Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Разработан усовершенствованный протокол анализа мобилизации кальция с эндотелиальными клетками, используемый для идентификации лигандов рецепторов, активируемых протеазой (ФАР). Новый протокол сокращает общее время анализа на 90-120 минут и позволяет получать воспроизводимые кривые «концентрация-реакция».

Аннотация

Изменения концентрации кальция в клетках быстро контролируются с высокой пропускной способностью с использованием внутриклеточных, флуоресцентных, кальций-связывающих красителей и инструментов визуализации, которые могут измерять флуоресцентные выбросы из 1536 лунок одновременно. Тем не менее, эти приборы намного дороже и могут быть сложными в обслуживании по сравнению с широко доступными считывателями пластин, которые сканируют лунки по отдельности. Здесь описан оптимизированный анализ с помощью планшетного ридера для использования с линией эндотелиальных клеток (EA.hy926) для измерения активации протеазно-активируемого рецептора (PAR) передачи сигналов Gαq и последующей мобилизации кальция с использованием кальций-связывающего красителя Fluo-4. Этот анализ был использован для характеристики ряда лигандов PAR, включая аллостерические противовоспалительные лиганды «пармодулин», нацеленные на PAR1, идентифицированные в лаборатории Докендорфа. Этот протокол устраняет необходимость в автоматизированной системе обработки жидкости и позволяет проводить скрининг PAR-лигандов со средней пропускной способностью в 96-луночных планшетах и должен быть применим для изучения других рецепторов, которые инициируют мобилизацию кальция.

Введение

Рецепторы, активируемые протеазой (PAR)1,2,3 представляют собой подсемейство рецепторов, сопряженных с белком G класса А (GPCR), которые экспрессируются в различных типах клеток, включая тромбоциты и эндотелиальные клетки 4,5,6,7. В отличие от большинства GPCR, PAR обладают уникальным внутримолекулярным режимом активации. Большинство GPCR активируются растворимыми лигандами, взаимодействующими с отчетливым связывающ....

протокол

Все обмены/добавления медиа, выполненные на этапах 1 и 2 следующего протокола, выполняются в стерильном колпаке. Если не указано иное, вся пластиковая посуда, используемая в стерильной вытяжке, должна быть приобретена стерилизованной и запечатанной или соответствующим образом стерилизована с помощью автоклава.

1. Инициация клеточной линии EA.hy926

  1. Приобретите элементы EA.hy926.
  2. Храните флакон (флаконы) с ячейками в паровой фазе резервуара с жидким азотом.
  3. Приготовьте готовую среду DMEM, предварительно прогрев DMEM, FBS и шприц-стрептококк (подробнее см.

Результаты

Цель этого анализа, как правило, состоит в том, чтобы получить кривые «концентрация-реакция» (CRC) для трех-четырех новых пармодулинов. На каждой пластине для анализа часто создается дополнительный CRC для известного соединения, такого как NRD-21, который выступает в качест?.......

Обсуждение

В то время как ранее описанный протокол72 был в целом надежным и позволил нам идентифицировать новый пармодулин свинца, NRD-21,62 был желателен более эффективный протокол. Анализ был еще больше затруднен во время нехватки поставок, вызванной панд.......

Раскрытие информации

К.Д. является изобретателем патентов, связанных с пармодулинами, а также основателем и акционером компании Function Therapeutics, Inc., которая разрабатывает пармодулины для клинического использования.

Благодарности

Мы благодарим Ирен Эрнандес, Труди Холист, доктора Хартмута Вейлера (Институт исследования крови Версити) и доктора Легги Арнольда (Университет Висконсин-Милуоки) за предоставление пространства и косвенную поддержку этого проекта, а также доктора Джона МакКорви (Медицинский колледж Висконсина) за соответствующие советы. Мы благодарим Национальный институт сердца, легких и крови (R15HL127636), Министерство обороны США (W81XWH22101) и Национальный научный фонд (2223225) за грантовую поддержку.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

Ссылки

  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

PARPARGEA hy926PAR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены