توصيف معدلات المستقبلات المنشطة بالبروتياز باستخدام مقايسة تعبئة الكالسيوم باستخدام قارئ الألواح

Summary

تم تطوير بروتوكول محسن لمقايسة تعبئة الكالسيوم مع الخلايا البطانية ، وتستخدم لتحديد روابط المستقبلات المنشطة للبروتياز (PARs). يقلل البروتوكول الجديد من إجمالي وقت الفحص بمقدار 90-120 دقيقة وينتج منحنيات استجابة تركيز قابلة للتكرار.

Abstract

تتم مراقبة التغيرات في تركيز الكالسيوم في الخلايا بسرعة بطريقة عالية الإنتاجية باستخدام الأصباغ داخل الخلايا والفلورسنت وملزمة الكالسيوم وأدوات التصوير التي يمكنها قياس انبعاثات الفلورسنت من ما يصل إلى 1536 بئرا في وقت واحد. ومع ذلك ، فإن هذه الأدوات أغلى بكثير ويمكن أن يكون من الصعب الحفاظ عليها مقارنة بقارئات اللوحات المتاحة على نطاق واسع والتي تمسح الآبار بشكل فردي. الموصوف هنا هو اختبار محسن لقارئ الألواح للاستخدام مع خط الخلايا البطانية (EA.hy926) لقياس التنشيط المدفوع بمستقبلات تنشيط البروتياز (PAR) لإشارات G_αq وتعبئة الكالسيوم اللاحقة باستخدام صبغة ربط الكالسيوم Fluo-4. تم استخدام هذا الاختبار لتوصيف مجموعة من روابط PAR ، بما في ذلك روابط "البارمودولين" المضادة للالتهابات التي تستهدف PAR1 والتي تم تحديدها في مختبر Dockendorff. يغني هذا البروتوكول عن الحاجة إلى معالج سوائل آلي ويسمح بفحص متوسط الإنتاجية لروابط PAR في لوحات 96 بئرا ويجب أن يكون قابلا للتطبيق على دراسة المستقبلات الأخرى التي تبدأ تعبئة الكالسيوم.

Introduction

المستقبلات المنشطة بالبروتياز (PARs)^1،2،3 هي فصيلة فرعية من مستقبلات البروتين المقترنة بالبروتين من الفئة A G (GPCRs) التي يتم التعبير عنها في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الصفائح الدموية والخلايا البطانية^4،5،6،7. على عكس غالبية GPCRs ، فإن PARs لها طريقة تنشيط فريدة داخل الجزيئات. يتم تنشيط معظم GPCRs عن طريق الروابط القابلة للذوبان التي تتفاعل مع جيب ربط مميز ، ولكن يتم تنشيط PARs عن طريق الانقسام ا....

Protocol

يتم إجراء جميع عمليات التبادل / الإضافات الإعلامية التي تتم في الخطوتين 1 و 2 من البروتوكول التالي في غطاء معقم. ما لم يذكر خلاف ذلك ، يجب شراء جميع الأواني البلاستيكية المستخدمة في غطاء المحرك المعقم معقمة ومختومة أو معقمة بشكل مناسب عبر الأوتوكلاف.

1. بدء خط الخلية EA.hy926

1. الحصول على خلايا EA.hy926.
2. قم بتخزين قارورة (قوارير) الخلايا في مرحلة بخار خزان النيتروجين السائل.
3. قم بإعداد وسط DMEM الكامل عن طريق تسخين DMEM و FBS والقلم / البكتيريا (انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل محددة) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة. أضف 50 مل من FBS....

النتائج

الغرض من هذا الفحص بشكل عام هو إنتاج منحنيات التركيز والاستجابة (CRCs) لثلاثة إلى أربعة بارمودولين جديد. في كل لوحة فحص ، غالبا ما يتم إنشاء CRC إضافي لمركب معروف ، مثل NRD-21 ، والذي يعمل كفحص جودة للتجربة بسبب IC₅₀ المعروف. لإنشاء CRCs ، يجب تخطيط خريطة لوحة مثل تلك الموضحة في.......

Discussion

في حين أن البروتوكول⁷² الذي تم الإبلاغ عنه سابقا كان موثوقا به بشكل عام وسمح لنا بتحديد بارمودولين رئيسي جديد ، NRD-21,62 كان مطلوبا بروتوكول أكثر كفاءة. تم اختراق الفحص بشكل أكبر خلال نقص العرض الناجم عن جائحة COVID-19. أصبح الحصول على نصائح لمعالج السو?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells	ATCC	CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent	Corning	25-056-CI	Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-091
Gelatin from porcine skin	MilliporeSigma	G2500	Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)	Corning	30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)	Corning	25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Thermo	172571000
Bovine serum albumin (BSA)	Avantor	97061-420
Calcium chloride dihydrate	Thermo	42352-0250
Dimethyl sulfoxide	Thermo	J66650-AD
Fluo-4/AM	Invitrogen	F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)	Corning	21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate	MilliporeSigma	M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)	Spectrum Chemical	P1166
Probenecid	TCI America	P1975
Sodium hydroxide	VWR International	BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)			Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate	Corning	3603	with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL	Avantor	89039-664
Centrifuge tube, 50 mL	Avantor	89039-656
Culture flask, T-75	Corning	353136	tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL	Corning	RES-V-50-S
Enspire plate reader	Perkin Elmer		Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Avantor	20170-038
Pasteur pipette, 9"	Fisher	13-678-6B	must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips	Avantor	76318-802
Pipette tips, 20 µL	Biotix	63300042	sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL	Biotix	63300044	sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL	Biotix	63300047	sterile, filtered tips
Prism	GraphPad		volume 6 used
Serological pipette, 5 mL	Tradewinds Direct	07-5005
Serological pipette, 10 mL	Tradewinds Direct	07-5010
Serological pipette, 25 mL	Tradewinds Direct	07-5025