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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Es wurde ein verbessertes Protokoll für einen Kalziummobilisierungsassay mit Endothelzellen entwickelt, der zur Identifizierung von Liganden von Protease-aktivierten Rezeptoren (PARs) verwendet wird. Das neue Protokoll reduziert die Gesamttestzeit um 90-120 Minuten und liefert reproduzierbare Konzentrations-Wirkungs-Kurven.

Zusammenfassung

Veränderungen der Kalziumkonzentration in Zellen werden mit Hilfe von intrazellulären, fluoreszierenden, kalziumbindenden Farbstoffen und bildgebenden Instrumenten, die Fluoreszenzemissionen von bis zu 1.536 Wells gleichzeitig messen können, schnell und im Hochdurchsatz überwacht. Diese Instrumente sind jedoch viel teurer und können im Vergleich zu weit verbreiteten Plattenlesegeräten, die die Wells einzeln scannen, eine Herausforderung in der Wartung darstellen. Hier wird ein optimierter Platten-Reader-Assay für die Verwendung mit einer Endothelzelllinie (EA.hy926) beschrieben, um die Protease-aktivierte Rezeptor (PAR)-getriebene Aktivierung desG-αq-Signalwegs und die anschließende Kalziummobilisierung unter Verwendung des Kalzium-bindenden Farbstoffs Fluo-4 zu messen. Dieser Assay wurde zur Charakterisierung einer Reihe von PAR-Liganden verwendet, einschließlich der allosterischen, auf PAR1 abzielenden entzündungshemmenden "Parmodulin"-Liganden, die im Dockendorff-Labor identifiziert wurden. Dieses Protokoll macht einen automatisierten Liquid Handler überflüssig und ermöglicht das Screening von PAR-Liganden bei mittlerem Durchsatz in 96-Well-Platten und sollte für die Untersuchung anderer Rezeptoren anwendbar sein, die die Kalziummobilisierung initiieren.

Einleitung

Protease-aktivierte Rezeptoren (PARs)1,2,3 sind eine Unterfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) der Klasse A, die in einer Vielzahl von Zelltypen exprimiert werden, einschließlich Blutplättchen und Endothelzellen 4,5,6,7. Im Gegensatz zu den meisten GPCRs haben PARs einen einzigartigen intramolekularen Aktivierungsmodus. Die meisten GPCRs werden durch lösliche Liganden aktiviert, die mit einer ausgeprägten Bindungstasche interagieren, aber PARs werden durch die proteolytische Spaltung des N-Terminus aktiviert, was zu einem neuen angebundenen Liganden führt, der mit der extrazellulären Schleifen-2-Domäne auf der Oberfläche einer Zelle interagieren kann 6,8,9. Diese Interaktion aktiviert den Rezeptor und kann mehrere Signalwege initiieren, die Effekte wie Entzündungen und Thrombozytenaktivierung fördern 4,10,11,12. Verschiedene Proteasen können PARs durch Spaltung an einzigartigen Stellen am N-Terminus aktivieren, wodurch unterschiedliche angebundene Liganden (TL) sichtbar werden, die Rezeptorkonformationen stabilisieren, die unterschiedliche Signalwege initiieren 9,13,14,15. Zum Beispiel wird bei dem am besten untersuchten Mitglied der Unterfamilie, PAR1, die Spaltung durch Thrombin verwendet, um zahlreiche biologische Prozesse zu unterstützen, einschließlich der Thrombozytenaktivierung und der Leukozytenrekrutierung in das Endothel, kann aber zu schädlichen Effekten führen, wenn der Rezeptor überexprimiert oder überaktiviert wird 4,16,17,18,19,20,21 . Umgekehrt kann die Spaltung durch aktiviertes Protein C (aPC) die entzündungshemmende Wirkung und die Aufrechterhaltung der Endothelbarrieren fördern 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PARs können auch durch Peptidanaloga der TLs intermolekular aktiviert werden 13,30,31. Diese Peptide werden routinemäßig zur Messung der PAR-Hemmung (Modulation) anstelle von PAR-Targeting-Proteasen verwendet, und sie werden in diesem Protokoll verwendet.

Zahlreiche Erkrankungen sind mit pathologischer PAR1-Signalgebung verbunden, darunter Sepsis22,32, Herz-Kreislauf-Erkrankungen 33,34,35,36,37,38, Nierenerkrankungen 39,40,41,42, Sichelzellanämie 43, Fibrose44, Osteoporose und Osteoarthritis45,46, Neurodegeneration 47,48,49,50,51 und Krebs 52,53,54,55,56,57,58,59. Antagonisten von PAR1 werden seit den 1990er Jahren als Thrombozytenaggregationshemmer für Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersucht, und die wachsende Liste von Krankheiten, die mit dem Rezeptor in Verbindung gebracht werden, erfordert die Identifizierung neuartiger Liganden für den Einsatz als biologische Sonden (Werkzeugverbindungen) oder als potenzielle Therapeutika. Derzeit gibt es nur einen von der FDA zugelassenen PAR1-Antagonisten, Vorapaxar, der zur Behandlung der koronaren Herzkrankheit bei Hochrisikopatienten eingesetzt wird 34,36,37,60. Ein alternativer PAR1-Antagonist, das Pepducin PZ-128, schloss eine erfolgreiche Phase-II-Studie zur Thromboseprävention bei Herzkatheterpatienten ab38. Die Arbeitsgruppe Dockendorff hat sich auf die medizinische Chemie und Pharmakologie einer separaten Klasse von kleinen Molekülen, den PAR1-Liganden, den Parmodulinen61,62, konzentriert. Im Gegensatz zu berichteten PAR1-Antagonisten wie Vorapaxar sind Parmoduline allosterische, verzerrte Modulatoren von PAR1, die selektiv denG-αq-Signalweg blockieren und gleichzeitig zytoprotektive Effekte ähnlich wie aPC fördern. Im Gegensatz zu potenten orthosterischen PAR1-Antagonisten wie Vorapaxar sind publizierte Parmoduline auch reversibel 63,64,65.

Zunächst wurden Parmoduline von Flaumenhaft und Mitarbeitern hinsichtlich ihrer Fähigkeit identifiziert, die P-Selektin-Expression oder die Granulsekretion in Blutplättchen zu hemmen61,66. Es war jedoch eine alternative Methode erforderlich, um die Auswirkungen von Parmodulinen auf Endothelzellen zu untersuchen. Eine gängige Methode zur Überwachung der GPCR-bezogenen Signalübertragung ist die Messung der intrazellulären Ca2+-Mobilisierung, eines wichtigen sekundären Botenstoffs, der mit einem geeigneten intrazellulären Kalziumbindungsfarbstoff gemessen werden kann67,68. Es wurden substanzielle Beweise dafür vorgelegt, dass die durch PAR1 induzierte Calciummobilisierung durch die Aktivierung von Gαq 69,70 erfolgt. Sobald PAR1 durch seinen angebundenen Liganden (oder einen geeigneten exogenen Liganden) aktiviert wird, erfährt es eine Konformationsänderung, die dazu führt, dass Guanosindiphosphat (GDP), das an die Gαq-Untereinheit gebunden ist, durch Guanosintriphosphat (GTP) ersetzt wird68. Die Gαq-Untereinheit aktiviert dann die Phospholipase Cβ (PLC-β), die die Hydrolyse von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) katalysiert und 1,4,5-Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG) bildet. Schließlich bindet IP3 an IP3-empfindliche Ca2+-Kanäle in der Membran des endoplasmatischen Retikulums, wodurch Ca2+ in das Zytoplasma freigesetzt werden kann, wo es anCa2+-abhängige Fluoreszenzfarbstoffe wie Fluo-4 binden kann, die den Zellen zugesetzt werden71. Dieser Prozess findet innerhalb von Sekunden statt und kann die Konzentration von Ca2+ um das 100-fache erhöhen, was zu einer drastischen Veränderung der Menge an calciumgebundenem Farbstoff und einem robusten Fluoreszenzsignal führt.

Im Jahr 2018 stellte die Dockendorff-Gruppe einen Ca2+ -Mobilisierungsassay mit mittlerem Durchsatz vor, der zur Identifizierung von Antagonisten desG-αq-Signalwegs von PAR172 verwendet werden konnte. Der Assay verwendete EA.hy92673, eine hybride humane Endothelzelllinie, die für mehrere Passagen ohne merkliche Veränderung der PAR1-Expression verwendet werden kann und für In-vitro-Messungen zytoprotektiver Wirkungen etabliert ist.

Das ursprüngliche Protokoll verwendete EA.hy926-Zellen in 96-Well-Platten, die mit Fluo-4/AM-Farbstoff beladen waren, der aufgrund seiner intensiven Fluoreszenz bei 488 nm und seiner hohen Zellpermeabilität ausgewählt wurde. Nachdem der Farbstoff in die Zellen geladen war, wurden langwierige Waschschritte mit einem automatisierten 8-Kanal-Liquid-Handler durchgeführt (schnellere Methoden des Liquid Handlings, wie z. B. ein 96-Kanal-Wascher, waren nicht zugänglich). Die Reproduzierbarkeit dieses Assays war besser als die ohne den sorgfältigen, automatisierten robotischen Medienwechsel. Antagonisten wurden dann mit den Zellen inkubiert, PAR1 wurde durch die sequentielle Zugabe eines selektiven Agonisten (jeweils 16 Wells) aktiviert, und Veränderungen der Fluoreszenz infolge der Kalziummobilisierung und Farbstoffbindung wurden gemessen, um die Aktivität zu bestimmen.

Dieses Protokoll ermöglicht zwar die Messung der PAR1-vermittelten Kalziummobilisierung, ist jedoch durch die Zeit begrenzt, die für den Assay jeder 96-Well-Platte erforderlich ist. Lange Experimentierzeiten sind nicht nur deshalb problematisch, weil die Anzahl der Verbindungen, die täglich gescreent werden können, begrenzt ist, sondern auch, weil der Farbstoffausfluss im Laufe der Zeit auftritt und das Assay-Fenster durch Erhöhung der basalen Fluoreszenz verengt. Ein Beitrag zur langen Versuchszeit ist die Verwendung eines 8-Kanal-Liquid-Handlers für die Plattenreinigung, der jedes Experiment um mehr als 30 Minuten verlängert. Die erforderlichen Trinkgelder wurden auch aufgrund von Problemen in der Lieferkette schwierig. Hier wird über ein aktualisiertes Protokoll für den PAR-vermittelten Calciummobilisierungsassay berichtet, der keinen Liquid Handler benötigt und daher mit höherem Durchsatz ausgeführt werden kann. Dieses Protokoll sollte auch für die Messung der Signalübertragung mit anderen GPCRs geeignet sein, die zu einer intrazellulären Kalziummobilisierung führen. Dieses aktualisierte Plattenleseprotokoll ist ideal für akademische und kleine industrielle Labore, die nicht über die Ressourcen für teure Zellbildgebungsinstrumente verfügen, aber zahlreiche Verbindungen schnell screenen müssen. Ein Beispiel für einen Calciummobilisierungsassay mit einem Plate Imager finden Sie unter Caers et al.74.

Protokoll

Alle in den Schritten 1 und 2 des folgenden Protokolls vorgenommenen Medienaustausche/-ergänzungen werden in einer sterilen Haube durchgeführt. Sofern nicht anders angegeben, müssen alle Kunststoffe, die in der sterilen Haube verwendet werden, sterilisiert und versiegelt gekauft oder ordnungsgemäß im Autoklaven sterilisiert werden.

1. Initiierung der EA.hy926-Zelllinie

  1. Erwerben Sie EA.hy926-Zellen.
  2. Lagern Sie Fläschchen mit Zellen in der Dampfphase eines Flüssigstickstofftanks.
  3. Bereiten Sie das DMEM-Komplettmedium vor, indem Sie zuerst DMEM, FBS und Stift/Streptokokken (siehe Materialtabelle für spezifische Details) in einem 37 °C warmen Wasserbad für 15-30 Minuten erwärmen. Fügen Sie 50 mL FBS und 1 mL Pen/Streptokokken zu 500 mL DMEM hinzu. Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Inversion.
    HINWEIS: Zu starkes Mischen führt zu übermäßiger Menge an Blasen.
  4. Nehmen Sie ein Fläschchen mit Zellen aus flüssigem Stickstoff und erwärmen Sie es 5 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad.
  5. Sterilisieren Sie das Fläschchen mit den Zellen und die Flasche mit dem DMEM-Komplettmedium, indem Sie es mit Alkohol besprühen, und begeben Sie es dann in die Sterilhaube.
  6. Verwenden Sie eine 1.000-μl-Pipette, um die Zellen vorsichtig in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen zu überführen. Geben Sie 1 ml DMEM in die Durchstechflasche, spülen Sie sie und geben Sie sie in das Zentrifugenröhrchen.
  7. Mit einer Zentrifuge (150 × g, 5 min, 22 °C) wird ein Pellet aus Zellen hergestellt. Entfernen Sie das Medium durch Aspiration aus dem Zentrifugenröhrchen; Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören.
  8. Geben Sie 3 mL DMEM-Komplettmedium in das Zentrifugenröhrchen und brechen Sie das Pellet vorsichtig auf, indem Sie die Zellsuspension mit einer 1.000-μl-Pipette mischen.
    HINWEIS: Blasenbildung durch zu starkes Mischen sollte vermieden werden, da dies die Zellen aktivieren oder schädigen könnte.
  9. Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau in einem Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Pipette mit 20 μl oder 200 μl Spitzen. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension/Trypanblau-Mischung in ein Hämozytometer und zählen Sie die Zellen.
    HINWEIS: Die Verwendung von 0,1-10 μl Pipettenspitzen kann die Zellen scheren. Spitzen dieser Größe sollten beim Umgang mit der Zellsuspension nicht verwendet werden.
  10. Geben Sie DMEM-Komplettmedium in die Zellsuspension, um eine Dichte von 66.000 Zellen/ml mit einer serologischen 10- oder 25-ml-Pipette zu erreichen. Pipettieren Sie 15 ml der Zellsuspension in einen oder mehrere T-75-Kulturflaschen. Eine gleichmäßige Verteilung der Zellsuspension wird gewährleistet, indem der Kolben von Norden nach Süden und von Osten nach Westen bewegt wird.
  11. Inkubieren Sie die Zellen, bis sie die Konfluenz erreichen (typischerweise nach 4-6 Tagen), wie durch Untersuchung unter einem Mikroskop geschätzt. Verwenden Sie zu diesem Zeitpunkt die Zellen im Experiment (beginnend mit Abschnitt 2) oder säen Sie sie zur Expansion in neue Kolben aus, um gefrorene Brühen vorzubereiten (bei einer empfohlenen Aussaatdichte von 1.000.000 Zellen in 15 ml vollständigem Medium pro T-75-Kolben).
    HINWEIS: Zellen können bis zu 3 Wochen lang in den Kulturflaschen gezüchtet werden, ohne dass es zu einem merklichen Unterschied in Form, Gesundheit oder Leistung im Assay kommt. Das komplette Medium sollte alle 3-4 Tage ausgetauscht werden.

2. Zugabe von EA.hy926-Zellen zu 96-Well-Platten

HINWEIS: Zellen aus einem konfluenten T-75-Kulturkolben können zur Vorbereitung von zwei oder drei Assay-Platten verwendet oder optional in bis zu 15 frische T-75-Kolben erweitert werden. Mindestens fünf Assay-Platten können an einem normalen Arbeitstag nach dem Protokoll in den Abschnitten 4 und 5 gescreent werden. Die folgenden Anweisungen beschreiben das Vorbereiten und Testen einer Assay-Platte, aber zusätzliche Platten können durch Wiederholen der Schritte 2.2, 2.7, 2.12 und 3.2 vorbereitet werden, um die gewünschte Anzahl von Assay-Platten vorzubereiten. In der Regel werden vier Assay-Platten pro Tag hergestellt, um die Konzentrationsreaktionen mit bis zu 16 Verbindungen zu messen, wofür zwei T-75-Kolben mit konfluenten Zellen erforderlich sind.

  1. DMEM complete medium in einem 37 °C Wasserbad für 15-30 min erwärmen. Sterilisieren Sie die Flasche mit DMEM complete medium, indem Sie sie mit Alkohol besprühen, und stellen Sie sie dann in die sterile Haube.
  2. Geben Sie 100 μl einer sterilisierten 0,4%igen Gelatinelösung in alle Vertiefungen einer schwarzwandigen 96-Well-Platte mit klarem Boden und Deckel. Die Platte mit der Gelatinelösung in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2) 30 min inkubieren.
  3. Bestätigen Sie mit einem inversen Mikroskop, dass die Zellen in einem T-75-Kulturkolben zu 80-100 % konfluent sind. Entfernen Sie das DMEM-Komplettmedium durch Aspiration aus dem T-75-Kolben.
  4. Waschen Sie die Zellen im Kolben mit 10 mL PBS und bewegen Sie den Kolben vorsichtig von Norden nach Süden und von Osten nach Westen. Entfernen Sie das PBS durch Aspiration aus dem Kolben.
  5. Geben Sie 5 mL Zelldissoziationslösung in den Kolben und inkubieren Sie den Kolben in einem Inkubator (37 °C, 5% CO2) für ~12 min. Klopfen Sie nach 6 Minuten auf die Flasche, um die Dissoziation zu erleichtern.
    HINWEIS: Eine Inkubation von Zellen für einen Zeitraum von mehr als 15 Minuten mit dem referenzierten Zelldissoziationsmittel führt dazu, dass die Zellen zu verklumpen beginnen, was die Erzielung einer genauen Zellzahl erschwert und den Assay beeinträchtigen kann.
  6. 5 ml des vorgewärmten DMEM-Alleinmediums in den Kolben geben und vorsichtig in die Zelldissoziationslösung/Zellsuspension einmischen. Geben Sie die Zellsuspension mit einer serologischen 10-ml-Pipette in ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Mit einer Zentrifuge (150 × g, 5 min, 22 °C) wird ein Pellet aus Zellen hergestellt.
  7. Während das Pellet gebildet wird, entfernen Sie die Gelatinelösung durch Aspiration mit einer Pasteurpipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist, aus der 96-Well-Platte. Entfernen Sie den Plattendeckel ab dem Zeitpunkt der Gelatineentfernung, bis die Lösung bereit zum Plattieren ist.
    HINWEIS: Optional kann eine Mehrkanalpipette oder ein steriler Verteiler verwendet werden, der an ein Vakuum angeschlossen ist.
  8. Entfernen Sie das Medium aus dem Zentrifugenröhrchen durch Aspiration mit einer Pasteurpipette, die an ein Vakuum angeschlossen ist, oder einer serologischen Pipette; Achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören.
  9. Geben Sie frisches DMEM-Komplettmedium mit einer serologischen 5- oder 10-ml-Pipette in das Zentrifugenröhrchen. Brechen Sie das Zellpellet vorsichtig auf, indem Sie das DMEM-Komplettmedium mit einer 1.000-μl-Pipette oder einer serologischen 5-ml-Pipette mischen.
    HINWEIS: In der Regel werden acht Milliliter DMEM verwendet, aber es können auch höhere Volumina hinzugefügt werden, um die Zellzählung zu erleichtern.
  10. Mischen Sie 10 μl der Zellsuspension mit 10 μl Trypanblau in einem Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Pipette mit 20 μl oder 200 μl Spitzen. Geben Sie 10 μl der Zellsuspension/Trypanblau-Mischung in ein Hämozytometer und zählen Sie die Zellen.
  11. Geben Sie DMEM-Komplettmedium in die Zellsuspension, um eine Dichte von 600.000 Zellen/ml mit einer serologischen 10- oder 25-ml-Pipette zu erreichen. Dies ergibt eine endgültige Dichte von 60.000 Zellen/Well in einer 96-Well-Platte (die durch Experimente als optimale Dichte bestimmt wurde).
    HINWEIS: Eine normale erfolgreiche Zellkultur ergibt zwischen 12.000.000 und 15.000.000 Zellen, die zwei bis drei 96-Well-Platten aussäen können.
  12. Mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie das Zentrifugenröhrchen vorsichtig umdrehen und in ein 50-ml-Mehrkanal-Pipettenreservoir geben. Mischen Sie die Suspension alle 30 s im Reservoir, indem Sie das Reservoir vorsichtig von einer Seite zur anderen bewegen, und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl der Zellsuspension in jede Vertiefung. Setzen Sie die transparente Plattenabdeckung wieder auf und schütteln Sie die Platte vorsichtig, indem Sie sie auf der Oberfläche der Sterilhaube von Norden nach Süden und von Osten nach Westen schieben, um eine gleichmäßige Zellverteilung zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Platte im Inkubator (37 °C, 5 % CO2) für 16-24 h.
    HINWEIS: Zusätzliche Zellsuspension kann verwendet werden, um zusätzliche Platten vorzubereiten, oder die Schritte 1.10-1.11 können wiederholt werden, um die Zelllinie fortzusetzen.

3. Vorbereitung des Calcium-Mobilisierungsassays

  1. Bereiten Sie die Assay-Reagenzien vor.
    1. Bereiten Sie Sondenecidlösung (250 mM, wässrig) vor, indem Sie 36 mg Probenecid in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und in 0,6 M NaOH (500 μL) auflösen. Vortex die Lösung.
      HINWEIS: Probenecid verbessert die Retention von Farbstoff in der Zelle, indem es organische Ionentransporter hemmt 75,76,77.
    2. Um HBSS-HEPES-Assay-Puffer herzustellen, fügen Sie HEPES (1,19 g) zu einer 500-ml-Flasche Ca/Mg/phenolrot-freiem HBSS hinzu (wodurch eine 10-mM-Lösung von HEPES hergestellt wird). Ergänzen Sie den Puffer mit MgCl2 (1 M wässrige Lösung, 500 μL) und CaCl2 (1 M wässrige Lösung, 500 μL). Die Lösung mischen und bei Nichtgebrauch bei 5 °C im Kühlschrank lagern.
      1. Geben Sie für jede 96-Well-Platte 50 ml des HBSS-HEPES-Assay-Puffers in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, ergänzen Sie es mit 500 μl der Probenecid-Lösung und mischen Sie es gut. Erwärmen Sie den Puffer vor der Verwendung auf Raumtemperatur.
    3. Stellen Sie eine 10%ige Pluronic F-127-Lösung in DMSO her, indem Sie Pluronic F-127 (20 mg) in ein Mikrozentrifugenröhrchen oder HPLC-Fläschchen geben und mit 200 μl DMSO auflösen.
      HINWEIS: Diese Lösung kann bei Raumtemperatur gelagert werden und reicht für ca. 30 Platten. Pluronic F-127 löst sich bei Raumtemperatur sehr langsam auf und sollte sanft erhitzt werden, um die Auflösung zu erleichtern.
    4. Bereiten Sie den Farbstoffladepuffer vor, indem Sie zuerst 24 μl DMSO in ein Fläschchen mit Fluo-4/AM (50 μg) geben, um den Farbstoff aufzulösen. In ein folienumwickeltes 15-ml-Zentrifugenröhrchen 6 ml HBSS-HEPES-Assay-Puffer geben und mit 6 μl 10 % Pluronic F-127 und 6 μl Fluo-4/AM-Lösung ergänzen. Die Lösung kurz vortexen und 10 Minuten bei Raumtemperatur ohne Licht ziehen lassen.
      HINWEIS: Um ein Photobleichen von Fluo-4 zu verhindern, halten Sie den Farbstoff vor Licht geschützt, indem Sie Aluminiumfolie um das Zentrifugenröhrchen mit der Farbstofflösung und den Deckel der Testplatte wickeln.
  2. Bereiten Sie die Assay-Platten vor.
    1. Nehmen Sie die Assay-Platte aus dem Inkubator und bestätigen Sie die Konfluenz mit einem inversen Mikroskop. Entfernen Sie das DMEM-Komplettmedium manuell, indem Sie es in ein Waschbecken schnippen und die Oberseite der Platte mit einem Papiertuch abtupfen.
      HINWEIS: Das Medium wird ausreichend entfernt, indem Sie die Platte waagerecht halten und schnippen, gefolgt von einer Drehung der Platte um 180° und einer Wiederholung.
    2. Geben Sie den HBSS-HEPES-Assay-Puffer plus Probenecid-Lösung in ein 50-ml-Mehrkanal-Pipetten-Lösungsmittelreservoir.
      HINWEIS: Diese Lösung wird für spätere Waschschritte verwendet und sollte beiseite gelegt und bis zur Verwendung mit Alufolie abgedeckt werden.
    3. Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μl des HBSS-HEPES-Assay-Puffers plus Probenecid-Lösung in jede Vertiefung und lassen Sie die Zellen 5 Minuten lang in Gegenwart von Probenecid ruhen. Entfernen Sie den HBSS-HEPES-Assay-Puffer, indem Sie ihn auf die gleiche Weise wie in Schritt 3.2.1 in die Spüle schnippen.
    4. Geben Sie den Farbstoffladepuffer in ein separates 50-ml-Mehrkanal-Pipetten-Lösungsmittelreservoir. Geben Sie 50 μl des Farbstoffladepuffers mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung der Assay-Platte. Die Platte 45 min lang inkubieren (37 °C, 5 % CO2).
    5. Während sich die Platte im Inkubator befindet, bereiten Sie die Agonisten-/Antagonistenlösungen vor.
      1. Antagonistenlösungen werden als 31,6 mM-Lösungen in DMSO gespeichert. In einem PCR-Röhrchen verdünnen Sie 2 μl der Stammlösung mit 38 μl 0,1 % BSA/Wasser, um eine 1,58 mM-Lösung zu erhalten. 2 μl dieser Lösung ergeben eine Endkonzentration von 31,6 μM in der Assay-Platte. 4 μl der 1,58 mM Antagonistenlösung mit 36 μl 5 % DMSO/Wasser (ohne BSA-Zusatz) verdünnen und die restlichen Konzentrationen durch serielle Verdünnungen vorbereiten.
      2. Bereiten Sie eine 108,3 μM (16,7x) Lösung von TFLLRN-NH2 in HBSS-HEPES-Assay-Puffer vor, die eine Endkonzentration von 6,5 μM ergibt, wenn 6 μl in jede Vertiefung der Assay-Platte gegeben werden. Lösen Sie beispielsweise ein 2 mg Aliquot von TFLLRN-NH2 mit 5,244 ml HBSS-HEPES-Assay-Puffer auf, um eine 0,5 mM Stammlösung zu erhalten. Mischen Sie 1,083 mL dieser Lösung mit 3,917 mL HBSS-HEPES-Assay-Puffer , um eine 108,3 μM Lösung zu erhalten.
        HINWEIS: TFLLRN-NH2-Lösungen sollten bei Nichtgebrauch in einem Gefrierschrank bei -20 °C gelagert werden.
    6. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und stellen Sie die Farbstoffaufnahme sicher, indem Sie ein Fluoreszenzmikroskop in einer geeigneten Einstellung verwenden (typischerweise für grün fluoreszierendes Protein, siehe Abbildung 1 für ein Beispiel für Fluo-4, das erfolgreich in Zellen geladen wurde). Entfernen Sie den Farbladepuffer, indem Sie die Platte auf die gleiche Weise wie in Schritt 3.2.1 schnippen.
    7. Waschen Sie die Zellen 2x mit 50 μl des HBSS-HEPES-Assay-Puffers plus Probenecid-Lösung (aus Schritt 3.2.3) in jeder Vertiefung (entfernen Sie sie durch Schnippen von Medium in die Spüle).
    8. Geben Sie 92 μl HBSS-HEPES-Assay-Puffer in jede Vertiefung und betrachten Sie die Zellen erneut mit einem Fluoreszenzmikroskop, um sicherzustellen, dass der überschüssige Farbstoff vollständig entfernt wurde und die Zellen adhärent bleiben.
    9. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 2 μl der Antagonistenlösungen und des Vehikels in die entsprechenden Vertiefungen zu geben (siehe Tabelle 1 für eine repräsentative Plattenkarte).

4. Durchführung des Kalziummobilisierungsassays

  1. Stellen Sie den Plattenleser wie folgt ein: Temperatur: 37 °C; Anregungswellenlänge: 485 nm; Emissionswellenlänge: 525 nm; Messhöhe: 7,8 mm (optimiert); Anzahl der Blitze: 100; Anzahl der Wiederholungen: 20.
  2. Inkubieren Sie die Platte 15 min lang im Plattenleser bei 37 °C. Messen Sie die Hintergrundfluoreszenz in den Spalten 1 und 2 (fünf Scans pro Well).
  3. Werfen Sie die Platte aus dem Plattenlesegerät aus und geben Sie mit einer Mehrkanalpipette schnell 6 μl Agonistenlösung in jede Vertiefung in den Spalten 1 und 2 aus einem PCR-Streifen mit 8 Röhrchen.
    HINWEIS: Für diesen Schritt verwenden wir eine elektronische 8-Kanal-Pipette mit 0,1-10 μl Pipettenspitzen.
  4. Messen Sie die Änderung der Fluoreszenz, wenn die Kalziummobilisierung in den Zellen stattfindet. Führen Sie 20 Scans jeder Vertiefung gemäß den obigen Einstellungen durch.
    HINWEIS: Das Scannen jedes Wells in zwei Spalten mit jeweils 20x dauert ca. 5 Minuten (d. h. ~15 s zwischen den Scans jedes Wells).
  5. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.4 für die Spalten 3 bis 12 in zwei Spaltenschritten.

5. Datenanalyse

  1. Exportieren Sie Daten aus dem Assay als separate Tabellenkalkulationen für jede zweispaltige Gruppe.
  2. Ermitteln Sie den Durchschnitt der basalen Fluoreszenzmesswerte mit der Funktion AVG (erster Scan: letzter Scan). Tun Sie dies für jede Vertiefung in beiden Spalten.
  3. Ermitteln Sie die maximale Fluoreszenz nach Zugabe eines Agonisten mit der Funktion MAX (erster Scan: letzter Scan).
  4. Berechnen Sie die Änderung der Fluoreszenz, indem Sie die basale Fluoreszenz von der maximalen Fluoreszenz subtrahieren.
  5. Subtrahieren Sie die für die Negativkontrolle berechnete Änderung der Fluoreszenz (Addition eines Vehikels ohne Agonist) von jeder Vertiefung in derselben Spalte.
  6. Ermitteln Sie die relative (normalisierte) Änderung der Fluoreszenz, indem Sie die Fluoreszenzänderung in jedem Well durch die Änderung der Fluoreszenz im Vehikel (0,1 % DMSO/Wasser) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 teilen.
  7. Kopieren Sie die Nicht-Kontrollwerte als Prozentsätze in ein Statistik- und Grafiksoftwareprogramm. Wenn Sie die referenzierte Software verwenden, wählen Sie die Option XY-Tabelle, wobei die Zahlen als X-Achse ausgewählt sind und die Werte in nebeneinander liegenden Unterspalten als Y-Achse repliziert werden.
  8. Verwenden Sie das Programm, um Konzentrations-Wirkungs-Kurven (CRCs) aus den Daten zu zeichnen. Wenn Sie die referenzierte Software verwenden, wählen Sie die Option log(inhibitor) vs. response - Variable slope (four parameters).

Ergebnisse

Der Zweck dieses Assays besteht im Allgemeinen darin, Konzentrations-Wirkungs-Kurven (CRCs) für drei bis vier neue Parmoduline zu erstellen. Auf jeder Assay-Platte wird oft ein zusätzlicher CRC für eine bekannte Verbindung, wie z.B. NRD-21, erzeugt, der aufgrund seines bekannten IC50 als Qualitätscheck für das Experiment dient. Zur Generierung von CRCs sollte eine Plattenkarte, wie sie in Tabelle 1 dargestellt ist, geplant werden. Wenn stattdessen Einzelp...

Diskussion

Während das zuvor berichtete Protokoll72 im Allgemeinen zuverlässig war und es uns ermöglichte, ein neues Leitparmodulin zu identifizieren, war NRD-21,62 ein effizienteres Protokoll gewünscht. Der Assay wurde während der durch die COVID-19-Pandemie verursachten Lieferengpässe weiter beeinträchtigt. Die Beschaffung von Spitzen für den automatisierten Liquid Handler wurde schwierig, und der Versuch, die Spitzen zu waschen, zu sterilis...

Offenlegungen

C.D. ist Erfinder von Patenten mit Parmodulinen und Gründer und Anteilseigner von Function Therapeutics, Inc., das Parmoduline für den klinischen Einsatz entwickelt.

Danksagungen

Wir danken Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) und Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) für die Bereitstellung von Raum und indirekter Unterstützung dieses Projekts sowie Dr. John McCorvy (Medical College of Wisconsin) für sachdienliche Beratung. Wir danken dem National Heart, Lung, and Blood Institute (R15HL127636), dem U.S. Department of Defense (W81XWH22101) und der National Science Foundation (2223225) für die Unterstützung durch die Zuschüsse.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

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