使用读板器通过钙动员测定表征蛋白酶激活受体的调节剂

摘要

已经开发了一种改进的内皮细胞钙动员测定方案，用于识别蛋白酶激活受体 （PAR） 的配体。新方案将总检测时间缩短了 90-120 分钟，并产生了可重现的浓度-响应曲线。

摘要

使用细胞内荧光、钙结合染料和成像仪器，可以同时测量多达 1,536 个孔的荧光发射，以高通量方式快速监测细胞中钙浓度的变化。然而，这些仪器要昂贵得多，并且相对于广泛使用的单独扫描孔的读板器来说，维护起来可能具有挑战性。这里描述的是与内皮细胞系 （EA.hy926） 一起使用的优化读板器测定，用于测量蛋白酶激活受体 （PAR） 驱动的 G_αq 信号传导激活和随后使用钙结合染料 Fluo-4 的钙动员。该测定已用于表征一系列 PAR 配体，包括在 Dockendorff 实验室中鉴定的变构靶向 PAR1 的抗炎“parmodulin”配体。该方案消除了对自动液体处理器的需求，并允许在 96 孔板中对 PAR 配体进行中等通量筛选，并且应适用于启动钙动员的其他受体的研究。

引言

蛋白酶激活受体 （PAR）^1,2,3 是 A 类 G 蛋白偶联受体 （GPCR） 的一个亚家族，在多种细胞类型中表达，包括血小板和内皮细胞 ^4,5,6,7。与大多数 GPCR 不同，PAR 具有独特的分子内激活模式。大多数 GPCR 被与不同结合口袋相互作用的可溶性配体激活，但 PAR 被 N 末端的蛋白水解裂解激活，这导致一种新的栓系配体，可以与细胞表面的细胞外环 2 结构域相互作用 ^6,8,9。这种相互作用会激活受体，并可以启动多个信号通路，促进炎症和血小板活化等作用 4,10,11,12。

研究方案

在以下方案的步骤 1 和 2 中进行的所有培养基更换/添加均在无菌罩中进行。除非另有说明，否则无菌罩中使用的所有塑料器皿必须购买灭菌和密封或通过高压灭菌器进行适当灭菌。

1. EA.hy926 细胞系的启动

1. 获取 EA.hy926 细胞。
2. 将小瓶细胞储存在液氮罐的气相中。
3. 首先在 37 °C 水浴中加热 DMEM、FBS 和笔/链球菌（具体细节见 材料表 ）15-30 分钟，以制备 DMEM 完全培养基。将 50 mL FBS 和 1 mL 笔/链球菌添加到 500 mL DMEM 中。倒置轻轻混合溶液。
   注意： 过度混合会导致气泡量过多。
4. 从液氮中取出一小瓶细胞，并在 37 °C 水浴中加热 5 分钟。
5. 通过喷洒酒精对小瓶细胞和 DMEM 完全培养基瓶进行消毒，然后移至无菌罩中。
6. 使用 1,000 μL 移液器小心地将细胞转移到 15 mL 无菌离心管中。向样品瓶中加入 1 mL DMEM 进行冲洗，然后加入离心管中。
7. 使用离心机（150 × g，5 分钟，22 °C）制备细胞沉淀。通过抽吸从离心管中去除培养基;小心不要打扰细胞沉淀。
8. 向离心管中加入 3 mL....

讨论

虽然先前报道的方案⁷² 通常是可靠的，并且允许我们识别一种新的先导 parmodulin，但 NRD-21,62 需要一种更有效的方案。在 COVID-19 大流行导致的供应短缺期间，该检测进一步受到影响。获取自动液体处理器的吸头变得困难，尝试清洗、消毒和重复使用吸头产生的 CRC 差异很大。这促进了一系列紧急实验，旨在简化改进的 PAR 驱动的钙动员测.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells	ATCC	CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent	Corning	25-056-CI	Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-091
Gelatin from porcine skin	MilliporeSigma	G2500	Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)	Corning	30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)	Corning	25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Thermo	172571000
Bovine serum albumin (BSA)	Avantor	97061-420
Calcium chloride dihydrate	Thermo	42352-0250
Dimethyl sulfoxide	Thermo	J66650-AD
Fluo-4/AM	Invitrogen	F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)	Corning	21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate	MilliporeSigma	M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)	Spectrum Chemical	P1166
Probenecid	TCI America	P1975
Sodium hydroxide	VWR International	BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)			Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate	Corning	3603	with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL	Avantor	89039-664
Centrifuge tube, 50 mL	Avantor	89039-656
Culture flask, T-75	Corning	353136	tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL	Corning	RES-V-50-S
Enspire plate reader	Perkin Elmer		Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Avantor	20170-038
Pasteur pipette, 9"	Fisher	13-678-6B	must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips	Avantor	76318-802
Pipette tips, 20 µL	Biotix	63300042	sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL	Biotix	63300044	sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL	Biotix	63300047	sterile, filtered tips
Prism	GraphPad		volume 6 used
Serological pipette, 5 mL	Tradewinds Direct	07-5005
Serological pipette, 10 mL	Tradewinds Direct	07-5010
Serological pipette, 25 mL	Tradewinds Direct	07-5025