Charakterisierung von Modulatoren von Protease-aktivierten Rezeptoren mit einem Calciummobilisierungsassay unter Verwendung eines Plattenreaders

Zusammenfassung

Es wurde ein verbessertes Protokoll für einen Kalziummobilisierungsassay mit Endothelzellen entwickelt, der zur Identifizierung von Liganden von Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs) verwendet wird. Das neue Protokoll reduziert die Gesamttestzeit um 90-120 Minuten und liefert reproduzierbare Konzentrations-Wirkungs-Kurven.

Zusammenfassung

Veränderungen der Kalziumkonzentration in Zellen werden mit Hilfe von intrazellulären, fluoreszierenden, kalziumbindenden Farbstoffen und bildgebenden Instrumenten, die Fluoreszenzemissionen von bis zu 1.536 Wells gleichzeitig messen können, schnell und im Hochdurchsatz überwacht. Diese Instrumente sind jedoch viel teurer und können im Vergleich zu weit verbreiteten Plattenlesegeräten, die die Wells einzeln scannen, eine Herausforderung in der Wartung darstellen. Hier wird ein optimierter Platten-Reader-Assay für die Verwendung mit einer Endothelzelllinie (EA.hy926) beschrieben, um die Protease-aktivierte Rezeptor (PAR)-getriebene Aktivierung des_{G-αq-Signalwegs} und die anschließende Kalziummobilisierung unter Verwendung des Kalzium-bindenden Farbstoffs Fluo-4 zu messen. Dieser Assay wurde zur Charakterisierung einer Reihe von PAR-Liganden verwendet, einschließlich der allosterischen, auf PAR1 abzielenden entzündungshemmenden "Parmodulin"-Liganden, die im Dockendorff-Labor identifiziert wurden. Dieses Protokoll macht einen automatisierten Liquid Handler überflüssig und ermöglicht das Screening von PAR-Liganden bei mittlerem Durchsatz in 96-Well-Platten und sollte für die Untersuchung anderer Rezeptoren anwendbar sein, die die Kalziummobilisierung initiieren.

Einleitung

Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs)^1,2,3 sind eine Unterfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) der Klasse A, die in einer Vielzahl von Zelltypen exprimiert werden, einschließlich Blutplättchen und Endothelzellen ^4,5,6,7. Im Gegensatz zu den meisten GPCRs haben PARs einen einzigartigen intramolekularen Aktivierungsmodus. Die meisten GPCRs werden durch lösliche Liganden aktiviert, die mit einer ausgepr....

Protokoll

Alle in den Schritten 1 und 2 des folgenden Protokolls vorgenommenen Medienaustausche/-ergänzungen werden in einer sterilen Haube durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, müssen alle Kunststoffe, die in der sterilen Haube verwendet werden, sterilisiert und versiegelt gekauft oder ordnungsgemäß im Autoklaven sterilisiert werden.

1. Initiierung der EA.hy926-Zelllinie

1. Erwerben Sie EA.hy926-Zellen.
2. Lagern Sie Fläschchen mit Zellen in der Dampfphase eines Flüssigstickstofftanks.
3. Bereiten Sie das DMEM-Komplettmedium vor, indem Sie zuerst DMEM, FBS und Stift/Strep....

Diskussion

Während das zuvor berichtete Protokoll⁷² im Allgemeinen zuverlässig war und es uns ermöglichte, ein neues Leitparmodulin zu identifizieren, war NRD-21,62 ein effizienteres Protokoll gewünscht. Der Assay wurde während der durch die COVID-19-Pandemie verursachten Lieferengpässe weiter beeinträchtigt. Die Beschaffung von Spitzen für den automatisierten Liquid Handler wurde schwierig, und der Versuch, die Spitzen zu waschen, zu sterilis.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells	ATCC	CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent	Corning	25-056-CI	Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-091
Gelatin from porcine skin	MilliporeSigma	G2500	Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)	Corning	30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)	Corning	25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Thermo	172571000
Bovine serum albumin (BSA)	Avantor	97061-420
Calcium chloride dihydrate	Thermo	42352-0250
Dimethyl sulfoxide	Thermo	J66650-AD
Fluo-4/AM	Invitrogen	F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)	Corning	21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate	MilliporeSigma	M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)	Spectrum Chemical	P1166
Probenecid	TCI America	P1975
Sodium hydroxide	VWR International	BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)			Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate	Corning	3603	with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL	Avantor	89039-664
Centrifuge tube, 50 mL	Avantor	89039-656
Culture flask, T-75	Corning	353136	tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL	Corning	RES-V-50-S
Enspire plate reader	Perkin Elmer		Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Avantor	20170-038
Pasteur pipette, 9"	Fisher	13-678-6B	must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips	Avantor	76318-802
Pipette tips, 20 µL	Biotix	63300042	sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL	Biotix	63300044	sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL	Biotix	63300047	sterile, filtered tips
Prism	GraphPad		volume 6 used
Serological pipette, 5 mL	Tradewinds Direct	07-5005
Serological pipette, 10 mL	Tradewinds Direct	07-5010
Serological pipette, 25 mL	Tradewinds Direct	07-5025