاليل TFLLRN-NH2 في مجمد -20 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستخدام.
    6. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وتأكد من امتصاص الصبغة باستخدام مجهر مضان في مكان مناسب (عادة لبروتين الفلورسنت الأخضر ، انظر الشكل 1 للحصول على مثال على Fluo-4 الذي تم تحميله بنجاح في الخلايا). قم بإزالة المخزن المؤقت لتحميل الصبغة عن طريق تحريك اللوحة بنفس طريقة الخطوة 3.2.1.
    7. اغسل الخلايا 2x ب 50 ميكرولتر من محلول فحص HBSS-HEPES بالإضافة إلى محلول البروبينسيد (من الخطوة 3.2.3) في كل بئر (قم بإزالته عن طريق تحريك الوسط في الحوض).
    8. أضف 92 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمقايسة HBSS-HEPES إلى كل بئر واعرض الخلايا مرة أخرى باستخدام مجهر مضان لضمان إزالة الصبغة الزائدة بالكامل ، وأن الخلايا تظل ملتصقة.
    9. استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 2 ميكرولتر من المحاليل المضادة والمركبة إلى الآبار المناسبة (انظر الجدول 1 للحصول على خريطة لوحة تمثيلية).

4. إجراء مقايسة تعبئة الكالسيوم

  1. اضبط قارئ اللوحة على النحو التالي: درجة الحرارة: 37 درجة مئوية ؛ الطول الموجي للإثارة: 485 نانومتر ؛ الطول الموجي للانبعاث: 525 نانومتر ؛ ارتفاع القياس: 7.8 مم (محسن) ؛ عدد الومضات: 100 ؛ عدد التكرارات: 20.
  2. احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة في قارئ الأطباق على حرارة 37 درجة مئوية. قم بقياس مضان الخلفية في العمودين 1 و 2 (خمس عمليات مسح لكل بئر).
  3. أخرج اللوحة من قارئ اللوحة وأضف بسرعة 6 ميكرولتر من محلول ناهض إلى كل بئر في العمودين 1 و 2 من شريط PCR مكون من 8 أنابيب باستخدام ماصة متعددة القنوات.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، نستخدم ماصة إلكترونية ذات 8 قنوات مع أطراف ماصة 0.1-10 ميكرولتر.
  4. قم بقياس التغير في التألق حيث يحدث تحرك الكالسيوم في الخلايا. قم بإجراء 20 عملية مسح لكل بئر وفقا للإعدادات أعلاه.
    ملاحظة: يستغرق مسح كل بئر في عمودين 20x لكل منهما حوالي 5 دقائق (أي ~ 15 ثانية بين عمليات المسح لكل بئر).
  5. كرر الخطوات من 4.2 إلى 4.4 للأعمدة من 3 إلى 12 بزيادات عمودين.

5. تحليل البيانات

  1. تصدير البيانات من الفحص كجداول بيانات منفصلة لكل مجموعة من عمودين.
  2. أوجد متوسط قراءات التألق القاعدي باستخدام الدالة AVG (المسح الأول: المسح الأخير). افعل ذلك لكل بئر في كلا العمودين.
  3. أوجد الحد الأقصى للتألق بعد إضافة ناهض باستخدام الدالة MAX (الفحص الأول: المسح الأخير).
  4. احسب التغير في التألق عن طريق طرح التألق القاعدي من الحد الأقصى للتألق.
  5. اطرح التغير في التألق المحسوب للتحكم السلبي (إضافة مركبة بدون ناهض) من كل بئر في نفس العمود.
  6. أوجد التغير النسبي (الطبيعي) في التألق بقسمة التغير في التألق في كل بئر على التغير في التألق في السيارة (0.1٪ DMSO / ماء) + 6.5 ميكرومتر TFLLRN-NH2 بئر.
  7. انسخ القيم غير التحكم، كنسب مئوية، إلى برنامج الإحصاء والرسوم البيانية. إذا كنت تستخدم البرنامج المشار إليه ، فاختر خيار الجدول XY ، مع اختيار الأرقام كمحور X وتكرار القيم في أعمدة فرعية جنبا إلى جنب كمحور ص.
  8. استخدم البرنامج لرسم منحنيات التركيز والاستجابة (CRCs) من البيانات. في حالة استخدام البرنامج المشار إليه ، اختر خيار السجل (المانع) مقابل الاستجابة - المنحدر المتغير (أربعة معلمات).

النتائج

الغرض من هذا الفحص بشكل عام هو إنتاج منحنيات التركيز والاستجابة (CRCs) لثلاثة إلى أربعة بارمودولين جديد. في كل لوحة فحص ، غالبا ما يتم إنشاء CRC إضافي لمركب معروف ، مثل NRD-21 ، والذي يعمل كفحص جودة للتجربة بسبب IC50 المعروف. لإنشاء CRCs ، يجب تخطيط خريطة لوحة مثل تلك الموضحة في...

Discussion

في حين أن البروتوكول72 الذي تم الإبلاغ عنه سابقا كان موثوقا به بشكل عام وسمح لنا بتحديد بارمودولين رئيسي جديد ، NRD-21,62 كان مطلوبا بروتوكول أكثر كفاءة. تم اختراق الفحص بشكل أكبر خلال نقص العرض الناجم عن جائحة COVID-19. أصبح الحصول على نصائح لمعالج السو?...

Disclosures

C.D. هو مخترع براءات الاختراع التي تنطوي على البرومودولين وهو مؤسس ومساهم في شركة Function Therapeutics، Inc. ، التي تقوم بتطوير البارمودولين للاستخدام السريري.

Acknowledgements

نشكر إيرين هيرنانديز وترودي هوليست والدكتور هارتموت ويلر (معهد فيرسيتي لأبحاث الدم) والدكتور ليجي أرنولد (جامعة ويسكونسن - ميلووكي) على توفير المساحة والدعم غير المباشر لهذا المشروع ، والدكتور جون ماكورفي (كلية الطب في ويسكونسن) على المشورة ذات الصلة. نشكر المعهد الوطني للقلب والرئة والدم (R15HL127636) ، ووزارة الدفاع الأمريكية (W81XWH22101) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (2223225) على دعم المنح.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

References

  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4 (2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582 (2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -. M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597 (2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062 (2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124 (2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100 (2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -. A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23 (2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516 (2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Fluo 4 PAR G EA hy926 PAR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved