АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Разработан усовершенствованный протокол анализа мобилизации кальция с эндотелиальными клетками, используемый для идентификации лигандов рецепторов, активируемых протеазой (ФАР). Новый протокол сокращает общее время анализа на 90-120 минут и позволяет получать воспроизводимые кривые «концентрация-реакция».

Аннотация

Изменения концентрации кальция в клетках быстро контролируются с высокой пропускной способностью с использованием внутриклеточных, флуоресцентных, кальций-связывающих красителей и инструментов визуализации, которые могут измерять флуоресцентные выбросы из 1536 лунок одновременно. Тем не менее, эти приборы намного дороже и могут быть сложными в обслуживании по сравнению с широко доступными считывателями пластин, которые сканируют лунки по отдельности. Здесь описан оптимизированный анализ с помощью планшетного ридера для использования с линией эндотелиальных клеток (EA.hy926) для измерения активации протеазно-активируемого рецептора (PAR) передачи сигналов Gαq и последующей мобилизации кальция с использованием кальций-связывающего красителя Fluo-4. Этот анализ был использован для характеристики ряда лигандов PAR, включая аллостерические противовоспалительные лиганды «пармодулин», нацеленные на PAR1, идентифицированные в лаборатории Докендорфа. Этот протокол устраняет необходимость в автоматизированной системе обработки жидкости и позволяет проводить скрининг PAR-лигандов со средней пропускной способностью в 96-луночных планшетах и должен быть применим для изучения других рецепторов, которые инициируют мобилизацию кальция.

Введение

Рецепторы, активируемые протеазой (PAR)1,2,3 представляют собой подсемейство рецепторов, сопряженных с белком G класса А (GPCR), которые экспрессируются в различных типах клеток, включая тромбоциты и эндотелиальные клетки 4,5,6,7. В отличие от большинства GPCR, PAR обладают уникальным внутримолекулярным режимом активации. Большинство GPCR активируются растворимыми лигандами, взаимодействующими с отчетливым связывающим карманом, но PARs активируются протеолитическим расщеплением N-конца, что приводит к образованию нового связанного лиганда, который может взаимодействовать с доменом внеклеточной петли 2 на поверхности клетки 6,8,9. Это взаимодействие активирует рецептор и может инициировать несколько сигнальных путей, способствуя таким эффектам, как воспаление и активация тромбоцитов 4,10,11,12. Различные протеазы могут активировать PARs путем расщепления в уникальных участках на N-конце, выявляя различные привязанные лиганды (TL), которые стабилизируют конформации рецепторов, инициирующие различные сигнальные пути 9,13,14,15. Например, у наиболее хорошо изученного члена подсемейства, PAR1, расщепление тромбином используется для поддержки многочисленных биологических процессов, включая активацию тромбоцитов и рекрутирование лейкоцитов в эндотелий, но может приводить к вредным эффектам при гиперэкспрессии или гиперактивации рецептора 4,16,17,18,19,20,21 . И наоборот, расщепление активированным протеином С (aPC) может способствовать противовоспалительному эффекту и поддержанию эндотелиальных барьеров 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PARs также могут быть активированы пептидными аналогами TLs межмолекулярным образом 13,30,31. Эти пептиды обычно используются для измерения ингибирования (модуляции) PAR вместо протеаз, нацеленных на PAR, и они используются в данном протоколе.

С патологической передачей сигналов PAR1 связаны многочисленные расстройства, в том числе сепсис22,32, сердечно-сосудистые заболевания 33,34,35,36,37,38, заболевания почек 39,40,41,42, серповидноклеточная анемия 43, фиброз44, остеопороз и остеоартрит45,46, нейродегенерация 47,48,49,50,51 и рак 52,53,54,55,56,57,58,59. Антагонисты PAR1 изучаются с 1990-х годов в качестве антитромбоцитарных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, и растущий список заболеваний, связанных с рецептором, требует идентификации новых лигандов для использования в качестве биологических зондов (инструментальных соединений) или в качестве потенциальных терапевтических средств. В настоящее время существует только один одобренный FDA антагонист PAR1, ворапаксар, который используется для лечения ишемической болезни сердца у пациентов с высоким риском 34,36,37,60. Альтернативный антагонист PAR1, пепдуцин PZ-128, завершил успешное исследование II фазы по предотвращению тромбозау пациентов с катетеризацией сердца. Группа Докендорфа сосредоточилась на медицинской химии и фармакологии отдельного класса малых молекул, лигандов PAR1, известных как пармодулины61,62. В отличие от зарегистрированных антагонистов PAR1, таких как ворапаксар, пармодулины являются аллостерическими, смещенными модуляторами PAR1, которые избирательно блокируют путь Gαq, способствуя цитопротекторным эффектам, подобным aPC. В отличие от мощных ортостерических антагонистов PAR1, таких как ворапаксар, опубликованные пармодулины также являются обратимыми 63,64,65.

Первоначально пармодулины были идентифицированы Флауменхафтом и его коллегами по их способности ингибировать экспрессию Р-селектина или секрецию гранул в тромбоцитах61,66. Тем не менее, потребовался альтернативный метод для изучения влияния пармодулинов на эндотелиальные клетки. Одним из распространенных методов мониторинга сигнализации, связанной с GPCR, является измерение внутриклеточной мобилизацииCa2+, важного вторичного посредника, который может быть измерен с помощью подходящего внутриклеточного кальцийсвязывающего красителя67,68. Были предоставлены существенные доказательства, показывающие, что мобилизация кальция, индуцированная PAR1, происходит за счет активации Gαq 69,70. После активации привязанным лигандом (или подходящим экзогенным лигандом) PAR1 претерпевает конформационное изменение, в результате которого гуанозиндифосфат (GDP), связанный с субъединицей Gαq, заменяется гуанозинтрифосфатом (ГТФ)68. Затем субъединица Gαq активирует фосфолипазу Cβ (PLC-β), которая катализирует гидролиз фосфатидилинозитол 4,5 бисфосфата (PIP2), образуя 1,4,5-инозитолтрифосфат (IP3) и диацилглицерин (DAG). Наконец, IP3 связывается с IP3-чувствительными каналамиCa2+ в мембране эндоплазматического ретикулума, позволяя Ca2+ высвобождаться в цитоплазму, где он может связываться с Ca2+-зависимыми флуоресцентными красителями, такими как Fluo-4, которые добавляются к клеткам71. Этот процесс происходит в течение нескольких секунд и может увеличить концентрацию Ca2+ в 100 раз, что приводит к резкому изменению количества связанного с кальцием красителя и сильного флуоресцентного сигнала.

В 2018 году группа Докендорфа раскрыла анализ мобилизации Ca2+ со средней пропускной способностью, который может быть использован для идентификации антагонистов пути Gαq PAR172. В анализе использовалась EA.hy92673, гибридная линия эндотелиальных клеток человека, которая может быть использована для множественных пассажей без заметного изменения экспрессии PAR1 и предназначена для измерений цитопротекторных эффектов in vitro .

В оригинальном протоколе использовались ячейки EA.hy926 в 96-луночных планшетах и с добавлением красителя Fluo-4/AM, который был выбран из-за его интенсивной флуоресценции на длине волны 488 нм и высокой проницаемости клеток. После загрузки красителя в ячейки выполнялись длительные этапы промывки с помощью автоматизированного 8-канального обработчика жидкости (более быстрые методы обработки жидкости, такие как 96-канальная промывка, были недоступны). Воспроизводимость этого анализа была лучше, чем без тщательной автоматизированной смены среды. Затем антагонисты инкубировали с клетками, PAR1 активировали путем последовательного добавления селективного агониста (16 лунок за раз), а для определения активности измеряли изменения флуоресценции, возникающие в результате мобилизации кальция и связывания красителя.

Хотя этот протокол позволяет измерить PAR1-опосредованную мобилизацию кальция, он ограничен временем, необходимым для анализа каждого 96-луночного планшета. Длительное время экспериментов проблематично не только потому, что количество соединений, которые можно проверять каждый день, ограничено, но и потому, что отток красителя происходит с течением времени, сужая окно анализа за счет увеличения базальной флуоресценции. Одним из факторов, способствующих длительному времени эксперимента, является использование 8-канального манипулятора жидкости для мытья тарелок, что добавляет более 30 минут к каждому эксперименту. Необходимые чаевые также стало трудно получить из-за проблем с цепочкой поставок. Здесь представлен обновленный протокол PAR-опосредованного анализа мобилизации кальция, который не требует работы с жидкостью и, следовательно, может выполняться с более высокой пропускной способностью. Этот протокол также должен быть пригоден для измерения передачи сигналов с другими GPCR, которые приводят к внутриклеточной мобилизации кальция. Этот обновленный протокол считывания планшетов идеально подходит для академических и небольших промышленных лабораторий, которые не располагают ресурсами для дорогостоящих приборов для визуализации клеток, но нуждаются в быстром скрининге многочисленных соединений. Пример анализа мобилизации кальция с использованием планшетного тепловизора см. Caers et al.74.

протокол

Все обмены/добавления медиа, выполненные на этапах 1 и 2 следующего протокола, выполняются в стерильном колпаке. Если не указано иное, вся пластиковая посуда, используемая в стерильной вытяжке, должна быть приобретена стерилизованной и запечатанной или соответствующим образом стерилизована с помощью автоклава.

1. Инициация клеточной линии EA.hy926

  1. Приобретите элементы EA.hy926.
  2. Храните флакон (флаконы) с ячейками в паровой фазе резервуара с жидким азотом.
  3. Приготовьте готовую среду DMEM, предварительно прогрев DMEM, FBS и шприц-стрептококк (подробнее см. Таблицу материалов ) на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15-30 минут. Добавьте 50 мл FBS и 1 мл шприц-ручки/стрептококка к 500 мл DMEM. Аккуратно перемешайте раствор путем инверсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком энергичное перемешивание приводит к образованию чрезмерного количества пузырьков.
  4. Извлеките один флакон клеток из жидкого азота и прогрейте на водяной бане при температуре 37 °C в течение 5 минут.
  5. Простерилизовать флакон с ячейками и флакон с полной средой DMEM путем распыления спиртом, после чего переместить в стерильный колпак.
  6. С помощью пипетки объемом 1 000 мкл аккуратно перенесите клетки в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 1 мл DMEM во флакон для промывки и добавьте в пробирку центрифуги.
  7. Сделайте гранулу клеток с помощью центрифуги (150 × г, 5 мин, 22 °C). Удалите среду из центрифужной пробирки путем аспирации; Будьте осторожны, чтобы не потревожить клеточную гранулу.
  8. Добавьте 3 мл полной среды DMEM в центрифужную пробирку и аккуратно разбейте гранулу, перемешивая клеточную суспензию с помощью пипетки объемом 1 000 μл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать образования пузырьков при слишком энергичном перемешивании, так как это может активировать или повредить клетки.
  9. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего в микроцентрифужной пробирке с помощью пипетки с наконечниками объемом 20 мкл или 200 мкл. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии/трипановой синей смеси в гемоцитометр и подсчитайте клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 0,1-10 мкл наконечниками пипетки может срезать клетки. Наконечники такого размера не следует использовать при работе с клеточной суспензией.
  10. Добавьте полную среду DMEM в клеточную суспензию для получения плотности 66 000 клеток/мл с помощью серологической пипетки объемом 10 или 25 мл. Пипетка 15 мл клеточной суспензии в колбу (колбы) для культур Т-75. Обеспечьте равномерное рассеивание клеточной суспензии, перемещая колбу с севера на юг и с востока на запад.
  11. Инкубируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут слияния (обычно через 4-6 дней), что оценивается при исследовании под микроскопом. На этом этапе используйте клетки в эксперименте (начиная с раздела 2) или засейте их в новые колбы для расширения для приготовления замороженных запасов (при рекомендуемой плотности затравки 1 000 000 клеток в 15 мл полной среды на колбу Т-75).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно выращивать в колбах с культурами в течение 3 недель без заметной разницы в форме, здоровье или производительности в анализе. Готовый носитель следует менять каждые 3-4 дня.

2. Добавление ячеек EA.hy926 к 96-луночным планшетам

Примечание: Клетки из одной конфлюентной колбы с культурой Т-75 могут быть использованы для приготовления двух или трех планшетов для анализа или опционально расширены до 15 свежих колб Т-75. В обычный рабочий день можно провести скрининг не менее пяти пластин для анализа с использованием протокола, приведенного в разделах 4 и 5. Следующие инструкции описывают подготовку и испытание одной пластины для анализа, но дополнительные пластины могут быть подготовлены путем повторения этапов 2.2, 2.7, 2.12 и 3.2 для подготовки желаемого количества пластин для анализа. Чаще всего в день готовят четыре аналитических планшета для измерения реакции концентрации до 16 соединений, для чего требуются две колбы Т-75 с конфлюентными клетками.

  1. Прогрейте полную среду DMEM на водяной бане 37 °C в течение 15-30 минут. Простерилизуйте флакон с полной средой DMEM, распылив на нее спирт, затем переместите его в стерильную колпак.
  2. Добавьте 100 мкл стерилизованного 0,4% раствора желатина во все лунки черностенной 96-луночной пластины с прозрачным дном и крышкой. Инкубировать планшет с раствором желатина в инкубаторе (37 °C, 5%CO2) в течение 30 минут.
  3. С помощью инвертированного микроскопа подтвердите, что клетки в колбе для культуры Т-75 на 80-100% сливаются. Извлеките рабочую среду DMEM из колбы Т-75 с помощью аспирации.
  4. Промойте ячейки в колбе 10 мл PBS и аккуратно переместите колбу с севера на юг и с востока на запад. Извлеките PBS из колбы с помощью аспирации.
  5. Добавьте в колбу 5 мл раствора для диссоциации клеток и инкубируйте колбу в инкубаторе (37 °C, 5% CO2) в течение ~12 минут. Постучите по колбе через 6 минут, чтобы облегчить диссоциацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация клеток в течение более 15 минут с использованием указанного агента для диссоциации клеток приводит к тому, что клетки начинают слипаться, что затрудняет получение точного подсчета клеток и может помешать анализу.
  6. Добавьте в колбу 5 мл предварительно подогретой среды DMEM complete и аккуратно перемешайте с раствором для диссоциации клеток/клеточной суспензией. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Сделайте гранулу клеток с помощью центрифуги (150 × г, 5 мин, 22 °C).
  7. Пока гранула формируется, удалите желатиновый раствор из 96-луночного планшета с помощью аспирации с помощью пипетки Пастера, подключенной к вакууму. Снимите крышку пластины с момента удаления желатина до тех пор, пока раствор не будет готов к нанесению на покрытие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально можно использовать многоканальную пипетку или стерильный коллектор, подключенный к вакууму.
  8. Удалить среду из центрифужной пробирки путем аспирации с помощью пастеровской пипетки, подключенной к вакуумной или серологической пипетке; Будьте осторожны, чтобы не потревожить клеточную гранулу.
  9. Добавьте свежую среду DMEM complete в центрифужную пробирку с помощью серологической пипетки объемом 5 или 10 мл. Аккуратно разбейте клеточную гранулу, смешав полную среду DMEM с пипеткой объемом 1 000 мкл или серологической пипеткой объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используется восемь миллилитров DMEM, но можно добавить и большие объемы, чтобы облегчить подсчет клеток.
  10. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего в микроцентрифужной пробирке с помощью пипетки с наконечниками объемом 20 мкл или 200 мкл. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии/трипановой синей смеси в гемоцитометр и подсчитайте клетки.
  11. Добавьте полную среду DMEM в клеточную суспензию для получения плотности 600 000 клеток/мл с помощью серологической пипетки объемом 10 или 25 мл. Это даст окончательную плотность 60 000 ячеек/лунку в 96-луночном планшете (определенная как оптимальная плотность в результате экспериментов).
    Примечание: Нормальная успешная клеточная культура дает от 12 000 000 до 15 000 000 клеток, которые могут засеять от двух до трех 96-луночных планшетов.
  12. Перемешайте клеточную суспензию, осторожно перевернув пробирку центрифуги, и добавьте ее в многоканальный резервуар для пипетки объемом 50 мл. Перемешивая суспензию в резервуаре каждые 30 с, осторожно покачивая резервуар из стороны в сторону, добавьте по 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Установите на место прозрачную крышку пластины и осторожно встряхните пластину, сдвинув ее по поверхности стерильного капюшона с севера на юг и с востока на запад, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте планшет в инкубаторе (37 °C, 5%CO2) в течение 16-24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления дополнительных планшетов можно использовать дополнительную клеточную суспензию или повторить шаги 1.10-1.11 для продолжения клеточной линии.

3. Препарат для мобилизационного анализа кальция

  1. Приготовьте реактивы для анализа.
    1. Приготовьте раствор пробенецида (250 мМ, водный), добавив 36 мг пробенецида в микроцентрифужную пробирку и растворив его в 0,6 М NaOH (500 μл). Вихревой раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробенецид улучшает удержание красителя в клетке за счет ингибирования органических ионных транспортеров 75,76,77.
    2. Чтобы сделать буфер для анализа HBSS-HEPES, добавьте HEPES (1,19 г) во флакон объемом 500 мл HBSS, не содержащего красных Ca/Mg/фенола (из этого получится 10 мМ раствор HEPES). Дополните буфер MgCl2 (1 М водный раствор, 500 μл) и CaCl2 (1 М водный раствор, 500 μл). Смешайте раствор и храните в холодильнике при температуре 5 °C, когда он не используется.
      1. Для каждого 96-луночного планшета добавьте 50 мл буфера для анализа HBSS-HEPES в центрифужную пробирку объемом 50 мл, добавьте 500 мкл раствора пробенецида и хорошо перемешайте. Перед использованием нагрейте буфер до комнатной температуры.
    3. Приготовьте 10% раствор Pluronic F-127 в ДМСО, добавив Pluronic F-127 (20 мг) в микроцентрифужную пробирку или флакон с ВЭЖХ и растворив его 200 мкл ДМСО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре, и его хватает примерно на 30 тарелок. Pluronic F-127 очень медленно растворяется при комнатной температуре, и его следует осторожно нагревать, чтобы облегчить растворение.
    4. Приготовьте буфер для загрузки красителя , сначала добавив 24 мкл ДМСО во флакон с Fluo-4/AM (50 мкг) для растворения красителя. В центрифужную пробирку объемом 15 мл, завернутую в фольгу, добавьте 6 мл буфера для анализа HBSS-HEPES и добавьте 6 мкл 10% Pluronic F-127 и 6 мл раствора Fluo-4/AM. Кратковременно перемешайте раствор и дайте постоять при комнатной температуре, вдали от света, в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить фотообесцвечивание Fluo-4, держите краситель вдали от света, обернув алюминиевой фольгой вокруг центрифужной трубки, содержащей раствор красителя, и крышки испытательной пластины.
  2. Подготовьте пробирные пластины.
    1. Извлеките пластину для анализа из инкубатора и подтвердите слияние с помощью инвертированного микроскопа. Вручную извлеките носитель DMEM complete, бросив его в раковину и промокнув верхнюю часть тарелки бумажным полотенцем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда достаточно удаляется, если держать пластину горизонтально и щелкать, а затем вращать пластину на 180° и повторять.
    2. Добавьте буфер для анализа HBSS-HEPES и раствор пробенецида в резервуар для растворителя многоканальной пипетки объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор будет использоваться для последующих этапов стирки, его следует отложить в сторону и накрыть алюминиевой фольгой до тех пор, пока он не понадобится.
    3. Добавьте 100 мкл буфера для анализа HBSS-HEPES плюс раствор пробенецида в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки и дайте клеткам посидеть в присутствии пробенецида в течение 5 минут. Извлеките буфер для анализа HBSS-HEPES, щелкнув в раковине таким же образом, как в шаге 3.2.1.
    4. Добавьте буфер для загрузки красителя в отдельный резервуар для многоканального растворителя для пипетки объемом 50 мл. Добавьте 50 мкл буфера для загрузки красителя в каждую лунку пробирного планшета с помощью многоканальной пипетки. Инкубируйте планшет в течение 45 минут (37 °C, 5%CO2).
    5. Пока планшет находится в инкубаторе, приготовьте растворы агониста/антагониста.
      1. Растворы антагонистов хранятся в виде 31,6 мМ растворов в ДМСО. В ПЦР-пробирке разбавьте 2 мкл исходного раствора 38 мкл 0,1% БСА/вода до получения раствора 1,58 мМ. 2 мкл этого раствора дадут конечную концентрацию 31,6 мкМ в анализной пластине. Разбавьте 4 мкл 1,58 мМ раствора антагониста 36 мкл 5% ДМСО/вода (без добавления БСА) и приготовьте оставшиеся концентрации путем последовательного разведения.
      2. Приготовьте 108,3 мкМ (16,7x) раствор TFLLRN-NH2 в буфере для анализа HBSS-HEPES, который даст конечную концентрацию 6,5 мкМ при добавлении 6 мкл в каждую лунку планшета для анализа. Например, растворите 2 мг аликвоты TFLLRN-NH2 с 5,244 мл буфера для анализа HBSS-HEPES с получением 0,5 мМ исходного раствора. Смешайте 1,083 мл этого раствора с 3,917 мл буфера для анализа HBSS-HEPES с получением раствора 108,3 мкм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: РАСТВОРЫ TFLLRN-NH2 следует хранить в морозильной камере при температуре -20 °C, когда они не используются.
    6. Извлеките планшет из инкубатора и обеспечьте поглощение красителя с помощью флуоресцентного микроскопа при подходящей настройке (обычно для зеленого флуоресцентного белка см. Рисунок 1 для примера успешной загрузки Fluo-4 в клетки). Снимите буфер загрузки красителя, щелкнув пластиной таким же образом, как в шаге 3.2.1.
    7. Промойте клетки 2 раза 50 мкл буфера для анализа HBSS-HEPES плюс раствор пробенецида (из шага 3.2.3) в каждой лунке (удалите, бросив среду в раковину).
    8. Добавьте 92 мкл буфера для анализа HBSS-HEPES в каждую лунку и снова просмотрите клетки с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы убедиться, что избыток красителя был полностью удален и что клетки остаются адгезивными.
    9. С помощью многоканальной пипетки добавьте 2 мкл растворов антагонистов и носителя в соответствующие лунки (репрезентативную схему планшетов см. в таблице 1 ).

4. Проведение анализа на мобилизацию кальция

  1. Установите считыватель пластин следующим образом: температура: 37 °C; длина волны возбуждения: 485 нм; длина волны излучения: 525 нм; высота измерения: 7,8 мм (оптимизированная); количество вспышек: 100; Количество повторов: 20.
  2. Инкубируйте планшет в течение 15 минут в считывателе планшетов при температуре 37 °C. Измерьте фоновую флуоресценцию в столбцах 1 и 2 (пять сканирований на лунку).
  3. Извлеките планшет из считывателя планшетов и быстро добавьте 6 мкл раствора агониста в каждую лунку в столбцах 1 и 2 из 8-пробирочной ПЦР-полоски с помощью многоканальной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе мы используем электронный 8-канальный пипетку с наконечниками для дозатора объемом 0,1-10 мкл.
  4. Измерьте изменение флуоресценции по мере того, как в клетках происходит мобилизация кальция. Выполните по 20 сканирований каждой лунки в соответствии с настройками выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование каждой лунки в две колонки по 20 раз каждая занимает примерно 5 минут (т.е. ~15 секунд между сканированием каждой лунки).
  5. Повторите шаги 4.2-4.4 для столбцов 3-12 с шагом в два столбца.

5. Анализ данных

  1. Экспортируйте данные из анализа в виде отдельных электронных таблиц для каждой группы из двух столбцов.
  2. Найдите среднее значение базальных показаний флуоресценции с помощью функции AVG (первое сканирование: последнее сканирование). Проделайте это для каждой лунки в обеих колоннах.
  3. Найдите максимальную флуоресценцию после добавления агониста с помощью функции MAX(first scan: last scan).
  4. Рассчитайте изменение флуоресценции путем вычитания базальной флуоресценции из максимальной флуоресценции.
  5. Вычтите изменение флуоресценции, рассчитанное для отрицательного контроля (добавление автомобиля без агониста) из каждой лунки в той же колонке.
  6. Найти относительное (нормированное) изменение флуоресценции путем деления изменения флуоресценции в каждой лунке на изменение флуоресценции в носителе (0,1% ДМСО/вода) + 6,5 мкМ tfllrn-NH2 лунки.
  7. Скопируйте неконтролируемые значения в процентах в программу для статистики и построения графиков. Если вы используете указанное программное обеспечение, выберите опцию таблицы XY, выбрав Numbers в качестве оси X, и повторите значения в параллельных подстолбцах в качестве оси Y.
  8. Используйте программу для построения кривых «концентрация-реакция» (CRC) на основе данных. Если вы используете указанное программное обеспечение, выберите опцию log(inhibitor) vs. response - Variable slope (четыре параметра).

Результаты

Цель этого анализа, как правило, состоит в том, чтобы получить кривые «концентрация-реакция» (CRC) для трех-четырех новых пармодулинов. На каждой пластине для анализа часто создается дополнительный CRC для известного соединения, такого как NRD-21, который выступает в качест?...

Обсуждение

В то время как ранее описанный протокол72 был в целом надежным и позволил нам идентифицировать новый пармодулин свинца, NRD-21,62 был желателен более эффективный протокол. Анализ был еще больше затруднен во время нехватки поставок, вызванной панд...

Раскрытие информации

К.Д. является изобретателем патентов, связанных с пармодулинами, а также основателем и акционером компании Function Therapeutics, Inc., которая разрабатывает пармодулины для клинического использования.

Благодарности

Мы благодарим Ирен Эрнандес, Труди Холист, доктора Хартмута Вейлера (Институт исследования крови Версити) и доктора Легги Арнольда (Университет Висконсин-Милуоки) за предоставление пространства и косвенную поддержку этого проекта, а также доктора Джона МакКорви (Медицинский колледж Висконсина) за соответствующие советы. Мы благодарим Национальный институт сердца, легких и крови (R15HL127636), Министерство обороны США (W81XWH22101) и Национальный научный фонд (2223225) за грантовую поддержку.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

Ссылки

  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4 (2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582 (2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -. M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597 (2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062 (2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124 (2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100 (2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -. A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23 (2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516 (2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

PARPARGEA hy926PAR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены