Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Proteaz ile aktive edilmiş reseptörlerin (PAR'lar) ligandlarını tanımlamak için kullanılan endotel hücreleri ile bir kalsiyum mobilizasyon testi için geliştirilmiş bir protokol geliştirilmiştir. Yeni protokol, toplam test süresini 90-120 dakika azaltır ve tekrarlanabilir konsantrasyon-yanıt eğrileri verir.

Özet

Hücrelerdeki kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler, hücre içi, floresan, kalsiyum bağlayıcı boyalar ve aynı anda 1.536 kuyudan floresan emisyonlarını ölçebilen görüntüleme cihazlarının kullanılmasıyla yüksek verimli bir şekilde hızla izlenir. Bununla birlikte, bu cihazlar çok daha pahalıdır ve kuyuları ayrı ayrı tarayan yaygın olarak bulunan plaka okuyuculara göre bakımı zor olabilir. Burada tarif edilen, Gαq sinyalinin proteaz ile aktive edilen reseptör (PAR) güdümlü aktivasyonunu ve ardından kalsiyum bağlayıcı boya Fluo-4 kullanılarak kalsiyum mobilizasyonunu ölçmek için bir endotel hücre hattı (EA.hy926) ile kullanım için optimize edilmiş bir plaka okuyucu testidir. Bu test, Dockendorff laboratuvarında tanımlanan allosterik PAR1 hedefli anti-enflamatuar "parmodulin" ligandları dahil olmak üzere bir dizi PAR ligandını karakterize etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, otomatik bir sıvı işleyiciye olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve 96 oyuklu plakalarda PAR ligandlarının orta verimli taramasına izin verir ve kalsiyum mobilizasyonunu başlatan diğer reseptörlerin çalışmasına uygulanabilir olmalıdır.

Giriş

Proteaz ile aktive olan reseptörler (PAR'lar)1,2,3, trombositler ve endotel hücreleri 4,5,6,7 dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde eksprese edilen A sınıfı G proteinine bağlı reseptörlerin (GPCR'ler) bir alt ailesidir. GPCR'lerin çoğundan farklı olarak, PAR'lar benzersiz bir molekül içi aktivasyon moduna sahiptir. Çoğu GPCR, farklı bir bağlanma cebi ile etkileşime giren çözünür ligandlar tarafından aktive edilir, ancak PAR'lar, N-terminalinin proteolitik bölünmesi ile aktive edilir, bu da bir hücre 6,8,9'un yüzeyindeki hücre dışı döngü 2 alanı ile etkileşime girebilen yeni bir bağlı ligand ile sonuçlanır. Bu etkileşim reseptörü aktive eder ve iltihaplanma ve trombosit aktivasyonugibi etkileri teşvik eden çeşitli sinyal yollarını başlatabilir 4,10,11,12. Farklı proteazlar, N-terminali üzerindeki benzersiz bölgelerde bölünme yoluyla PAR'ları aktive edebilir ve farklı sinyal yollarını başlatan reseptör konformasyonlarını stabilize eden farklı bağlı ligandları (TL) ortaya çıkarır 9,13,14,15. Örneğin, alt ailenin en iyi çalışılmış üyesi olan PAR1'de, trombin tarafından bölünme, trombosit aktivasyonu ve endotelyuma lökosit alımı dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik süreci desteklemek için kullanılır, ancak reseptör aşırı eksprese edildiğinde veya aşırı aktive edildiğinde zararlı etkilere yol açabilir 4,16,17,18,19,20,21 . Tersine, aktive protein C (aPC) ile bölünme, anti-enflamatuar etkileri ve endotel bariyerlerinin korunmasını teşvik edebilir 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PAR'lar ayrıca moleküller arası bir şekilde TL'lerin peptit analogları tarafından da aktive edilebilir 13,30,31. Bu peptitler, PAR hedefli proteazlar yerine PAR inhibisyonunu (modülasyon) ölçmek için rutin olarak kullanılır ve bu protokolde kullanılırlar.

Sepsis22,32, kardiyovasküler hastalık 33,34,35,36,37,38, böbrek hastalığı 39,40,41,42, orak hücre hastalığı43, fibroz44, osteoporoz ve osteoartrit45 dahil olmak üzere çok sayıda bozukluk patolojik PAR1 sinyali ile ilişkilidir,46, nörodejenerasyon 47,48,49,50,51 ve kanser 52,53,54,55,56,57,58,59. PAR1 antagonistleri, 1990'lardan beri kardiyovasküler hastalık için antiplatelet ajanlar olarak incelenmiştir ve reseptörle ilişkili hastalıkların artan listesi, biyolojik problar (alet bileşikleri) veya potansiyel terapötikler olarak kullanılmak üzere yeni ligandların tanımlanmasını gerektirmektedir. Şu anda, yüksek riskli hastalarda koroner arter hastalığını tedavi etmek için kullanılan FDA onaylı tek bir PAR1 antagonisti olan vorapaxar bulunmaktadır 34,36,37,60. Alternatif bir PAR1 antagonisti olan pepducin PZ-128, kalp kateterizasyonu hastalarında trombozu önlemek için başarılı bir faz II çalışmasını tamamladı38. Dockendorff grubu, parmodulinler 61,62 olarak bilinen ayrı bir küçük molekül sınıfı olan PAR1 ligandlarının tıbbi kimyası ve farmakolojisine odaklanmıştır. Vorapaxar gibi bildirilen PAR1 antagonistlerinin aksine, parmodulinler, aPC'ye benzer sitoprotektif etkileri teşvik ederken Gαq yolunu seçici olarak bloke eden PAR1'in allosterik, önyargılı modülatörleridir. Vorapaxar gibi güçlü ortosterik PAR1 antagonistlerinin aksine, yayınlanan parmodulinler de geri dönüşümlüdür 63,64,65.

Başlangıçta, parmodulinler Flaumenhaft ve meslektaşları tarafından trombositlerde P-selektin ekspresyonunu veya granül sekresyonunu inhibe etme yetenekleri nedeniyle tanımlandı61,66. Bununla birlikte, parmodulinlerin endotel hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için alternatif bir yöntem gerekliydi. GPCR ile ilgili sinyalleri izlemenin yaygın bir yöntemi, uygun bir hücre içi kalsiyum bağlayıcı boya67,68 kullanılarak ölçülebilen önemli bir ikincil haberci olan hücre içi Ca2+ mobilizasyonunu ölçmektir. PAR1 tarafından indüklenen kalsiyum mobilizasyonunun Gαq 69,70'in aktivasyonu yoluyla olduğunu gösteren önemli kanıtlar sağlanmıştır. Bağlı ligandı (veya uygun bir eksojen ligand) tarafından aktive edildikten sonra, PAR1, Gαq alt birimine bağlı guanozin difosfatın (GDP) guanozin trifosfat (GTP) ile değiştirilmesine neden olan konformasyonel bir değişikliğe uğrar.68. Gαq alt birimi daha sonra fosfatidilinositol 4,5 bifosfatın (PIP2) hidrolizini katalize eden ve 1,4,5-inositol trifosfat (IP3) ve diasilgliserol (DAG) oluşturan fosfolipaz Cβ'yı (PLC-β) aktive eder. Son olarak, IP3, endoplazmik retikulumun zarındaki IP3'e duyarlı Ca2+ kanallarına bağlanır ve Ca2+'nın sitoplazmaya salınmasına izin verir, burada hücrelere eklenen Fluo-4 gibi Ca2+ bağımlı floresan boyalara bağlanabilir71. Bu işlem saniyeler içinde gerçekleşir ve Ca2+ konsantrasyonunu 100 kat artırabilir, bu da kalsiyuma bağlı boya miktarında ciddi bir değişikliğe ve sağlam bir floresan sinyaline yol açar.

2018'de Dockendorff grubu,PAR1 72'nin Gαq yolunun antagonistlerini tanımlamak için kullanılabilecek orta verimli bir Ca 2+ mobilizasyon testini açıkladı. Test, PAR926 ekspresyonunda gözle görülür bir değişiklik olmadan çoklu geçişler için kullanılabilen ve sitoprotektif etkilerin in vitro ölçümleri için kurulan hibrit bir insan endotel hücre hattı olan EA.hy731'ü kullandı.

Orijinal protokol, 96 oyuklu plakalarda EA.hy926 hücrelerini kullandı ve 488 nm'de yoğun floresansı ve yüksek hücre geçirgenliği nedeniyle seçilen Fluo-4 / boyası ile yüklendi. Boya hücrelere yüklendikten sonra, otomatik 8 kanallı bir sıvı işleyici ile uzun yıkama adımları gerçekleştirildi (96 kanallı yıkayıcı gibi daha hızlı sıvı işleme yöntemlerine erişilemiyordu). Bu testin tekrarlanabilirliği, dikkatli, otomatik robotik ortam değişiklikleri olmadan olandan daha üstündü. Antagonistler daha sonra hücrelerle inkübe edildi, PAR1, seçici bir agonistin (bir seferde 16 kuyucuk) sıralı ilavesi yoluyla aktive edildi ve aktiviteyi belirlemek için kalsiyum mobilizasyonu ve boya bağlanmasından kaynaklanan floresan değişiklikleri ölçüldü.

Bu protokol, PAR1 aracılı kalsiyum mobilizasyonunun ölçülmesine izin verirken, her 96 oyuklu plakayı test etmek için gereken süre ile sınırlıdır. Uzun deney süreleri, yalnızca her gün taranabilecek bileşiklerin sayısının sınırlı olması nedeniyle değil, aynı zamanda zamanla boya akışının meydana gelmesi ve bazal floresansı artırarak tahlil penceresini daraltması nedeniyle de sorunludur. Uzun deney süresine katkıda bulunanlardan biri, plaka yıkama için 8 kanallı bir sıvı işleyicinin kullanılmasıdır ve bu da her deneye 30 dakikadan fazla ekler. Tedarik zinciri sorunları nedeniyle gerekli ipuçlarının elde edilmesi de zorlaştı. Burada, sıvı bir işleyici gerektirmeyen ve bu nedenle daha yüksek verimde çalıştırılabilen PAR aracılı kalsiyum mobilizasyon testi için güncellenmiş bir protokol rapor edilmiştir. Bu protokol aynı zamanda hücre içi kalsiyum mobilizasyonuna yol açan diğer GPCR'lerle sinyalizasyonu ölçmek için de uygun olmalıdır. Bu güncellenmiş plaka okuyucu protokolü, pahalı hücre görüntüleme cihazları için kaynaklara sahip olmayan ancak çok sayıda bileşiği hızlı bir şekilde taraması gereken akademik ve küçük endüstriyel laboratuvarlar için idealdir. Bir plaka görüntüleyici kullanılarak yapılan bir kalsiyum mobilizasyon testi örneği için, Caers ve ark.74'e bakınız.

Protokol

Aşağıdaki protokolün 1. ve 2. adımlarında yapılan tüm medya değişimleri/eklemeleri steril bir başlıkta gerçekleştirilir. Aksi belirtilmedikçe, steril davlumbazda kullanılan tüm plastik malzemeler sterilize edilmiş ve mühürlenmiş olarak satın alınmalı veya otoklav yoluyla uygun şekilde sterilize edilmelidir.

1. EA.hy926 hücre hattının başlatılması

  1. EA.hy926 hücrelerini edinin.
  2. Hücre şişelerini bir sıvı nitrojen tankının buhar fazında saklayın.
  3. Önce DMEM, FBS ve kalem / strep'i (belirli ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın) 37 ° C'lik bir su banyosunda 15-30 dakika ısıtarak DMEM tam ortamını hazırlayın. 500 mL DMEM'e 50 mL FBS ve 1 mL kalem / strep ekleyin. Çözeltiyi ters çevirerek yavaşça karıştırın.
    NOT: Çok kuvvetli karıştırmak aşırı miktarda kabarcıklara neden olur.
  4. Bir şişe hücreyi sıvı nitrojenden çıkarın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika ısıtın.
  5. Hücre şişesini ve DMEM tam ortam şişesini alkol püskürterek sterilize edin, ardından steril davlumbaza geçin.
  6. Hücreleri dikkatlice 15 mL'lik bir steril santrifüj tüpüne aktarmak için 1.000 μL'lik bir pipet kullanın. Durulamak için şişeye 1 mL DMEM ekleyin ve santrifüj tüpüne ekleyin.
  7. Bir santrifüj kullanarak bir hücre peleti yapın (150 × g, 5 dk, 22 °C). Ortamı aspirasyon ile santrifüj tüpünden çıkarın; Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin.
  8. Santrifüj tüpüne 3 mL DMEM tam ortam ekleyin ve 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu karıştırarak peleti nazikçe parçalayın.
    NOT: Hücreleri aktive edebileceği veya zarar verebileceği için çok kuvvetli karıştırarak kabarcıklara neden olmaktan kaçınılmalıdır.
  9. 20 μL veya 200 μL uçlu bir pipet kullanarak bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μL hücre süspansiyonu / tripan mavisi karışımı ekleyin ve hücreleri sayın.
    NOT: 0,1-10 μL pipet uçlarının kullanılması hücreleri kesebilir. Hücre süspansiyonu kullanılırken bu boyuttaki uçlar kullanılmamalıdır.
  10. 10 veya 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 66.000 hücre / mL'lik bir yoğunluk elde etmek için hücre süspansiyonuna DMEM tam ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunun 15 mL'sini T-75 kültür şişesine / şişelerine pipetleyin. Şişeyi kuzeyden güneye ve doğudan batıya hareket ettirerek hücre süspansiyonunun eşit dağılmasını sağlayın.
  11. Hücreleri, mikroskop altında incelenerek tahmin edildiği gibi, birleşme noktasına ulaşana kadar (tipik olarak 4-6 gün sonra) inkübe edin. Bu noktada, deneydeki hücreleri kullanın (bölüm 2'den başlayarak) veya donmuş stokları hazırlamak için genişleme için yeni şişelere tohumlayın (T-75 şişesi başına 15 mL tam ortamda 1.000.000 hücrelik önerilen tohumlama yoğunluğunda).
    NOT: Hücreler, tahlilde şekil, sağlık veya performansta gözle görülür bir fark olmaksızın kültür şişelerinde 3 haftaya kadar büyütülebilir. Tam ortam her 3-4 günde bir değiştirilmelidir.

2. EA.hy926 hücrelerinin 96 oyuklu plakalara eklenmesi

NOT: Bir birleşik T-75 kültür şişesinden alınan hücreler, iki veya üç tahlil plakası hazırlamak için kullanılabilir veya isteğe bağlı olarak 15 adede kadar taze T-75 şişesine genişletilebilir. Normal bir iş gününde bölüm 4 ve 5'teki protokol kullanılarak en az beş tahlil plakası taranabilir. Aşağıdaki talimatlar, bir tahlil plakasının hazırlanmasını ve test edilmesini açıklar, ancak istenen sayıda tahlil plakası hazırlamak için 2.2, 2.7, 2.12 ve 3.2 adımları tekrarlanarak ek plakalar hazırlanabilir. En yaygın olarak, 16 bileşiğe kadar konsantrasyon tepkilerini ölçmek için günde dört tahlil plakası hazırlanır, bu da birleşen hücrelere sahip iki T-75 şişesi gerektirir.

  1. DMEM komple besiyerini 37 °C su banyosunda 15-30 dakika ısıtın. DMEM tam ortam şişesini alkol püskürterek sterilize edin, ardından steril davlumbaza taşıyın.
  2. Siyah duvarlı, 96 oyuklu, kapaklı şeffaf tabanlı bir plakanın tüm kuyucuklarına 100 μL sterilize edilmiş% 0.4 jelatin çözeltisi ekleyin. Plakayı jelatin çözeltisi ile bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) 30 dakika inkübe edin.
  3. Ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak bir T-75 kültür şişesindeki hücrelerin %80-100 birleşim olduğunu doğrulayın. DMEM tam besiyerini aspirasyon yoluyla T-75 şişesinden çıkarın.
  4. Şişedeki hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve şişeyi nazikçe Kuzey'den Güney'e ve Doğu'dan Batı'ya hareket ettirin. PBS'yi aspirasyon yoluyla şişeden çıkarın.
  5. Şişeye 5 mL hücre ayrışma çözeltisi ekleyin ve şişeyi bir inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) ~ 12 dakika inkübe edin. Ayrışmayı kolaylaştırmaya yardımcı olmak için 6 dakika sonra şişeye dokunun.
    NOT: Referans alınan hücre ayrışma ajanı ile hücrelerin 15 dakikadan daha uzun süre inkübe edilmesi, hücrelerin bir araya toplanmaya başlamasına neden olur, bu da doğru bir hücre sayımı elde etmeyi zorlaştırır ve tahlile müdahale edebilir.
  6. Şişeye 5 mL önceden ısıtılmış DMEM tam ortamı ekleyin ve hücre ayrışma çözeltisine / hücre süspansiyonuna yavaşça karıştırın. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu steril bir 50 mL'lik santrifüj tüpüne ekleyin. Bir santrifüj (150 × g, 5 dk, 22 °C) kullanarak bir hücre peleti yapın.
  7. Pelet oluşturulurken, jelatin çözeltisini bir vakuma bağlı bir Pasteur pipeti kullanarak aspirasyon yoluyla 96 oyuklu plakadan çıkarın. Jelatinin çıkarılması sırasından, çözelti kaplanmaya hazır olana kadar plaka kapağını çıkarın.
    NOT: İsteğe bağlı olarak vakuma bağlı çok kanallı bir pipet veya steril manifold kullanılabilir.
  8. Bir vakuma veya serolojik bir pipete bağlı bir Pasteur pipeti kullanarak aspirasyon yoluyla ortamı santrifüj tüpünden çıkarın; Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat edin.
  9. 5 veya 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak santrifüj tüpüne taze DMEM tam ortamı ekleyin. DMEM tam ortamını 1.000 μL'lik bir pipet veya 5 mL'lik bir serolojik pipet ile karıştırarak hücre peletini nazikçe parçalayın.
    NOT: Tipik olarak sekiz mililitre DMEM kullanılır, ancak hücre sayımını kolaylaştırmak için daha yüksek hacimler eklenebilir.
  10. 20 μL veya 200 μL uçlu bir pipet kullanarak bir mikrosantrifüj tüpünde 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın. Bir hemositometreye 10 μL hücre süspansiyonu / tripan mavisi karışımı ekleyin ve hücreleri sayın.
  11. 10 veya 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 600.000 hücre / mL'lik bir yoğunluk elde etmek için hücre süspansiyonuna DMEM tam ortamı ekleyin. Bu, 96 oyuklu bir plakada (deneyle optimal yoğunluk olarak belirlenen) 60.000 hücre / kuyuluk bir nihai yoğunluk verecektir.
    NOT: Normal bir başarılı hücre kültürü, 12.000.000 ila 15.000.000 hücre verecektir, bu da iki ila üç 96 oyuklu plakayı tohumlayabilir.
  12. Santrifüj tüpünü hafifçe ters çevirerek hücre süspansiyonunu karıştırın ve 50 mL'lik çok kanallı bir pipet haznesine ekleyin. Rezervuarı her 30 saniyede bir hafifçe yan yana sallayarak rezervuardaki süspansiyonu karıştırarak, çok kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Şeffaf plaka kapağını değiştirin ve eşit hücre dağılımını sağlamak için steril davlumbazın yüzeyinde Kuzey'den Güney'e ve Doğu'dan Batı'ya kaydırarak plakayı hafifçe sallayın. Plakayı inkübatörde (37 °C,% 5 CO2) 16-24 saat inkübe edin.
    NOT: Ek plakalar hazırlamak için ek hücre süspansiyonu kullanılabilir veya hücre hattına devam etmek için 1.10-1.11 adımları tekrarlanabilir.

3. Kalsiyum mobilizasyon testi hazırlığı

  1. Tahlil reaktiflerini hazırlayın.
    1. Bir mikrosantrifüj tüpüne 36 mg probenesid ekleyerek ve 0.6 M NaOH (500 μL) içinde çözerek probenesid çözeltisi (250 mM, sulu) hazırlayın. Çözümü girdap.
      NOT: Probenesid, organik iyon taşıyıcıları75,76,77 inhibe ederek hücrede boya tutulmasını iyileştirir.
    2. HBSS-HEPES test tamponu yapmak için, 500 mL'lik bir şişe Ca / Mg / fenol kırmızı içermeyen HBSS'ye (10 mM'lik bir HEPES çözeltisi yaparak) HEPES (1.19 g) ekleyin. Tamponu MgCl2 (1 M sulu çözelti, 500 μL) ve CaCl2 (1 M sulu çözelti, 500 μL) ile destekleyin. Solüsyonu karıştırın ve kullanılmadığı zaman buzdolabında 5 °C'de saklayın.
      1. Her 96 oyuklu plaka için, 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 50 mL HBSS-HEPES tahlil tamponu ekleyin, 500 μL probenesid çözeltisi ile destekleyin ve iyice karıştırın. Kullanmadan önce tamponu oda sıcaklığına ısıtın.
    3. Bir mikrosantrifüj tüpüne veya HPLC şişesine Pluronic F-127 (20 mg) ekleyerek ve 200 μL DMSO ile çözerek DMSO'da% 10'luk bir Pluronic F-127 çözeltisi yapın.
      NOT: Bu çözelti oda sıcaklığında saklanabilir ve yaklaşık 30 tabak için yeterlidir. Pluronic F-127, oda sıcaklığında çok yavaş çözünür ve çözünmeyi kolaylaştırmak için hafifçe ısıtılmalıdır.
    4. Boyayı çözmek için önce bir Fluo-4 / (50 μg) şişesine 24 μL DMSO ekleyerek boya yükleme tamponunu hazırlayın. Folyo sarılı 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 6 mL HBSS-HEPES test tamponu ekleyin ve 6 μL% 10 Pluronic F-127 ve 6 μL Fluo-4 / çözeltisi ile destekleyin. Çözeltiyi kısaca girdaplayın ve oda sıcaklığında, ışıktan 10 dakika bekletin.
      NOT: Fluo-4'ün foto-ağartılmasını önlemek için, boya solüsyonunu içeren santrifüj tüpünün ve tahlil plakasının kapağının etrafına alüminyum folyo sararak boyayı ışıktan uzak tutun.
  2. Tahlil plakalarını hazırlayın.
    1. Tahlil plakasını inkübatörden çıkarın ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak birleşmeyi onaylayın. DMEM komple ortamını bir lavaboya iterek ve plakanın üstünü bir kağıt havluyla lekeleyerek manuel olarak çıkarın.
      NOT: Plakayı yatay olarak tutarak ve hafifçe vurarak, ardından plakayı 180° döndürerek ve tekrar ederek ortam yeterince çıkarılır.
    2. HBSS-HEPES tahlil tamponu artı probenesid çözeltisini 50 mL çok kanallı pipet çözücü haznesine ekleyin.
      NOT: Bu solüsyon daha sonraki yıkama adımları için kullanılacaktır ve bir kenara bırakılmalı ve ihtiyaç duyulana kadar alüminyum folyo ile kapatılmalıdır.
    3. Çok kanallı bir pipet ile her bir oyuğa 100 μL HBSS-HEPES tahlil tamponu artı probenesid çözeltisi ekleyin ve hücrelerin 5 dakika boyunca probenesid varlığında oturmasına izin verin. HBSS-HEPES test tamponunu, adım 3.2.1'deki gibi lavaboya hafifçe vurarak çıkarın.
    4. Ayrı bir 50 mL çok kanallı pipet çözücü haznesine boya yükleme tamponu ekleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak tahlil plakasının her bir oyuğuna 50 μL boya yükleme tamponu ekleyin. Plakayı 45 dakika (37 °C,% 5 CO2) inkübe edin.
    5. Plaka inkübatördeyken, agonist / antagonist çözeltilerini hazırlayın.
      1. Antagonist çözeltiler DMSO'da 31.6 mM çözeltiler olarak depolanır. Bir PCR tüpünde, 1,58 mM'lik bir çözelti elde etmek için 2 μL stok çözeltisini 38 μL %0,1 BSA/su ile seyreltin. Bu çözeltinin 2 μL'si, tahlil plakasında 31.6 μM'lik bir nihai konsantrasyon verecektir. 1.58 mM antagonist çözeltisinin 4 μL'sini 36 μL% 5 DMSO / su (BSA ilavesi yok) ile seyreltin ve kalan konsantrasyonları seri seyreltmeler yoluyla hazırlayın.
      2. Tahlil plakasının her bir oyuğuna 6 μL eklendiğinde 6,5 μM'lik bir nihai konsantrasyon verecek olan HBSS-HEPES tahlil tamponunda 108.3 μM (16.7x) bir TFLLRN-NH2 çözeltisi hazırlayın. Örneğin, 0.5 mM'lik bir stok çözeltisi vermek için 2 mg'lık bir TFLLRN-NH2 alikotunu 5.244 mL HBSS-HEPES test tamponu ile çözün. 108.3 μM'lik bir çözelti elde etmek için bu çözeltinin 1.083 mL'sini 3.917 mL HBSS-HEPES test tamponu ile karıştırın.
        NOT: TFLLRN-NH2 çözeltileri kullanılmadığı zaman -20 °C'lik bir dondurucuda saklanmalıdır.
    6. Plakayı inkübatörden çıkarın ve uygun bir ayarda bir floresan mikroskobu kullanarak boya alımını sağlayın (tipik olarak yeşil floresan proteini için, hücrelere başarıyla yüklenen Fluo-4 örneği için Şekil 1'e bakınız). Plakayı adım 3.2.1 ile aynı şekilde hafifçe vurarak boya yükleme tamponunu çıkarın.
    7. Hücreleri 2x 50 μL HBSS-HEPES test tamponu artı probenesid çözeltisi (adım 3.2.3'ten itibaren) ile her bir kuyucukta yıkayın (ortamı lavaboya hafifçe vurarak çıkarın).
    8. Her bir oyuğa 92 μL HBSS-HEPES tahlil tamponu ekleyin ve fazla boyanın tamamen çıkarıldığından ve hücrelerin yapışkan kaldığından emin olmak için hücreleri bir floresan mikroskobu ile tekrar görüntüleyin.
    9. Uygun kuyucuklara 2 μL antagonist çözelti ve araç eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın (temsili bir plaka haritası için Tablo 1'e bakınız).

4. Kalsiyum mobilizasyon testinin yapılması

  1. Plaka okuyucuyu aşağıdaki gibi ayarlayın: sıcaklık: 37 °C; uyarma dalga boyu: 485 nm; emisyon dalga boyu: 525 nm; ölçüm yüksekliği: 7,8 mm (optimize edilmiş); yanıp sönme sayısı: 100; Tekrar sayısı: 20.
  2. Plakayı plaka okuyucuda 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Sütun 1 ve 2'deki arka plan floresansını ölçün (kuyu başına beş tarama).
  3. Plakayı plaka okuyucudan çıkarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak 8 tüplü bir PCR şeridinden 1 ve 2 numaralı sütunlardaki her bir oyuğa hızlı bir şekilde 6 μL agonist solüsyonu ekleyin.
    NOT: Bu adım için, 0,1-10 μL pipet uçlarına sahip 8 kanallı elektronik bir pipet kullanıyoruz.
  4. Hücrelerde kalsiyum mobilizasyonu meydana geldikçe floresanstaki değişikliği ölçün. Yukarıdaki ayarlara göre her kuyucuk için 20 tarama gerçekleştirin.
    NOT: Her bir kuyucuğun her biri 20x olmak üzere iki sütunda taranması yaklaşık 5 dakika sürer (yani, her bir oyuğun taramaları arasında ~15 saniye).
  5. 3-12 arasındaki sütunlar için 4.2-4.4 arasındaki adımları iki sütunlu artışlarla yineleyin.

5. Veri analizi

  1. Tahlildeki verileri, her iki sütunlu grup için ayrı elektronik tablolar olarak dışa aktarın.
  2. AVG (ilk tarama: son tarama) işlevini kullanarak bazal floresan okumalarının ortalamasını bulun. Bunu her iki sütundaki her kuyu için yapın.
  3. MAX (ilk tarama: son tarama) fonksiyonunu kullanarak agonist eklendikten sonra maksimum floresanı bulun.
  4. Bazal floresansı maksimum floresanstan çıkararak floresanstaki değişimi hesaplayın.
  5. Negatif kontrol (agonistsiz araç ilavesi) için hesaplanan floresan değişimini aynı sütundaki her bir kuyucuktan çıkarın.
  6. Her bir kuyucuktaki floresan değişikliğini araçtaki floresan değişimine (%0,1 DMSO/su) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 kuyusuna bölerek floresanstaki nispi (normalleştirilmiş) değişikliği bulun.
  7. Kontrol dışı değerleri, yüzde olarak, bir istatistik ve grafik yazılım programına kopyalayın. Başvurulan yazılımı kullanıyorsanız, X ekseni olarak seçilen Sayılar ve Y ekseni olarak yan yana alt sütunlardaki değerleri çoğaltarak XY tablosu seçeneğini belirleyin.
  8. Verilerden konsantrasyon-tepki eğrilerini (CRC'ler) çizmek için programı kullanın. Başvurulan yazılımı kullanıyorsanız, log(inhibitör) ve yanıt - Değişken eğim (dört parametre) seçeneğini seçin.

Sonuçlar

Bu testin amacı genellikle üç ila dört yeni parmodulin için konsantrasyon-tepki eğrileri (CRC'ler) üretmektir. Her tahlil plakasında, NRD-21 gibi bilinen bir bileşik için genellikle ek bir CRC üretilir ve bu, bilinen IC50'si nedeniyle deney için bir kalite kontrolü görevi görür. CRC'leri oluşturmak için, Tablo 1'de gösterilen gibi bir plaka haritası planlanmalıdır. Bunun yerine tek noktalı konsantrasyon tepkileri isteniyorsa, 10 μM niha...

Tartışmalar

Daha önce bildirilen protokol72 genellikle güvenilir ve yeni bir kurşun parmodulin tanımlamamıza izin verirken, NRD-21,62 daha verimli bir protokol istendi. Tahlil, COVID-19 salgınının neden olduğu tedarik sıkıntısı sırasında daha da tehlikeye girdi. Otomatik sıvı işleyici için uç almak zorlaştı ve uçları yıkamaya, sterilize etmeye ve yeniden kullanmaya çalışmak, önemli farklılıklarla CRC'ler üretti. Bu, geli...

Açıklamalar

C.D. parmodulinleri içeren patentlerin mucididir ve klinik kullanım için parmodulinler geliştiren Function Therapeutics, Inc.'in kurucusu ve hissedarıdır.

Teşekkürler

Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Kan Araştırma Enstitüsü) ve Dr. Leggy Arnold'a (Wisconsin-Milwaukee Üniversitesi) bu projeye yer sağladıkları ve dolaylı destek sağladıkları için ve Dr. John McCorvy'ye (Wisconsin Tıp Fakültesi) ilgili tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü'ne (R15HL127636), ABD Savunma Bakanlığı'na (W81XWH22101) ve Ulusal Bilim Vakfı'na (2223225) hibe desteği için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

Referanslar

  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4 (2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582 (2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -. M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597 (2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062 (2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124 (2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100 (2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -. A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23 (2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516 (2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar kelime ler Kalsiyum MobilizasyonuPlaka OkuyucuH cre i KalsiyumFloresan BoyaFluo 4Proteaz ile aktive olan Resept r PARG protein SinyaliEndotel H creleriEA hy926PAR LigandlarParmodulinY ksek Verimli Tarama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır