Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Разработан усовершенствованный протокол анализа мобилизации кальция с эндотелиальными клетками, используемый для идентификации лигандов рецепторов, активируемых протеазой (ФАР). Новый протокол сокращает общее время анализа на 90-120 минут и позволяет получать воспроизводимые кривые «концентрация-реакция».
Изменения концентрации кальция в клетках быстро контролируются с высокой пропускной способностью с использованием внутриклеточных, флуоресцентных, кальций-связывающих красителей и инструментов визуализации, которые могут измерять флуоресцентные выбросы из 1536 лунок одновременно. Тем не менее, эти приборы намного дороже и могут быть сложными в обслуживании по сравнению с широко доступными считывателями пластин, которые сканируют лунки по отдельности. Здесь описан оптимизированный анализ с помощью планшетного ридера для использования с линией эндотелиальных клеток (EA.hy926) для измерения активации протеазно-активируемого рецептора (PAR) передачи сигналов Gαq и последующей мобилизации кальция с использованием кальций-связывающего красителя Fluo-4. Этот анализ был использован для характеристики ряда лигандов PAR, включая аллостерические противовоспалительные лиганды «пармодулин», нацеленные на PAR1, идентифицированные в лаборатории Докендорфа. Этот протокол устраняет необходимость в автоматизированной системе обработки жидкости и позволяет проводить скрининг PAR-лигандов со средней пропускной способностью в 96-луночных планшетах и должен быть применим для изучения других рецепторов, которые инициируют мобилизацию кальция.
Рецепторы, активируемые протеазой (PAR)1,2,3 представляют собой подсемейство рецепторов, сопряженных с белком G класса А (GPCR), которые экспрессируются в различных типах клеток, включая тромбоциты и эндотелиальные клетки 4,5,6,7. В отличие от большинства GPCR, PAR обладают уникальным внутримолекулярным режимом активации. Большинство GPCR активируются растворимыми лигандами, взаимодействующими с отчетливым связывающ....
Все обмены/добавления медиа, выполненные на этапах 1 и 2 следующего протокола, выполняются в стерильном колпаке. Если не указано иное, вся пластиковая посуда, используемая в стерильной вытяжке, должна быть приобретена стерилизованной и запечатанной или соответствующим образом стерилизована с помощью автоклава.
1. Инициация клеточной линии EA.hy926
Цель этого анализа, как правило, состоит в том, чтобы получить кривые «концентрация-реакция» (CRC) для трех-четырех новых пармодулинов. На каждой пластине для анализа часто создается дополнительный CRC для известного соединения, такого как NRD-21, который выступает в качест?.......
В то время как ранее описанный протокол72 был в целом надежным и позволил нам идентифицировать новый пармодулин свинца, NRD-21,62 был желателен более эффективный протокол. Анализ был еще больше затруднен во время нехватки поставок, вызванной панд.......
К.Д. является изобретателем патентов, связанных с пармодулинами, а также основателем и акционером компании Function Therapeutics, Inc., которая разрабатывает пармодулины для клинического использования.
Мы благодарим Ирен Эрнандес, Труди Холист, доктора Хартмута Вейлера (Институт исследования крови Версити) и доктора Легги Арнольда (Университет Висконсин-Милуоки) за предоставление пространства и косвенную поддержку этого проекта, а также доктора Джона МакКорви (Медицинский колледж Висконсина) за соответствующие советы. Мы благодарим Национальный институт сердца, легких и крови (R15HL127636), Министерство обороны США (W81XWH22101) и Национальный научный фонд (2223225) за грантовую поддержку.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Reagents | |||
Adherent EA.hy926 cells | ATCC | CRL-2922 | |
CellStripper cell dissociation reagent | Corning | 25-056-CI | Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays. |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red | Corning | 10-013-CV | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-091 | |
Gelatin from porcine skin | MilliporeSigma | G2500 | Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize. |
Pen/Strep (100X) | Corning | 30-002-CI | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
Trypan Blue (0.4% w/v) | Corning | 25-900-CI | |
Calcium Mobilization Reagents | |||
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Thermo | 172571000 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Avantor | 97061-420 | |
Calcium chloride dihydrate | Thermo | 42352-0250 | |
Dimethyl sulfoxide | Thermo | J66650-AD | |
Fluo-4/AM | Invitrogen | F14201 | |
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free) | Corning | 21-022-CV | |
Magnesium chloride hexahydrate | MilliporeSigma | M2393 | |
Pluronic F-127 (Poloxamer 407) | Spectrum Chemical | P1166 | |
Probenecid | TCI America | P1975 | |
Sodium hydroxide | VWR International | BDH9292 | |
TFLLRN-NH2 (TFA salt) | Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute | ||
Materials | |||
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate | Corning | 3603 | with transparent lids |
Centrifuge tube, 15 mL | Avantor | 89039-664 | |
Centrifuge tube, 50 mL | Avantor | 89039-656 | |
Culture flask, T-75 | Corning | 353136 | tissue culture treated |
Disposable reagent reservoir, 50 mL | Corning | RES-V-50-S | |
Enspire plate reader | Perkin Elmer | Discontinued | |
Microcentrifuge tube, 1.5 mL | Avantor | 20170-038 | |
Pasteur pipette, 9" | Fisher | 13-678-6B | must be sterilized |
PCR tube strip with separate flat cap strips | Avantor | 76318-802 | |
Pipette tips, 20 µL | Biotix | 63300042 | sterile, filtered tips |
Pipette tips, 200 µL | Biotix | 63300044 | sterile, filtered tips |
Pipette tips, 1250 µL | Biotix | 63300047 | sterile, filtered tips |
Prism | GraphPad | volume 6 used | |
Serological pipette, 5 mL | Tradewinds Direct | 07-5005 | |
Serological pipette, 10 mL | Tradewinds Direct | 07-5010 | |
Serological pipette, 25 mL | Tradewinds Direct | 07-5025 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены