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  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se ha desarrollado un protocolo mejorado para un ensayo de movilización de calcio con células endoteliales, utilizado para identificar ligandos de receptores activados por proteasas (PAR). El nuevo protocolo reduce el tiempo total de ensayo entre 90 y 120 minutos y produce curvas de concentración-respuesta reproducibles.

Resumen

Los cambios en la concentración de calcio en las células se monitorean rápidamente de una manera de alto rendimiento con el uso de tintes intracelulares, fluorescentes que se unen al calcio e instrumentos de imagen que pueden medir las emisiones fluorescentes de hasta 1.536 pocillos simultáneamente. Sin embargo, estos instrumentos son mucho más caros y pueden ser difíciles de mantener en comparación con los lectores de placas ampliamente disponibles que escanean los pocillos individualmente. Aquí se describe un ensayo de lector de placas optimizado para su uso con una línea celular endotelial (EA.hy926) para medir la activación impulsada por el receptor activado por proteasa (PAR) de la señalización Gαq y la posterior movilización de calcio utilizando el colorante de unión al calcio Fluo-4. Este ensayo se ha utilizado para caracterizar una variedad de ligandos PAR, incluidos los ligandos antiinflamatorios "parmodulina" alostéricos dirigidos a PAR1 identificados en el laboratorio de Dockendorff. Este protocolo evita la necesidad de un manipulador de líquidos automatizado y permite el cribado de ligandos PAR en placas de 96 pocillos y debería ser aplicable al estudio de otros receptores que inician la movilización del calcio.

Introducción

Los receptores activados por proteasas (PAR)1,2,3 son una subfamilia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de clase A que se expresan en una variedad de tipos de células, incluidas las plaquetas y las células endoteliales 4,5,6,7. A diferencia de la mayoría de los GPCR, los PAR tienen un modo de activación intramolecular único. La mayoría de los GPCR son activados por ligandos solubles que interactúan con un bolsillo de unión distinto, pero los PAR son activados por la escisión proteolítica del N-terminal, lo que da como resultado un nuevo ligando atado que puede interactuar con el dominio del bucle extracelular 2 en la superficie de una célula 6,8,9. Esta interacción activa el receptor y puede iniciar varias vías de señalización, promoviendo efectos como la inflamación y la activación plaquetaria 4,10,11,12. Diferentes proteasas pueden activar PARs a través de la escisión en sitios únicos en el extremo N-terminal, revelando diferentes ligandos atados (TL) que estabilizan las conformaciones de los receptores, que inician diferentes vías de señalización 9,13,14,15. Por ejemplo, en el miembro más estudiado de la subfamilia, PAR1, la escisión por trombina se utiliza para apoyar numerosos procesos biológicos, incluida la activación plaquetaria y el reclutamiento de leucocitos al endotelio, pero puede provocar efectos deletéreos cuando el receptor se sobreexpresa o se sobreactiva 4,16,17,18,19,20,21 . Por el contrario, la escisión por la proteína C activada (aPC) puede promover efectos antiinflamatorios y mantenimiento de las barreras endoteliales 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Los PARs también pueden ser activados por análogos peptídicos de los TLs de forma intermolecular 13,30,31. Estos péptidos se utilizan de forma rutinaria para medir la inhibición (modulación) de PAR en lugar de las proteasas dirigidas a PAR, y se utilizan en este protocolo.

Numerosos trastornos se asocian con la señalización patológica de PAR1, incluyendo sepsis22,32, enfermedad cardiovascular 33,34,35,36,37,38, enfermedad renal 39,40,41,42, enfermedad de células falciformes43, fibrosis44, osteoporosis y osteoartritis45,46, neurodegeneración 47,48,49,50,51 y cáncer 52,53,54,55,56,57,58,59. Los antagonistas de PAR1 se han estudiado desde la década de 1990 como agentes antiplaquetarios para las enfermedades cardiovasculares, y la creciente lista de enfermedades asociadas con el receptor requiere la identificación de nuevos ligandos para su uso como sondas biológicas (compuestos herramienta) o como posibles terapias. Actualmente, solo existe un antagonista de PAR1 aprobado por la FDA, vorapaxar, que se usa para tratar la enfermedad de las arterias coronarias en pacientes de alto riesgo 34,36,37,60. Un antagonista alternativo de PAR1, la pepducina PZ-128, completó con éxito un estudio de fase II para prevenir la trombosis en pacientes con cateterismo cardíaco38. El grupo de Dockendorff se ha centrado en la química medicinal y la farmacología de una clase separada de moléculas pequeñas, los ligandos PAR1 conocidos como parmodulinas 61,62. A diferencia de los antagonistas de PAR1 reportados, como el vorapaxar, las parmodulinas son moduladores alostéricos y sesgados de PAR1 que bloquean selectivamente la vía Gαq mientras promueven efectos citoprotectores similares a los de aPC. A diferencia de los potentes antagonistas ortostéricos de PAR1 como el vorapaxar, las parmodulinas publicadas también son reversibles 63,64,65.

Inicialmente, las parmodulinas fueron identificadas por Flaumenhaft y colaboradores por su capacidad para inhibir la expresión de P-selectina o la secreción de gránulos en plaquetas61,66. Sin embargo, se requería un método alternativo para estudiar los efectos de las parmodulinas en las células endoteliales. Un método común para monitorear la señalización relacionada con GPCR es medir la movilización intracelular de Ca2+, un mensajero secundario importante que se puede medir utilizando un colorante intracelular adecuado que se une al calcio67,68. Se han proporcionado pruebas sustanciales que demuestran que la movilización de calcio inducida por PAR1 se produce a través de la activación de Gαq 69,70. Una vez activado por su ligando anclado (o un ligando exógeno adecuado), PAR1 sufre un cambio conformacional que hace que el difosfato de guanosina (GDP) unido a la subunidadG αq sea reemplazado por trifosfato de guanosina (GTP)68. A continuación, la subunidadG αq activa la fosfolipasa Cβ (PLC-β), que cataliza la hidrólisis del fosfatidilinositol 4,5 bisfosfato (PIP2), formando trifosfato de 1,4,5-inositol (IP3) y diacilglicerol (DAG). Finalmente, IP3 se une a los canales de Ca2+ sensibles a IP3 en la membrana del retículo endoplásmico, lo que permite que el Ca2+ se libere en el citoplasma, donde puede unirse a colorantes fluorescentes dependientes de Ca2+, como Fluo-4, que se agregan a las células71. Este proceso ocurre en segundos y puede aumentar la concentración de Ca2+ 100 veces, lo que lleva a un cambio drástico en la cantidad de tinte unido al calcio y una señal de fluorescencia robusta.

En 2018, el grupo de Dockendorff reveló un ensayo de movilización de Ca2+ de rendimiento medio que podría usarse para identificar antagonistas de la vía Gαq de PAR172. El ensayo utilizó EA.hy92673, una línea celular endotelial humana híbrida, que se puede usar para múltiples pasajes sin un cambio notable en la expresión de PAR1, y se establece para mediciones in vitro de efectos citoprotectores.

El protocolo original utilizó células EA.hy926 en placas de 96 pocillos y cargadas con colorante Fluo-4/AM, que se eligió debido a su intensa fluorescencia a 488 nm y su alta permeabilidad celular. Una vez que el tinte se cargaba en las celdas, se realizaban largos pasos de lavado con un manipulador de líquidos automatizado de 8 canales (los métodos más rápidos de manejo de líquidos, como una lavadora de 96 canales, eran inaccesibles). La reproducibilidad de este ensayo fue superior a la que se produjo sin los cambios cuidadosos y automatizados de medios robóticos. A continuación, se incubaron antagonistas con las células, PAR1 se activó mediante la adición secuencial de un agonista selectivo (16 pocillos a la vez) y se midieron los cambios en la fluorescencia resultantes de la movilización del calcio y la unión del colorante para determinar la actividad.

Si bien este protocolo permite la medición de la movilización de calcio mediada por PAR1, está limitado por el tiempo requerido para analizar cada placa de 96 pocillos. Los largos tiempos de experimentación son problemáticos no solo porque el número de compuestos que se pueden analizar cada día es limitado, sino también porque el flujo de colorante se produce con el tiempo, lo que reduce la ventana de ensayo al aumentar la fluorescencia basal. Un factor que contribuye al largo tiempo del experimento es el uso de un manipulador de líquidos de 8 canales para el lavado de placas, que agrega más de 30 minutos a cada experimento. Las propinas requeridas también se volvieron difíciles de obtener debido a problemas en la cadena de suministro. Aquí se informa de un protocolo actualizado para el ensayo de movilización de calcio mediado por PAR que no requiere un manipulador de líquidos y, por lo tanto, puede ejecutarse con un mayor rendimiento. Este protocolo también debería ser adecuado para medir la señalización con otros GPCR que conducen a la movilización de calcio intracelular. Este protocolo de lector de placas actualizado es ideal para laboratorios académicos y pequeños laboratorios industriales que no tienen los recursos para costosos instrumentos de imágenes celulares, pero tienen la necesidad de analizar rápidamente numerosos compuestos. Para un ejemplo de un ensayo de movilización de calcio utilizando un generador de imágenes en placas, véase Caers et al.74.

Protocolo

Todos los intercambios/adiciones de medios realizados en los pasos 1 y 2 del siguiente protocolo se realizan en una campana estéril. A menos que se indique lo contrario, todos los utensilios de plástico utilizados en la campana estéril deben comprarse esterilizados y sellados o esterilizarse adecuadamente a través de un autoclave.

1. Inicio de la línea celular EA.hy926

  1. Adquiera las celdas EA.hy926.
  2. Almacene los viales de celdas en la fase de vapor de un tanque de nitrógeno líquido.
  3. Prepare el medio completo DMEM calentando primero DMEM, FBS y pluma/estreptococo (consulte la Tabla de materiales para obtener detalles específicos) en un baño de agua a 37 °C durante 15-30 min. Agregue 50 mL de FBS y 1 mL de pluma/estreptococo a 500 mL de DMEM. Mezcle suavemente la solución por inversión.
    NOTA: Mezclar demasiado vigorosamente causa cantidades excesivas de burbujas.
  4. Retire un vial de células de nitrógeno líquido y caliéntelo en un baño de agua a 37 °C durante 5 min.
  5. Esterilice el vial de células y el frasco de medio completo DMEM rociándolo con alcohol, luego muévalo a la campana estéril.
  6. Utilice una pipeta de 1.000 μL para transferir cuidadosamente las células a un tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Agregue 1 mL de DMEM al vial para enjuagar y agregue al tubo de centrífuga.
  7. Haga una bolita de células con una centrífuga (150 × g, 5 min, 22 °C). Retire el medio del tubo de centrífuga por aspiración; Tenga cuidado de no perturbar la pellet de la celda.
  8. Añada 3 mL de medio completo DMEM al tubo de centrífuga y separe suavemente el pellet mezclando la suspensión de la célula con una pipeta de 1.000 μL.
    NOTA: Se debe evitar causar burbujas al mezclar demasiado vigorosamente, ya que esto podría activar o dañar las células.
  9. Mezcle 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta con puntas de 20 μL o 200 μL. Agregue 10 μL de la mezcla de suspensión celular / azul de tripano a un hemocitómetro y cuente las células.
    NOTA: El uso de puntas de pipeta de 0,1-10 μL puede cizallar las células. Las puntas de este tamaño no deben usarse mientras se manipula la suspensión de celdas.
  10. Añada el medio completo DMEM a la suspensión celular para obtener una densidad de 66.000 células/ml utilizando una pipeta serológica de 10 o 25 mL. Pipetear 15 mL de la suspensión celular en matraz de cultivo T-75. Asegure la dispersión uniforme de la suspensión de la celda moviendo el matraz de norte a sur y de este a oeste.
  11. Incubar las células hasta que alcancen la confluencia (generalmente después de 4-6 días), según lo estimado por un examen bajo un microscopio. En este punto, use las celdas en el experimento (comenzando con la sección 2) o siembrójelas en nuevos matraces para expandirlos y preparar existencias congeladas (a una densidad de siembra recomendada de 1,000,000 de celdas en 15 mL de medio completo por matraz T-75).
    NOTA: Las células se pueden cultivar en los matraces de cultivo durante un máximo de 3 semanas sin que se note una diferencia en la forma, la salud o el rendimiento del ensayo. El medio completo debe cambiarse cada 3-4 días.

2. Adición de celdas EA.hy926 a placas de 96 pocillos

NOTA: Las células de un matraz de cultivo T-75 confluente pueden utilizarse para preparar dos o tres placas de ensayo o, opcionalmente, ampliarse hasta en un máximo de 15 matraces T-75 frescos. Se pueden analizar al menos cinco placas de ensayo utilizando el protocolo de las secciones 4 y 5 en una jornada laboral normal. Las siguientes instrucciones describen la preparación y prueba de una placa de ensayo, pero se pueden preparar placas adicionales repitiendo los pasos 2.2, 2.7, 2.12 y 3.2 para preparar el número deseado de placas de ensayo. Lo más habitual es que se preparen cuatro placas de ensayo al día para medir las respuestas a la concentración con hasta 16 compuestos, lo que requiere dos matraces T-75 con células confluentes.

  1. Calentar el medio completo DMEM en un baño de agua a 37 °C durante 15-30 min. Esterilice el frasco de DMEM complete medium rociándolo con alcohol, luego muévalo a la campana estéril.
  2. Agregue 100 μL de una solución de gelatina esterilizada al 0,4% a todos los pocillos de una placa de fondo transparente de 96 pocillos de paredes negras con tapa. Incubar la placa con la solución de gelatina en una incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 30 min.
  3. Confirme que las células de un matraz de cultivo T-75 son 80-100% confluentes utilizando un microscopio invertido. Retire el medio completo DMEM del matraz T-75 por aspiración.
  4. Lave las células del matraz con 10 ml de PBS y mueva suavemente el matraz de norte a sur y de este a oeste. Retire el PBS del matraz por aspiración.
  5. Añada 5 mL de solución de disociación celular al matraz e incube el matraz en una incubadora (37 °C, 5% CO2) durante ~12 min. Golpee el matraz después de 6 minutos para ayudar a facilitar la disociación.
    NOTA: La incubación de células durante más de 15 minutos con el agente de disociación celular referenciado hace que las células comiencen a agruparse, lo que dificulta la obtención de un recuento celular preciso y puede interferir con el ensayo.
  6. Añada 5 mL del medio completo DMEM precalentado al matraz y mezcle suavemente con la solución de disociación celular/suspensión celular. Con una pipeta serológica de 10 mL, agregue la suspensión celular en un tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Haga un pellet de células con una centrífuga (150 × g, 5 min, 22 °C).
  7. Mientras se forma el pellet, retire la solución de gelatina de la placa de 96 pocillos por aspiración con una pipeta Pasteur conectada a una aspiradora. Retire la tapa de la placa desde el momento de la extracción de la gelatina hasta que la solución esté lista para ser emplatada.
    NOTA: Opcionalmente se puede utilizar una pipeta multicanal o un colector estéril conectado a una aspiradora.
  8. Extraer el medio del tubo de centrífuga por aspiración utilizando una pipeta Pasteur conectada a una aspiradora o una pipeta serológica; Tenga cuidado de no perturbar la pellet de la celda.
  9. Añada medio completo DMEM fresco al tubo de centrífuga con una pipeta serológica de 5 o 10 ml. Rompa suavemente el gránulo celular mezclando el medio completo DMEM con una pipeta de 1.000 μL o una pipeta serológica de 5 mL.
    NOTA: Por lo general, se usan ocho mililitros de DMEM, pero se pueden agregar volúmenes más altos para facilitar el recuento de células.
  10. Mezcle 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripano en un tubo de microcentrífuga utilizando una pipeta con puntas de 20 μL o 200 μL. Agregue 10 μL de la mezcla de suspensión celular / azul de tripano a un hemocitómetro y cuente las células.
  11. Añada medios completos DMEM a la suspensión celular para obtener una densidad de 600.000 células/mL utilizando una pipeta serológica de 10 o 25 mL. Esto dará una densidad final de 60.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos (determinada como la densidad óptima por experimentación).
    NOTA: Un cultivo celular normal exitoso producirá entre 12.000.000 y 15.000.000 de células, que pueden sembrar de dos a tres placas de 96 pocillos.
  12. Mezcle la suspensión celular invirtiendo suavemente el tubo de centrífuga y añádalo a un depósito de pipeta multicanal de 50 mL. Mezclando la suspensión en el depósito cada 30 s meciendo suavemente el depósito de lado a lado, agregue 100 μL de la suspensión celular a cada pocillo usando una pipeta multicanal. Vuelva a colocar la cubierta transparente de la placa y agite suavemente la placa deslizándola sobre la superficie de la campana estéril de norte a sur y de este a oeste para garantizar una distribución uniforme de las células. Incubar la placa en la incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 16-24 h.
    NOTA: Se puede usar una suspensión de celda adicional para preparar placas adicionales, o se pueden repetir los pasos 1.10-1.11 para continuar con la línea de celda.

3. Preparación del ensayo de movilización de calcio

  1. Prepare los reactivos de ensayo.
    1. Prepare la solución de probenecid (250 mM, acuosa) añadiendo 36 mg de probenecid a un tubo de microcentrífuga y disolviéndolo en NaOH 0,6 M (500 μL). Vortex, la solución.
      NOTA: El probenecid mejora la retención de colorante en la célula al inhibir los transportadores de iones orgánicos 75,76,77.
    2. Para producir tampón de ensayo HBSS-HEPES, añada HEPES (1,19 g) a un frasco de 500 ml de HBSS sin rojo de Ca/Mg/fenol (haciendo una solución de 10 mM de HEPES). Complemente el tampón con MgCl2 (solución acuosa 1 M, 500 μL) y CaCl2 (solución acuosa 1 M, 500 μL). Mezcle la solución y guárdela en el frigorífico a 5 °C cuando no esté en uso.
      1. Para cada placa de 96 pocillos, agregue 50 mL del tampón de ensayo HBSS-HEPES a un tubo de centrífuga de 50 mL, complemente con 500 μL de la solución de probenecid y mezcle bien. Caliente el tampón a temperatura ambiente antes de usarlo.
    3. Prepare una solución de Pluronic F-127 al 10% en DMSO añadiendo Pluronic F-127 (20 mg) a un tubo de microcentrífuga o vial de HPLC y disolviéndolo con 200 μL de DMSO.
      NOTA: Esta solución se puede almacenar a temperatura ambiente y es suficiente para unos 30 platos. Pluronic F-127 se disuelve muy lentamente a temperatura ambiente y debe calentarse suavemente para facilitar la disolución.
    4. Prepare el tampón de carga de colorante agregando primero 24 μL de DMSO a un vial de Fluo-4/AM (50 μg) para disolver el tinte. En un tubo de centrífuga de 15 ml envuelto en papel de aluminio, agregue 6 ml de tampón de ensayo HBSS-HEPES y complemente con 6 μl de F-127 plurónico al 10 % y 6 μl de solución Fluo-4/AM. Agite brevemente la solución y déjela reposar a temperatura ambiente, fuera de la luz, durante 10 minutos.
      NOTA: Para evitar el fotoblanqueo de Fluo-4, mantenga el tinte alejado de la luz envolviendo papel de aluminio alrededor del tubo de centrífuga que contiene la solución de tinte y la tapa de la placa de ensayo.
  2. Prepare las placas de ensayo.
    1. Retire la placa de ensayo de la incubadora y confirme la confluencia con un microscopio invertido. Retire manualmente el medio completo DMEM deslizándolo hacia un fregadero y secando la parte superior del plato con una toalla de papel.
      NOTA: El medio se elimina lo suficiente sosteniendo la placa horizontalmente y moviéndola, seguida de girar la placa 180 ° y repitiendo.
    2. Añada tampón de ensayo HBSS-HEPES más solución de probenecid a un depósito de disolvente de pipeta multicanal de 50 mL.
      NOTA: Esta solución se utilizará para los pasos de lavado posteriores y debe dejarse a un lado y cubrirse con papel de aluminio hasta que se necesite.
    3. Añada 100 μl del tampón de ensayo HBSS-HEPES más la solución de probenecid a cada pocillo con una pipeta multicanal y deje que las células se asienten en presencia de probenecid durante 5 min. Retire el tampón de ensayo HBSS-HEPES deslizándolo hacia el sumidero de la misma manera que en el paso 3.2.1.
    4. Añada el tampón de carga de colorante a un depósito de disolvente de pipeta multicanal de 50 ml independiente. Añada 50 μl del tampón de carga de colorante a cada pocillo de la placa de ensayo mediante una pipeta multicanal. Incubar la placa durante 45 min (37 °C, 5% CO2).
    5. Mientras la placa está en la incubadora, prepare las soluciones de agonistas/antagonistas.
      1. Las soluciones antagonistas se almacenan como soluciones de 31,6 mM en DMSO. En un tubo de PCR, diluir 2 μL de la solución madre con 38 μL de 0,1% BSA/agua para obtener una solución de 1,58 mM. 2 μL de esta solución darán una concentración final de 31,6 μM en la placa de ensayo. Diluir 4 μL de la solución antagonista de 1,58 mM con 36 μL de DMSO al 5%/agua (sin adición de BSA), y preparar las concentraciones restantes mediante diluciones en serie.
      2. Prepare una solución de 108,3 μM (16,7x) de TFLLRN-NH2 en tampón de ensayo HBSS-HEPES, que dará una concentración final de 6,5 μM cuando se añadan 6 μL a cada pocillo de la placa de ensayo. Por ejemplo, disuelva una alícuota de 2 mg de TFLLRN-NH2 con 5,244 mL de tampón de ensayo HBSS-HEPES para obtener una solución madre de 0,5 mM. Mezcle 1,083 mL de esta solución con 3,917 mL de tampón de ensayo HBSS-HEPES para obtener una solución de 108,3 μM.
        NOTA: LAS SOLUCIONES TFLLRN-NH2 deben almacenarse en un congelador de -20 °C cuando no estén en uso.
    6. Retire la placa de la incubadora y asegure la absorción del tinte mediante el uso de un microscopio de fluorescencia en un ajuste adecuado (por lo general, para la proteína fluorescente verde, consulte la Figura 1 para ver un ejemplo de Fluo-4 cargado con éxito en las células). Retire el tampón de carga de tinte moviendo la placa de la misma manera que en el paso 3.2.1.
    7. Lave las células 2 veces con 50 μL de tampón de ensayo HBSS-HEPES más solución de probenecid (a partir del paso 3.2.3) en cada pocillo (retírelo moviendo el medio en el fregadero).
    8. Añada 92 μl de tampón de ensayo HBSS-HEPES a cada pocillo y vuelva a observar las células con un microscopio de fluorescencia para asegurarse de que el exceso de colorante se ha eliminado por completo y que las células siguen adheridas.
    9. Utilice una pipeta multicanal para añadir 2 μL de las soluciones antagonistas y el vehículo a los pocillos apropiados (consulte la Tabla 1 para obtener un mapa de placas representativo).

4. Realización del ensayo de movilización de calcio

  1. Ajuste el lector de placas de la siguiente manera: temperatura: 37 °C; longitud de onda de excitación: 485 nm; longitud de onda de emisión: 525 nm; altura de medición: 7,8 mm (optimizada); número de destellos: 100; Número de repeticiones: 20.
  2. Incubar la placa durante 15 min en el lector de placas a 37 °C. Mida la fluorescencia de fondo en las columnas 1 y 2 (cinco escaneos por pocillo).
  3. Expulse la placa del lector de placas y añada rápidamente 6 μL de solución agonista a cada pocillo de las columnas 1 y 2 desde una tira de PCR de 8 tubos utilizando una pipeta multicanal.
    NOTA: Para este paso, utilizamos una pipeta electrónica de 8 canales con puntas de pipeta de 0,1-10 μL.
  4. Mide el cambio en la fluorescencia a medida que se produce la movilización de calcio en las células. Realice 20 escaneos de cada pocillo de acuerdo con la configuración anterior.
    NOTA: El escaneo de cada pocillo en dos columnas de 20x cada una toma aproximadamente 5 minutos (es decir, ~ 15 s entre escaneos de cada pozo).
  5. Repita los pasos 4.2 a 4.4 para las columnas 3 a 12 en incrementos de dos columnas.

5. Análisis de datos

  1. Exporte los datos del ensayo como hojas de cálculo separadas para cada grupo de dos columnas.
  2. Encuentre el promedio de las lecturas de fluorescencia basal utilizando la función AVG (primer escaneo: último escaneo). Haga esto para cada pozo en ambas columnas.
  3. Encuentre la fluorescencia máxima después de la adición de un agonista utilizando la función MÁX (primer escaneo: último escaneo).
  4. Calcule el cambio en la fluorescencia restando la fluorescencia basal de la fluorescencia máxima.
  5. Reste el cambio en fluorescencia calculado para el control negativo (adición de vehículo sin agonista) de cada pocillo en la misma columna.
  6. Encuentre el cambio relativo (normalizado) en la fluorescencia dividiendo el cambio en la fluorescencia en cada pocillo por el cambio en la fluorescencia en el vehículo (0,1% DMSO/agua) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 pocillo.
  7. Copie los valores no controlados, como porcentajes, en un programa de software de estadísticas y gráficos. Si utiliza el software al que se hace referencia, elija la opción de tabla XY, con los Números elegidos como eje X y replique los valores en subcolumnas una al lado de la otra como eje Y.
  8. Utilice el programa para trazar curvas de concentración-respuesta (CRC) a partir de los datos. Si utiliza el software al que se hace referencia, elija la opción log(inhibidor) vs. respuesta - Pendiente variable (cuatro parámetros ).

Resultados

El propósito de este ensayo es generalmente producir curvas de concentración-respuesta (CRC) para tres o cuatro nuevas parmodulinas. En cada placa de ensayo, a menudo se genera un CRC adicional para un compuesto conocido, como NRD-21, que actúa como un control de calidad para el experimento debido a su conocido IC50. Para generar CRC, se debe planificar un mapa de placas como el que se muestra en la Tabla 1 . Si, en cambio, se desean respuestas de concentra...

Discusión

Si bien el protocolo72 reportado anteriormente fue generalmente confiable y nos permitió identificar una nueva parmodulina principal, NRD-21,62, se deseaba un protocolo más eficiente. El ensayo se vio aún más comprometido durante la escasez de suministro causada por la pandemia de COVID-19. La adquisición de puntas para el manipulador automático de líquidos se volvió difícil, y el intento de lavar, esterilizar y reutilizar las punt...

Divulgaciones

C.D. es el inventor de las patentes relacionadas con las parmodulinas y es el fundador y accionista de Function Therapeutics, Inc., que está desarrollando parmodulinas para uso clínico.

Agradecimientos

Agradecemos a Irene Hernández, Trudy Holyst, al Dr. Hartmut Weiler (Instituto de Investigación de la Sangre Versiti) y al Dr. Leggy Arnold (Universidad de Wisconsin-Milwaukee) por proporcionar espacio y apoyo indirecto a este proyecto, y al Dr. John McCorvy (Colegio Médico de Wisconsin) por los consejos pertinentes. Agradecemos al Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (R15HL127636), al Departamento de Defensa de los Estados Unidos (W81XWH22101) y a la Fundación Nacional de Ciencias (2223225) por el apoyo de las subvenciones.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

Referencias

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