Caracterización de moduladores de receptores activados por proteasas con un ensayo de movilización de calcio mediante un lector de placas

Resumen

Se ha desarrollado un protocolo mejorado para un ensayo de movilización de calcio con células endoteliales, utilizado para identificar ligandos de receptores activados por proteasas (PAR). El nuevo protocolo reduce el tiempo total de ensayo entre 90 y 120 minutos y produce curvas de concentración-respuesta reproducibles.

Resumen

Los cambios en la concentración de calcio en las células se monitorean rápidamente de una manera de alto rendimiento con el uso de tintes intracelulares, fluorescentes que se unen al calcio e instrumentos de imagen que pueden medir las emisiones fluorescentes de hasta 1.536 pocillos simultáneamente. Sin embargo, estos instrumentos son mucho más caros y pueden ser difíciles de mantener en comparación con los lectores de placas ampliamente disponibles que escanean los pocillos individualmente. Aquí se describe un ensayo de lector de placas optimizado para su uso con una línea celular endotelial (EA.hy926) para medir la activación impulsada por el receptor activado por proteasa (PAR) de la señalización G_αq y la posterior movilización de calcio utilizando el colorante de unión al calcio Fluo-4. Este ensayo se ha utilizado para caracterizar una variedad de ligandos PAR, incluidos los ligandos antiinflamatorios "parmodulina" alostéricos dirigidos a PAR1 identificados en el laboratorio de Dockendorff. Este protocolo evita la necesidad de un manipulador de líquidos automatizado y permite el cribado de ligandos PAR en placas de 96 pocillos y debería ser aplicable al estudio de otros receptores que inician la movilización del calcio.

Introducción

Los receptores activados por proteasas (PAR)^1,2,3 son una subfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de clase A que se expresan en una variedad de tipos de células, incluidas las plaquetas y las células endoteliales ^4,5,6,7. A diferencia de la mayoría de los GPCR, los PAR tienen un modo de activación intramolecular único. La mayoría de los GPCR son activados por ligandos solubles que interactúan con un ....

Protocolo

Todos los intercambios/adiciones de medios realizados en los pasos 1 y 2 del siguiente protocolo se realizan en una campana estéril. A menos que se indique lo contrario, todos los utensilios de plástico utilizados en la campana estéril deben comprarse esterilizados y sellados o esterilizarse adecuadamente a través de un autoclave.

1. Inicio de la línea celular EA.hy926

1. Adquiera las celdas EA.hy926.
2. Almacene los viales de celdas en la fase de vapor de un tanque de nitrógeno líquido.
3. Prepare el medio completo DMEM calentando primero DMEM, FBS y pluma/estreptococo....

Resultados

El propósito de este ensayo es generalmente producir curvas de concentración-respuesta (CRC) para tres o cuatro nuevas parmodulinas. En cada placa de ensayo, a menudo se genera un CRC adicional para un compuesto conocido, como NRD-21, que actúa como un control de calidad para el experimento debido a su conocido IC₅₀. Para generar CRC, se debe planificar un mapa de placas como el que se muestra en la Tabla 1 . Si, en cambio, se desean respuestas de concentra.......

Discusión

Si bien el protocolo⁷² reportado anteriormente fue generalmente confiable y nos permitió identificar una nueva parmodulina principal, NRD-21,62, se deseaba un protocolo más eficiente. El ensayo se vio aún más comprometido durante la escasez de suministro causada por la pandemia de COVID-19. La adquisición de puntas para el manipulador automático de líquidos se volvió difícil, y el intento de lavar, esterilizar y reutilizar las punt.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells	ATCC	CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent	Corning	25-056-CI	Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-091
Gelatin from porcine skin	MilliporeSigma	G2500	Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)	Corning	30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)	Corning	25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Thermo	172571000
Bovine serum albumin (BSA)	Avantor	97061-420
Calcium chloride dihydrate	Thermo	42352-0250
Dimethyl sulfoxide	Thermo	J66650-AD
Fluo-4/AM	Invitrogen	F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)	Corning	21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate	MilliporeSigma	M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)	Spectrum Chemical	P1166
Probenecid	TCI America	P1975
Sodium hydroxide	VWR International	BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)			Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate	Corning	3603	with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL	Avantor	89039-664
Centrifuge tube, 50 mL	Avantor	89039-656
Culture flask, T-75	Corning	353136	tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL	Corning	RES-V-50-S
Enspire plate reader	Perkin Elmer		Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Avantor	20170-038
Pasteur pipette, 9"	Fisher	13-678-6B	must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips	Avantor	76318-802
Pipette tips, 20 µL	Biotix	63300042	sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL	Biotix	63300044	sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL	Biotix	63300047	sterile, filtered tips
Prism	GraphPad		volume 6 used
Serological pipette, 5 mL	Tradewinds Direct	07-5005
Serological pipette, 10 mL	Tradewinds Direct	07-5010
Serological pipette, 25 mL	Tradewinds Direct	07-5025