Характеристика модуляторов рецепторов, активируемых протеазой, с помощью анализа мобилизации кальция с использованием планшетного ридера

Резюме

Разработан усовершенствованный протокол анализа мобилизации кальция с эндотелиальными клетками, используемый для идентификации лигандов рецепторов, активируемых протеазой (ФАР). Новый протокол сокращает общее время анализа на 90-120 минут и позволяет получать воспроизводимые кривые «концентрация-реакция».

Аннотация

Изменения концентрации кальция в клетках быстро контролируются с высокой пропускной способностью с использованием внутриклеточных, флуоресцентных, кальций-связывающих красителей и инструментов визуализации, которые могут измерять флуоресцентные выбросы из 1536 лунок одновременно. Тем не менее, эти приборы намного дороже и могут быть сложными в обслуживании по сравнению с широко доступными считывателями пластин, которые сканируют лунки по отдельности. Здесь описан оптимизированный анализ с помощью планшетного ридера для использования с линией эндотелиальных клеток (EA.hy926) для измерения активации протеазно-активируемого рецептора (PAR) передачи сигналов G_αq и последующей мобилизации кальция с использованием кальций-связывающего красителя Fluo-4. Этот анализ был использован для характеристики ряда лигандов PAR, включая аллостерические противовоспалительные лиганды «пармодулин», нацеленные на PAR1, идентифицированные в лаборатории Докендорфа. Этот протокол устраняет необходимость в автоматизированной системе обработки жидкости и позволяет проводить скрининг PAR-лигандов со средней пропускной способностью в 96-луночных планшетах и должен быть применим для изучения других рецепторов, которые инициируют мобилизацию кальция.

Введение

Рецепторы, активируемые протеазой (PAR)^1,2,3 представляют собой подсемейство рецепторов, сопряженных с белком G класса А (GPCR), которые экспрессируются в различных типах клеток, включая тромбоциты и эндотелиальные клетки ^4,5,6,7. В отличие от большинства GPCR, PAR обладают уникальным внутримолекулярным режимом активации. Большинство GPCR активируются растворимыми лигандами, взаимодействующими с отчетливым связывающ....

протокол

Все обмены/добавления медиа, выполненные на этапах 1 и 2 следующего протокола, выполняются в стерильном колпаке. Если не указано иное, вся пластиковая посуда, используемая в стерильной вытяжке, должна быть приобретена стерилизованной и запечатанной или соответствующим образом стерилизована с помощью автоклава.

1. Инициация клеточной линии EA.hy926

1. Приобретите элементы EA.hy926.
2. Храните флакон (флаконы) с ячейками в паровой фазе резервуара с жидким азотом.
3. Приготовьте готовую среду DMEM, предварительно прогрев DMEM, FBS и шприц-стрептококк (подробнее см.

Результаты

Цель этого анализа, как правило, состоит в том, чтобы получить кривые «концентрация-реакция» (CRC) для трех-четырех новых пармодулинов. На каждой пластине для анализа часто создается дополнительный CRC для известного соединения, такого как NRD-21, который выступает в качест?.......

Обсуждение

В то время как ранее описанный протокол⁷² был в целом надежным и позволил нам идентифицировать новый пармодулин свинца, NRD-21,62 был желателен более эффективный протокол. Анализ был еще больше затруднен во время нехватки поставок, вызванной панд.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells	ATCC	CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent	Corning	25-056-CI	Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-091
Gelatin from porcine skin	MilliporeSigma	G2500	Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)	Corning	30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)	Corning	25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Thermo	172571000
Bovine serum albumin (BSA)	Avantor	97061-420
Calcium chloride dihydrate	Thermo	42352-0250
Dimethyl sulfoxide	Thermo	J66650-AD
Fluo-4/AM	Invitrogen	F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)	Corning	21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate	MilliporeSigma	M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)	Spectrum Chemical	P1166
Probenecid	TCI America	P1975
Sodium hydroxide	VWR International	BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)			Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate	Corning	3603	with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL	Avantor	89039-664
Centrifuge tube, 50 mL	Avantor	89039-656
Culture flask, T-75	Corning	353136	tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL	Corning	RES-V-50-S
Enspire plate reader	Perkin Elmer		Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Avantor	20170-038
Pasteur pipette, 9"	Fisher	13-678-6B	must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips	Avantor	76318-802
Pipette tips, 20 µL	Biotix	63300042	sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL	Biotix	63300044	sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL	Biotix	63300047	sterile, filtered tips
Prism	GraphPad		volume 6 used
Serological pipette, 5 mL	Tradewinds Direct	07-5005
Serological pipette, 10 mL	Tradewinds Direct	07-5010
Serological pipette, 25 mL	Tradewinds Direct	07-5025