发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

已经开发了一种改进的内皮细胞钙动员测定方案，用于识别蛋白酶激活受体 （PAR） 的配体。新方案将总检测时间缩短了 90-120 分钟，并产生了可重现的浓度-响应曲线。

摘要

使用细胞内荧光、钙结合染料和成像仪器，可以同时测量多达 1,536 个孔的荧光发射，以高通量方式快速监测细胞中钙浓度的变化。然而，这些仪器要昂贵得多，并且相对于广泛使用的单独扫描孔的读板器来说，维护起来可能具有挑战性。这里描述的是与内皮细胞系 （EA.hy926） 一起使用的优化读板器测定，用于测量蛋白酶激活受体 （PAR） 驱动的 Gαq 信号传导激活和随后使用钙结合染料 Fluo-4 的钙动员。该测定已用于表征一系列 PAR 配体，包括在 Dockendorff 实验室中鉴定的变构靶向 PAR1 的抗炎“parmodulin”配体。该方案消除了对自动液体处理器的需求，并允许在 96 孔板中对 PAR 配体进行中等通量筛选，并且应适用于启动钙动员的其他受体的研究。

引言

蛋白酶激活受体 （PAR）1,2,3 是 A 类 G 蛋白偶联受体 （GPCR） 的一个亚家族，在多种细胞类型中表达，包括血小板和内皮细胞 4,5,6,7。与大多数 GPCR 不同，PAR 具有独特的分子内激活模式。大多数 GPCR 被与不同结合口袋相互作用的可溶性配体激活，但 PAR 被 N 末端的蛋白水解裂解激活，这导致一种新的栓系配体，可以与细胞表面的细胞外环 2 结构域相互作用 6,8,9。这种相互作用会激活受体，并可以启动多个信号通路，促进炎症和血小板活化等作用 4,10,11,12。不同的蛋白酶可以通过在 N 末端的独特位点切割来激活 PAR，揭示稳定的受体构象的不同栓系配体 （TL），从而启动不同的信号通路 9,13,14,15。例如，在该亚家族中研究最充分的成员 PAR1 中，凝血酶裂解用于支持许多生物过程，包括血小板活化和白细胞募集到内皮细胞，但当受体过表达或过度激活时，可能导致有害影响 4,16,17,18,19,20,21 .相反，活化蛋白 C （aPC） 的切割可以促进抗炎作用和维持内皮屏障 15,22,23,24,25,26,27,28,29。PAR 也可以被 TL 的肽类似物以分子间方式激活 13,30,31。这些肽通常用于测量 PAR 抑制（调节）而不是 PAR 靶向蛋白酶，它们用于该方案。

许多疾病与病理性 PAR1 信号有关，包括败血症22,32、心血管疾病33、34、35、36、37、38、肾脏疾病39、40、41、42、镰状细胞病43、纤维化44、骨质疏松症和骨关节炎45，46，神经变性 47,48,49,50,51，和癌症 52,53,54,55,56,57,58,59 .自 1990 年代以来，PAR1 的拮抗剂一直被研究为心血管疾病的抗血小板剂，与受体相关的疾病越来越多，因此需要鉴定用作生物探针（工具化合物）或潜在疗法的新型配体。目前，只有一种 FDA 批准的 PAR1 拮抗剂 vorapaxar，用于治疗高危患者的冠状动脉疾病 34,36,37,60。另一种 PAR1 拮抗剂 pepducin PZ-128 成功完成了一项 II 期研究，以预防心导管插入术患者血栓形成38。Dockendorff 小组专注于另一类小分子的药物化学和药理学，即称为 parmodulins 的 PAR1 配体61,62。与已报道的 PAR1 拮抗剂（如 vorapaxar）不同，parmodulins 是 PAR1 的变构、偏倚调节剂，可选择性阻断 Gαq 通路，同时促进类似于 aPC 的细胞保护作用。与有效的正构 PAR1 拮抗剂（如 vorapaxar）不同，已发表的 parmodulins 也是可逆的 63,64,65。

最初，Flaumenhaft 及其同事鉴定了 parmodulins 抑制血小板中 P-选择素表达或颗粒分泌的能力61,66。然而，需要一种替代方法来研究 parmodulins 对内皮细胞的影响。监测 GPCR 相关信号转导的一种常用方法是测量细胞内 Ca2+ 动员，这是一种重要的次级信使，可以使用合适的细胞内钙结合染料进行测量67,68。已提供的大量证据表明，PAR1 诱导的钙动员是通过激活 Gαq69,70 诱导的。一旦被其栓系配体（或合适的外源配体）激活，PAR1 就会发生构象变化，导致与 Gαq 亚基结合的鸟苷二磷酸 （GDP） 被三磷酸鸟苷 （GTP） 取代68。然后，Gαq 亚基激活磷脂酶 Cβ （PLC-β），后者催化磷脂酰肌醇 4,5 二磷酸 （PIP2） 的水解，形成 1,4,5-肌醇三磷酸 （IP3） 和甘油二酯 （DAG）。最后，IP3 与内质网膜中 IP3 敏感的 Ca2+ 通道结合，使 Ca2+ 被释放到细胞质中，在那里它可以与添加到细胞中的 Ca2+ 依赖性荧光染料（如 Fluo-4）结合71。这个过程在几秒钟内发生，并且可以将 Ca2+ 的浓度增加 100 倍，导致钙结合染料的量发生剧烈变化并产生稳健的荧光信号。

2018 年，Dockendorff 小组发表了一种中等通量 Ca2+ 动员测定法，可用于鉴定 PAR172 的 Gαq 通路的拮抗剂。该测定使用了 EA.hy92673，一种杂交人内皮细胞系，可用于多次传代，PAR1 表达没有明显变化，并用于细胞保护作用的体外测量。

原始方案在 96 孔板中使用 EA.hy926 细胞，并加载 Fluo-4/AM 染料，选择该染料是因为其在 488 nm 处的强烈荧光和高细胞通透性。将染料上样到细胞中后，使用自动化 8 通道液体处理器进行漫长的洗涤步骤（无法获得更快的液体处理方法，例如 96 通道清洗机）。该分析的重现性优于未仔细更换自动化机器人培养基的分析。然后将拮抗剂与细胞一起孵育，通过连续添加选择性激动剂（一次 16 孔）激活 PAR1，并测量钙动员和染料结合引起的荧光变化以确定活性。

虽然该方案允许测量 PAR1 介导的钙动员，但它受到测定每个 96 孔板所需的时间的限制。较长的实验时间是有问题的，不仅因为每天可以筛选的化合物数量有限，还因为染料外排会随着时间的推移而发生，通过增加基础荧光来缩小检测窗口。实验时间长的一个原因是使用 8 通道液体处理器进行板清洗，这为每次实验增加了 30 分钟以上。由于供应链问题，所需的小费也变得难以获得。这里报道了 PAR 介导的钙动员测定的更新方案，该方案不需要液体处理器，因此可以以更高的通量运行。该方案也应适用于测量导致细胞内钙动员的其他 GPCR 的信号传导。这种更新的读板器方案非常适合没有昂贵细胞成像仪器资源但需要快速筛选多种化合物的学术和小型工业实验室。有关使用板成像仪进行钙动员测定的实例，请参见 Caers 等人 74。

研究方案

在以下方案的步骤 1 和 2 中进行的所有培养基更换/添加均在无菌罩中进行。除非另有说明，否则无菌罩中使用的所有塑料器皿必须购买灭菌和密封或通过高压灭菌器进行适当灭菌。

1. EA.hy926 细胞系的启动

  1. 获取 EA.hy926 细胞。
  2. 将小瓶细胞储存在液氮罐的气相中。
  3. 首先在 37 °C 水浴中加热 DMEM、FBS 和笔/链球菌（具体细节见 材料表 ）15-30 分钟，以制备 DMEM 完全培养基。将 50 mL FBS 和 1 mL 笔/链球菌添加到 500 mL DMEM 中。倒置轻轻混合溶液。
    注意： 过度混合会导致气泡量过多。
  4. 从液氮中取出一小瓶细胞，并在 37 °C 水浴中加热 5 分钟。
  5. 通过喷洒酒精对小瓶细胞和 DMEM 完全培养基瓶进行消毒，然后移至无菌罩中。
  6. 使用 1,000 μL 移液器小心地将细胞转移到 15 mL 无菌离心管中。向样品瓶中加入 1 mL DMEM 进行冲洗，然后加入离心管中。
  7. 使用离心机（150 × g，5 分钟，22 °C）制备细胞沉淀。通过抽吸从离心管中去除培养基;小心不要打扰细胞沉淀。
  8. 向离心管中加入 3 mL DMEM 完全培养基，并使用 1,000 μL 移液器混合细胞悬液，轻轻分离沉淀。
    注意：应避免因过度混合而产生气泡，因为这可能会激活或损坏细胞。
  9. 使用带有 20 μL 或 200 μL 吸头的移液管，在微量离心管中将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝混合。将 10 μL 细胞悬液/台盼蓝混合物加入血细胞计数器中，对细胞进行计数。
    注：使用 0.1-10 μL 移液器吸头可以剪切细胞。处理细胞悬液时，不应使用此尺寸的吸头。
  10. 使用 10 mL 或 25 mL 血清移液管向细胞悬液中加入 DMEM 完全培养基，使密度为 66,000 个细胞/mL。将 15 mL 细胞悬液移液到 T-75 培养瓶中。通过将培养瓶从北到南、从东到西移动，确保细胞悬液的均匀分散。
  11. 孵育细胞直至它们达到汇合（通常在 4-6 天后），如在显微镜下检查估计的那样。此时，使用实验中的细胞（从第 2 部分开始）或将它们接种到新培养瓶中进行扩增以制备冷冻原液（每个 T-75 培养瓶在 15 mL 完全培养基中以 1,000,000 个细胞的推荐接种密度）。
    注：细胞可以在培养瓶中生长长达 3 周，而检测中的形状、健康状况或性能没有明显差异。完全培养基应每 3-4 天更换一次。

2. 将 EA.hy926 细胞添加到 96 孔板中

注：来自一个汇合 T-75 培养瓶的细胞可用于制备两个或三个检测板，或选择性地扩增成多达 15 个新鲜的 T-75 培养瓶。在正常工作日中，可以使用第 4 节和第 5 节中的方案筛选至少五个检测板。以下说明描述了制备和测试一个检测板，但可以通过重复步骤 2.2、2.7、2.12 和 3.2 来制备所需数量的检测板来制备其他检测板。最常见的是，每天准备 4 个检测板来测量多达 16 种化合物的浓度反应，这需要两个装有汇合细胞的 T-75 培养瓶。

  1. 将 DMEM 完全培养基在 37 °C 水浴中加热 15-30 分钟。通过喷洒酒精对 DMEM 完全培养基瓶进行消毒，然后将其移至无菌罩中。
  2. 将 100 μL 无菌的 0.4% 明胶溶液添加到带盖的黑壁 96 孔透明底板的所有孔中。将板与明胶溶液在培养箱（37°C，5% CO2 ）中孵育 30 分钟。
  3. 使用倒置显微镜确认 T-75 培养瓶中的细胞 80-100% 汇合。通过抽吸从 T-75 培养瓶中去除 DMEM 完全培养基。
  4. 用 10 mL PBS 洗涤培养瓶中的细胞，然后轻轻地将培养瓶从北到南、从东到西移动。通过抽吸从培养瓶中取出 PBS。
  5. 向培养瓶中加入 5 mL 细胞解离溶液，并在培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育培养瓶 ~12 分钟。6 分钟后轻敲培养瓶以帮助促进解离。
    注：使用参考细胞解离剂孵育细胞超过 15 分钟会导致细胞开始聚集在一起，这使得获得准确的细胞计数更加困难，并可能干扰检测。
  6. 向培养瓶中加入 5 mL 预热的 DMEM 完全培养基，轻轻混入细胞解离溶液/细胞悬液中。使用 10 mL 血清移液管，将细胞悬液加入无菌 50 mL 离心管中。使用离心机（150 × g，5 分钟，22 °C）制备细胞沉淀。
  7. 在形成沉淀时，使用连接到真空的巴斯德移液管通过抽吸从 96 孔板中取出明胶溶液。从去除明胶时开始取下板盖，直到溶液准备好进行电镀。
    注意：可以选择使用连接到真空的多通道移液器或无菌歧管。
  8. 使用连接到真空的巴斯德移液器或血清移液器通过抽吸从离心管中取出培养基;小心不要打扰细胞沉淀。
  9. 使用 5 mL 或 10 mL 血清移液管将新鲜的 DMEM 完全培养基添加到离心管中。将 DMEM 完全培养基与 1,000 μL 移液管或 5 mL 血清移液管混合，轻轻打碎细胞沉淀。
    注：通常使用 8 mL DMEM，但可以添加更高的体积以使细胞计数更容易。
  10. 使用带有 20 μL 或 200 μL 吸头的移液管，在微量离心管中将 10 μL 细胞悬液与 10 μL 台盼蓝混合。将 10 μL 细胞悬液/台盼蓝混合物加入血细胞计数器中，对细胞进行计数。
  11. 使用 10 mL 或 25 mL 血清移液器，将 DMEM 完全培养基添加到细胞悬液中，使密度为 600,000 个细胞/mL。这将在 96 孔板中得到 60,000 个细胞/孔的最终密度（通过实验确定为最佳密度）。
    注：正常成功的细胞培养将产生 12,000,000 到 15,000,000 个细胞，这些细胞可以接种 2 到 3 个 96 孔板。
  12. 通过轻轻倒置离心管混合细胞悬液，并将其添加到 50 mL 多通道移液器储液槽中。每 30 秒轻轻摇动储液槽，将悬浮液混合在储液槽中，使用多通道移液器向每个孔中加入 100 μL 细胞悬液。更换透明板盖，在无菌罩表面从北到南、从东到西轻轻摇晃板，以确保细胞分布均匀。将板在培养箱（37°C，5% CO2 ）中孵育 16-24 小时。
    注：可以使用额外的细胞悬液来制备额外的板，或者可以重复步骤 1.10-1.11 以继续细胞系。

3. 钙动员测定制备

  1. 准备检测试剂。
    1. 向微量离心管中加入 36 mg 丙磺舒并将其溶解在 0.6 M NaOH （500 μL） 中，制备丙磺舒溶液（250 mM，水性）。涡旋溶液。
      注：丙磺舒通过抑制有机离子转运蛋白 75,76,77 改善染料在细胞中的保留。
    2. 要制备 HBSS-HEPES 检测缓冲液，请将 HEPES （1.19 g） 添加到 500 mL 瓶中不含 Ca/Mg/酚红的 HBSS（制备 10 mM HEPES 溶液）。用 MgCl2 （1 M 水溶液，500 μL）和 CaCl2 （1 M 水溶液，500 μL）补充缓冲液。混合溶液并在不使用时储存在 5 °C 的冰箱中。
      1. 对于每个 96 孔板，向 50 mL 离心管中加入 50 mL HBSS-HEPES 检测缓冲液 ，补充 500 μL 丙磺舒溶液，并充分混合。使用前将缓冲液加热至室温。
    3. 通过将 Pluronic F-127 （20 mg） 添加到微量离心管或 HPLC 小瓶中并用 200 μL DMSO 溶解，在 DMSO 中制备 10% Pluronic F-127 溶液。
      注：该溶液可在室温下储存，足以容纳约 30 块板。Pluronic F-127 在室温下溶解非常缓慢，应轻轻加热以促进溶解。
    4. 首先将 24 μL DMSO 添加到一小瓶 Fluo-4/AM （50 μg） 中以溶解染料，以制备 染料上样缓冲液 。在铝箔包裹的 15 mL 离心管中，加入 6 mL HBSS-HEPES 检测缓冲液 ，并补充 6 μL 10% Pluronic F-127 和 6 μL Fluo-4/AM 溶液。短暂涡旋溶液，并在室温下避光静置 10 分钟。
      注：为防止 Fluo-4 发生光漂白，请将铝箔缠绕在含有染料溶液的离心管和测定板的盖子上，使染料避光。
  2. 准备检测板。
    1. 从培养箱中取出检测板，并使用倒置显微镜确认汇合。将 DMEM 完全培养基轻弹到水槽中，然后用纸巾吸干板的顶部，手动去除该培养基。
      注：水平握住板并轻弹，然后将板旋转 180° 并重复，以充分去除培养基。
    2. 将 HBSS-HEPES 检测缓冲液加丙磺舒溶液 添加到 50 mL 多通道移液器溶剂储液器中。
      注意：此溶液将用于以后的洗涤步骤，应放在一边并用铝箔覆盖，直到需要为止。
    3. 用多通道移液器向每个孔中加入 100 μL HBSS-HEPES 检测缓冲液加丙磺舒溶液 ，让细胞在丙磺舒存在下放置 5 分钟。按照与步骤 3.2.1 相同的方式轻弹到水槽中，去除 HBSS-HEPES 测定缓冲液。
    4. 将 染料上样缓冲液 添加到单独的 50 mL 多通道移液器溶剂储液槽中。使用多通道移液器向检测板的每个孔中加入 50 μL 染料上样缓冲液 。将板孵育 45 分钟（37 °C，5% CO2）。
    5. 当板在培养箱中时，准备激动剂/拮抗剂溶液。
      1. 拮抗剂溶液以 31.6 mM 溶液的形式储存在 DMSO 中。在 PCR 管中，用 38 μL 0.1% BSA/水稀释 2 μL 储备液，得到 1.58 mM 溶液。2 μL 该溶液在检测板中的终浓度为 31.6 μM。用 36 μL 5% DMSO/水（不添加 BSA）稀释 4 μL 1.58 mM 拮抗剂溶液，并通过连续稀释制备剩余浓度。
      2. 在 HBSS-HEPES 检测缓冲液中制备 108.3 μM （16.7x） 的 TFLLRN-NH2 溶液，当向检测板的每个孔中加入 6 μL 时，其最终浓度为 6.5 μM。例如，将 2 mg 等分试样的 TFLLRN-NH2 与 5.244 mL HBSS-HEPES 测定缓冲液溶解，得到 0.5 mM 储备液。将 1.083 mL 的该溶液与 3.917 mL 的 HBSS-HEPES 测定缓冲液混合，得到 108.3 μM 的溶液。
        注意：TFLLRN-NH2 溶液在不使用时应储存在 -20 °C 冰箱中。
    6. 从培养箱中取出板，并使用适当设置的荧光显微镜确保染料摄取（通常用于绿色荧光蛋白，参见 图 1 中 Fluo-4 成功加载到细胞中的示例）。以与步骤 3.2.1 相同的方式轻弹板，去除染料上样缓冲液。
    7. 在每个孔中用 50 μL HBSS-HEPES 检测缓冲液加丙磺舒溶液 （来自步骤 3.2.3）洗涤细胞 2 次（通过将培养基轻弹到水槽中去除）。
    8. 向每个孔中加入 92 μL HBSS-HEPES 检测缓冲液，然后再次用荧光显微镜观察细胞，以确保多余的染料已完全去除，并且细胞保持粘附。
    9. 使用多通道移液器将 2 μL 拮抗剂溶液和载体添加到适当的孔中（参见 表 1 的代表性板图）。

4. 进行钙动员测定

  1. 按如下方式设置读板器：温度：37 °C;激发波长：485 nm;发射波长：525 nm;测量高度：7.8 毫米（优化）;闪光次数：100;重复次数：20。
  2. 将板在 37 °C 的读板器中孵育 15 分钟。 测量第 1 列和第 2 列中的背景荧光（每孔扫描 5 次）。
  3. 从读板器中弹出板，并使用多通道移液器从 8 管 PCR 联管中向第 1 列和第 2 列的每个孔中快速添加 6 μL 激动剂溶液。
    注意：对于此步骤，我们使用带有 0.1-10 μL 移液器吸头的电动 8 通道移液器。
  4. 测量细胞中钙动员时荧光的变化。根据上述设置对每个孔执行 20 次扫描。
    注：在两列中扫描每个孔 20 次大约需要 5 分钟（即，每个孔的扫描间隔为 ~15 秒）。
  5. 对第 3-12 列重复步骤 4.2-4.4，以两列为增量。

5. 数据分析

  1. 将分析数据导出为每个两列组的单独电子表格。
  2. 使用函数 AVG（first scan： last scan） 查找基础荧光读数的平均值。对两列中的每口井执行此操作。
  3. 使用函数 MAX（first scan： last scan） 找到添加激动剂后的最大荧光。
  4. 通过从最大荧光中减去基础荧光来计算荧光的变化。
  5. 从同一列中的每个孔中减去为阴性对照（添加不含激动剂的载体）计算的荧光变化。
  6. 通过将每个孔中的荧光变化除以载体 （0.1% DMSO/水） + 6.5 μM TFLLRN-NH2 孔中的荧光变化，找到荧光的相对（归一化）变化。
  7. 将非控制值（百分比）复制到统计和绘图软件程序中。如果使用引用的软件，请选择 XY 表选项，选择 Numbers 作为 X 轴 ，并将 并排子列中的复制值 作为 Y 轴。
  8. 使用该程序从数据中绘制浓度-响应曲线 （CRC）。如果使用引用的软件，请选择 log（inhibitor） vs. response - Variable slope （four parameters） 选项。

结果

该测定的目的通常是为三到四种新的微联蛋白生成浓度-响应曲线 （CRC）。在每个检测板上，通常会生成已知化合物（如 NRD-21）的额外 CRC，由于其已知的 IC50，因此可以作为实验的质量检查。为了生成 CRC，应规划如 表 1 中描述的板图。如果需要单点浓度响应，则应将最终浓度为 10 μM（或其他首选浓度）的化合物添加到至少三个孔中。

讨论

虽然先前报道的方案72 通常是可靠的，并且允许我们识别一种新的先导 parmodulin，但 NRD-21,62 需要一种更有效的方案。在 COVID-19 大流行导致的供应短缺期间，该检测进一步受到影响。获取自动液体处理器的吸头变得困难，尝试清洗、消毒和重复使用吸头产生的 CRC 差异很大。这促进了一系列紧急实验，旨在简化改进的 PAR 驱动的钙动员测...

披露声明

C.D. 是涉及 parmodulins 的专利的发明者，并且是 Function Therapeutics， Inc. 的创始人和股东，该公司正在开发用于临床的 parmodulins。

致谢

我们感谢 Irene Hernandez、Trudy Holyst、Hartmut Weiler 博士（Versiti 血液研究所）和 Leggy Arnold 博士（威斯康星大学密尔沃基分校）为该项目提供空间和间接支持，以及 John McCorvy 博士（威斯康星医学院）的中肯建议。我们感谢美国国家心肺血液研究所 （R15HL127636）、美国国防部 （W81XWH22101） 和美国国家科学基金会 （2223225） 的资助支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

参考文献

  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4 (2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582 (2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -. M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597 (2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062 (2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124 (2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100 (2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -. A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23 (2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516 (2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

Fluo 4 PAR G EA hy926 PAR Parmodulin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。