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要約

プロテアーゼ活性化受容体(PAR)のリガンドを同定するために使用される、内皮細胞を用いたカルシウム動員アッセイの改良されたプロトコルが開発されました。新しいプロトコルにより、合計アッセイ時間が90〜120分短縮され、再現性のある濃度-反応曲線が得られます。

要約

細胞内カルシウム濃度の変化は、細胞内、蛍光、カルシウム結合性色素、および最大1,536ウェルからの蛍光発光を同時に測定できるイメージング機器を使用して、ハイスループットで迅速にモニタリングされます。しかし、これらの機器ははるかに高価であり、ウェルを個別にスキャンする広く利用可能なプレートリーダーと比較して、保守が困難な場合があります。ここでは、内皮細胞株(EA.hy926)と併用して、プロテアーゼ活性化受容体(PAR)によるGαq シグナル伝達の活性化と、それに続くカルシウムの動員を測定するための最適化されたプレートリーダーアッセイについて説明します。このアッセイは、ドッケンドルフ研究室で同定されたアロステリックPAR1を標的とする抗炎症性「パルモジュリン」リガンドを含む、さまざまなPARリガンドの特性評価に使用されています。このプロトコルは、自動化されたリキッドハンドラーの必要性を排除し、96ウェルプレートのPARリガンドのミディアムスループットスクリーニングを可能にし、カルシウムの動員を開始する他の受容体の研究に適用できるはずです。

概要

プロテアーゼ活性化受容体(PAR)1,2,3は、血小板細胞や内皮細胞4,5,6,7を含む様々な細胞タイプで発現するクラスA Gタンパク質共役受容体(GPCR)のサブファミリーである。大多数のGPCRとは異なり、PARは独自の分子内活性化モードを持っています。ほとんどのGPCRは、明確な結合ポケットと相互作用する可溶性リガンドによって活性化されますが、PARはN末端のタンパク質分解性切断によって活性化され、その結果、細胞表面の細胞外ループ2ドメインと相互作用できる新しいテザーリガンドが得られます6,8,9。この相互作用は受容体を活性化し、いくつかのシグナル伝達経路を開始し、炎症や血小板活性化などの効果を促進することができる4,10,11,12。異なるプロテアーゼは、N末端のユニークな部位での切断を通じてPARを活性化することができ、受容体の立体配座を安定化させる異なるテザーリガンド(TL)を明らかにし、異なるシグナル伝達経路を開始する9,13,14,15。例えば、サブファミリーの中で最もよく研究されているメンバーであるPAR1では、トロンビンによる切断は、血小板の活性化や内皮への白血球の動員など、多数の生物学的プロセスをサポートするために使用されますが、受容体が過剰発現または過剰に活性化されると有害な影響をもたらす可能性があります4,16,17,18,19,20,21 .逆に、活性化プロテインC(aPC)による切断は、抗炎症作用および内皮バリアの維持を促進することができる15,22,23,24,25,26,27,28,29。PARはまた、TLのペプチド類似体によって分子間的に活性化することもできる13,30,31。これらのペプチドは、PARターゲティングプロテアーゼの代わりにPAR阻害(調節)を測定するために日常的に使用されており、このプロトコルで使用されます。

病理学的PAR1シグナル伝達には、敗血症22,32、心血管疾患33,34,35,36,37,38、腎臓病39,40,41,42、鎌状赤血球症43、線維症44、骨粗鬆症および変形性関節症45など、多数の障害が関連しています、46、神経変性47、48、49、50、51、および癌52、53、54、55、56、57、58、59.PAR1のアンタゴニストは、1990年代から心血管疾患の抗血小板薬として研究されており、この受容体に関連する疾患のリストが増加する中、生物学的プローブ(ツール化合物)または潜在的な治療薬として使用するための新規リガンドの同定が必要とされています。現在、FDAが承認したPAR1拮抗薬は、高リスク患者34,36,37,60の冠状動脈疾患の治療に使用されるボラパキサールの1つだけです。代替のPAR1拮抗薬であるペプデューシンPZ-128は、心臓カテーテル検査患者の血栓症を予防するための第II相試験を成功裏に完了した38。ドッケンドルフグループは、パルモジュリン61,62として知られる別のクラスの低分子であるPAR1リガンドの医薬品化学および薬理学に焦点を当ててきました。ボラパクサールなどの報告されたPAR1拮抗薬とは異なり、パルモジュリンはアロステリックで偏ったPAR1のモジュレーターであり、Gαq経路を選択的にブロックしながら、aPCと同様の細胞保護効果を促進します。ボラパキサールのような強力なオルソステリックPAR1アンタゴニストとは異なり、公表されたパルモジュリンも可逆的である63,64,65。

最初に、パルモジュリンは、血小板61,66のP-セレクチン発現または顆粒分泌を阻害する能力について、Flaumenhaftおよび同僚によって同定されました。しかし、内皮細胞に対するパルモジュリンの影響を研究するためには、別の方法が必要でした。GPCR関連のシグナル伝達をモニタリングする一般的な方法の1つは、適切な細胞内カルシウム結合色素67,68を用いて測定できる重要な二次メッセンジャーである細胞内Ca2+の動員を測定することである。PAR1によって誘発されるカルシウム動員は、Gαq69,70の活性化によるものであることを示す実質的な証拠が提供されています。そのつながれた配位子(または適切な外因性配位子)によって活性化されると、PAR1は構造変化を起こし、Gαqサブユニットに結合したグアノシン二リン酸(GDP)がグアノシン三リン酸(GTP)に置き換えられます68。次に、GαqサブユニットはホスホリパーゼCβ(PLC-β)を活性化し、ホスファチジルイノシトール4,5ビスホスフェート(PIP2)の加水分解を触媒し、1,4,5-イノシトール三リン酸(IP3)とジアシルグリセロール(DAG)を形成します。最後に、IP3は、小胞体の膜におけるIP3感受性Ca2+チャネルに結合し、Ca2+が細胞質に放出されることを可能にし、そこで細胞71に添加されるFluo-4のようなCa2+依存性蛍光色素に結合することができる。このプロセスは数秒以内に発生し、Caの濃度を2+100倍に増加させ、カルシウム結合色素の量が大幅に変化し、強力な蛍光シグナルが得られます。

2018年、ドッケンドルフのグループは、PAR172のGαq経路のアンタゴニストを同定するために使用できるミディアムスループットのCa2+動員アッセイを発表しました。このアッセイでは、ハイブリッドヒト内皮細胞株であるEA.hy92673を使用しましたが、これはPAR1発現に顕著な変化なしに複数の継代に使用できるほか、細胞保護効果のin vitro測定に確立されています。

元のプロトコルでは、EA.hy926細胞を96ウェルプレートに充填し、488 nmの強い蛍光と高い細胞透過性のために選択されたFluo-4/AM色素をロードしました。色素が細胞にロードされると、自動化された8チャンネルのリキッドハンドラーで長い洗浄ステップが実行されました(96チャンネルウォッシャーなどのより高速なリキッドハンドリング方法は利用できませんでした)。このアッセイの再現性は、慎重な自動化されたロボット培地の変更がない場合よりも優れていました。次に、アンタゴニストを細胞とインキュベートし、選択的アゴニストを逐次添加してPAR1を活性化し(一度に16ウェル)、カルシウムの動員と色素結合による蛍光の変化を測定して活性を決定しました。

このプロトコルでは、PAR1を介したカルシウム動員の測定が可能ですが、各96ウェルプレートのアッセイに必要な時間には制限があります。実験時間が長いと、1日にスクリーニングできる化合物の数が限られているだけでなく、時間の経過とともに色素の流出が発生し、基礎蛍光が増加することでアッセイウィンドウが狭くなるため、問題があります。実験時間が長い原因の1つは、プレート洗浄に8チャンネルのリキッドハンドラーを使用していることであり、これにより各実験に30分以上かかります。また、サプライチェーンの問題により、必要なチップの入手も困難になりました。ここでは、PAR媒介カルシウム動員アッセイの更新されたプロトコルが報告されており、リキッドハンドラーを必要としないため、より高いスループットで実行できます。このプロトコルは、細胞内カルシウムの動員につながる他のGPCRとのシグナル伝達の測定にも適しているはずです。この更新されたプレートリーダープロトコルは、高価な細胞イメージング装置のためのリソースはないが、多数の化合物を迅速にスクリーニングする必要がある学術および小規模な産業ラボに最適です。プレートイメージャーを使用したカルシウム動員アッセイの例については、Caers et al.74を参照してください。

プロトコル

以下のプロトコールのステップ1および2で行われたすべての培地交換/添加は、滅菌フード内で行われます。特に明記されていない限り、滅菌フードに使用されるすべてのプラスチック製品は、滅菌して購入し、滅菌して密封するか、オートクレーブを介して適切に滅菌する必要があります。

1. EA.hy926細胞株の作製開始

  1. EA.hy926細胞を取得します。
  2. 細胞のバイアルを液体窒素タンクの気相で保存します。
  3. まず、DMEM、FBS、およびペン/連鎖球菌(具体的な詳細は 材料の表 を参照)を37°Cの水浴で15〜30分間温めて、DMEM一式培地を調製します。500 mLのDMEMに50 mLのFBSと1 mLのペン/連鎖球菌を加えます。.溶液を反転させて穏やかに混合します。
    注意: 激しく混合しすぎると、気泡が過剰に発生します。
  4. 液体窒素から細胞のバイアル1つを取り出し、37°Cの水浴で5分間温めます。
  5. 細胞のバイアルとDMEM完全培地のボトルをアルコールを噴霧して滅菌し、滅菌フードに移動します。
  6. 1,000 μLのピペットを使用して、細胞を15 mLの滅菌遠心チューブに慎重に移します。バイアルに1 mLのDMEMを加えてすすぎ、遠心チューブに加えます。
  7. 遠心分離機(150 × g、5分、22°C)を使用して細胞のペレットを作成します。吸引により遠心分離管から媒体を取り出します。細胞ペレットを乱さないように注意してください。
  8. 3 mLのDMEM完全培地を遠心チューブに加え、1,000 μLのピペットを使用して細胞懸濁液を混合してペレットを穏やかに分離します。
    注:激しく混合しすぎて気泡を発生させると、細胞が活性化または損傷する可能性があるため、避ける必要があります。
  9. チップが20 μLまたは200 μLのピペットを使用して、微量遠心チューブ内で10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを混合します。細胞懸濁液/トリパンブルー混合物10μLを血球計算盤に加え、細胞をカウントします。
    注:0.1〜10μLのピペットチップを使用すると、細胞をせん断できます。このサイズのチップは、細胞懸濁液の取り扱い中に使用しないでください。
  10. DMEM完全培地を細胞懸濁液に加え、10 mLまたは25 mLの血清ピペットを使用して66,000細胞/mLの密度にします。15 mLの細胞懸濁液をT-75培養フラスコにピペットで移します。フラスコを北から南、東から西に移動させることにより、細胞懸濁液が均等に分散するようにします。
  11. 顕微鏡下での検査によって推定されるように、細胞がコンフルエントに達するまで(通常は4〜6日後)細胞をインキュベートします。この時点で、実験の細胞を使用するか(セクション2から開始)、または新しいフラスコに播種して増殖させ、凍結ストックを調製します(T-75フラスコあたり15 mLの完全培地に1,000,000個の細胞の推奨播種密度で)。
    注:細胞は、アッセイの形状、健康状態、または性能に顕著な違いなく、培養フラスコ内で3週間も増殖させることができます。完全な培地は3〜4日ごとに交換する必要があります。

2. EA.hy926細胞の96ウェルプレートへの添加

注:1つのコンフルエントT-75培養フラスコからの細胞は、2つまたは3つのアッセイプレートを調製するために使用することも、オプションで最大15個の新鮮なT-75フラスコに拡張することもできます。通常の就業日には、セクション4および5のプロトコルを使用して、少なくとも5つのアッセイプレートをスクリーニングできます。以下の説明では、1つのアッセイプレートの調製と試験について説明していますが、ステップ2.2、2.7、2.12、および3.2を繰り返して、必要な数のアッセイプレートを調製することで、追加のプレートを調製できます。最も一般的には、最大16種類の化合物の濃度反応を測定するために、1日あたり4枚のアッセイプレートが調製されますが、これにはコンフルエントセルを備えた2つのT-75フラスコが必要です。

  1. DMEM完全培地を37°Cのウォーターバスで15〜30分間温めます。DMEMコンプリートメディウムのボトルにアルコールを噴霧して滅菌し、滅菌フードに移動します。
  2. 滅菌した0.4%ゼラチン溶液100 μLを、蓋付きの黒壁96ウェル透明底プレートのすべてのウェルに加えます。プレートをゼラチン溶液とインキュベーター(37°C、5%CO2)で30分間インキュベートします。
  3. 倒立顕微鏡を使用して、T-75培養フラスコ内の細胞が80〜100%コンフルエントであることを確認します。吸引により、DMEMコンプリートメディウムをT-75フラスコから取り外します。
  4. フラスコ内の細胞を10mLのPBSで洗浄し、フラスコを北から南、東から西にゆっくりと動かします。吸引によりフラスコからPBSを取り外します。
  5. 5 mLの細胞解離溶液をフラスコに加え、インキュベーター(37°C、5%CO2)でフラスコを~12分間インキュベートします。6分後にフラスコを軽くたたいて、解離を促進します。
    注:参照された細胞解離剤と細胞を15分以上インキュベートすると、細胞が凝集し始め、正確な細胞数を得ることが難しくなり、アッセイに支障をきたす可能性があります。
  6. 予熱したDMEM完全培地5 mLをフラスコに加え、細胞解離溶液/細胞懸濁液に穏やかに混合します。10 mLの血清ピペットを使用して、細胞懸濁液を滅菌済みの50 mL遠心チューブに加えます。遠心分離機(150 × g、5分、22°C)を使用して細胞のペレットを作成します。
  7. ペレットが形成されている間に、真空に接続されたパスツールピペットを使用して吸引することにより、96ウェルプレートからゼラチン溶液を除去します。ゼラチンの除去時から溶液をめっきする準備が整うまで、プレートの蓋を取り外してください。
    注:真空に接続されたマルチチャンネルピペットまたは滅菌マニホールドをオプションで使用することができます。
  8. 真空または血清ピペットに接続されたパスツールピペットを使用して吸引することにより、遠心分離管から培地を取り出します。細胞ペレットを乱さないように注意してください。
  9. 5 mLまたは10 mLの血清ピペットを使用して、新鮮なDMEM完全培地を遠心チューブに加えます。DMEM完全培地を1,000 μLピペットまたは5 mL血清ピペットと混合して、細胞ペレットを穏やかに砕きます。
    注:通常、8ミリリットルのDMEMが使用されますが、細胞のカウントを容易にするために、より多くのDMEMを追加することができます。
  10. チップが20 μLまたは200 μLのピペットを使用して、微量遠心チューブ内で10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを混合します。細胞懸濁液/トリパンブルー混合物10μLを血球計算盤に加え、細胞をカウントします。
  11. DMEM完全培地を細胞懸濁液に加え、10 mLまたは25 mLの血清ピペットを使用して600,000細胞/mLの密度を作製します。これにより、96ウェルプレートで60,000細胞/ウェルの最終密度が得られます(実験により最適な密度であると決定されました)。
    注:通常の成功した細胞培養では、12,000,000〜15,000,000個の細胞が得られ、2〜3枚の96ウェルプレートを播種できます。
  12. 遠心チューブを静かに反転させて細胞懸濁液を混合し、50 mLマルチチャンネルピペットリザーバーに加えます。リザーバーを左右に穏やかに揺さぶることにより、リザーバー内の懸濁液を30秒ごとに混合し、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルに100μLの細胞懸濁液を加えます。透明プレートカバーを取り付け、プレートを無菌フードの表面にスライドさせて北から南、東から西にスライドさせて軽く振ると、細胞が均一に分布するようにします。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)で16〜24時間インキュベートします。
    注:追加の細胞懸濁液を使用して追加のプレートを調製することも、ステップ1.10〜1.11を繰り返して細胞株を継続することもできます。

3. カルシウム動員アッセイの調製

  1. アッセイ試薬を調製します。
    1. 36 mgのプロベネシドを微量遠心チューブに添加し、0.6 M NaOH(500 μL)に溶解して、プロベネシド溶液(250 mM、水溶液)を調製します。解決策をボルテックスします。
      注:プロベネシドは、有機イオントランスポーター75,76,77を阻害することにより、細胞内の色素の保持を改善する。
    2. HBSS-HEPESアッセイバッファーを作製するには、Ca/Mg/フェノールレッドフリーHBSSの500 mLボトルにHEPES(1.19 g)を加えます(HEPESの10 mM溶液を作製します)。バッファーにMgCl2(1 M水溶液、500 μL)およびCaCl2(1 M水溶液、500 μL)を添加します。溶液を混合し、使用しないときは5°Cの冷蔵庫で保存してください。
      1. 96ウェルプレートごとに、50 mLの HBSS-HEPESアッセイバッファー を50 mLの遠心チューブに加え、500 μLのプロベネシド溶液を添加してよく混合します。使用前にバッファーを室温まで温めてください。
    3. 微量遠心チューブまたはHPLCバイアルにPluronic F-127(20 mg)を加え、200 μLのDMSOで溶解することにより、DMSO中の10%プルロニックF-127溶液を作製します。
      注:この溶液は室温で保存でき、約30枚のプレートに十分です。プルロニックF-127は室温で非常にゆっくりと溶解するため、溶解を促進するために穏やかに加熱する必要があります。
    4. まず、24 μLのDMSOをFluo-4/AM(50 μg)のバイアルに加えて色素を溶解し、 色素ローディングバッファー を調製します。ホイルで包んだ15 mLの遠心分離チューブに、6 mLの HBSS-HEPESアッセイバッファー を加え、6 μLの10% Pluronic F-127と6 μLのFluo-4/AM溶液を補充します。溶液を短時間ボルテックスし、室温で光を避けて10分間放置します。
      注:Fluo-4の光退色を防ぐために、色素溶液を含む遠心分離管とアッセイプレートの蓋にアルミホイルを巻き付けて、染料を光から遠ざけてください。
  2. アッセイプレートを調製します。
    1. アッセイプレートをインキュベーターから取り外し、倒立顕微鏡を使用してコンフルエントを確認します。DMEMコンプリートメディアを手動で取り外すには、シンクにフリックし、プレートの上部をペーパータオルで吸い取ります。
      注意: プレートを水平に保持してはじき、続いてプレートを180°回転させて繰り返すことにより、媒体が十分に除去されます。
    2. HBSS-HEPESアッセイバッファーとプロベネシド溶液を50 mLマルチチャンネルピペット溶媒リザーバーに加えます。
      注:この溶液は後の洗浄手順に使用されるため、必要になるまで脇に置いてアルミホイルで覆う必要があります。
    3. マルチチャンネルピペットで各ウェルに HBSS-HEPESアッセイバッファーとプロベネシド溶液 100 μLを加え、細胞をプロベネシドの存在下に5分間放置します。ステップ3.2.1と同じ方法でシンクにフリックして、HBSS-HEPESアッセイバッファーを取り出します。
    4. 別の50 mLマルチチャンネルピペット溶媒リザーバーに 色素ローディングバッファー を添加します。マルチチャンネルピペットを使用して、アッセイプレートの各ウェルに50 μLの 色素ローディングバッファー を添加します。プレートを45分間インキュベートします(37°C、5%CO2)。
    5. プレートがインキュベーター内にある間に、アゴニスト/アンタゴニスト溶液を調製します。
      1. アンタゴニスト溶液は、31.6 mM溶液としてDMSOに保存されます。PCRチューブで、2 μLのストック溶液を38 μLの0.1% BSA/水で希釈し、1.58 mM溶液を得ます。この溶液を2 μL使用すると、アッセイプレートの最終濃度は31.6 μMになります。1.58 mMアンタゴニスト溶液4 μLを5% DMSO/水(BSA添加なし)36 μLで希釈し、残りの濃度を段階希釈して調製します。
      2. HBSS-HEPESアッセイバッファーにTFLLRN-NH2の108.3 μM(16.7x)溶液を調製すると、アッセイプレートの各ウェルに6 μLを添加すると、最終濃度は6.5 μMになります。例えば、2 mg アリコートの TFLLRN-NH2 を 5.244 mL の HBSS-HEPES アッセイバッファーに溶解して、0.5 mM のストック溶液を得ます。この溶液1.083 mLを3.917 mLのHBSS-HEPESアッセイバッファーと混合して、108.3 μM溶液を得ます。
        注:TFLLRN-NH2 溶液は、使用しないときは-20°Cの冷凍庫で保存する必要があります。
    6. インキュベーターからプレートを取り出し、適切な環境で蛍光顕微鏡を使用して色素の取り込みを確認します(通常、緑色蛍光タンパク質の場合、細胞に正常にロードされたFluo-4の例については 図1 を参照してください)。ステップ3.2.1と同じ方法でプレートをフリックして、染料ローディングバッファーを取り出します。
    7. 各ウェルで50 μLの HBSS-HEPESアッセイバッファーとプロベネシド溶液 (ステップ3.2.3から)で細胞を2回洗浄します(培地をシンクにフリックして除去します)。
    8. 各ウェルに92 μLのHBSS-HEPESアッセイバッファーを添加し、再度蛍光顕微鏡で細胞を観察して、余分な色素が完全に除去され、細胞が接着したままであることを確認します。
    9. マルチチャンネルピペットを使用して、2 μLのアンタゴニスト溶液とビヒクルを適切なウェルに添加します(代表的なプレートマップについては 表1 を参照)。

4. カルシウム動員アッセイの実施

  1. プレートリーダーを次のように設定します:温度:37°C;励起波長:485 nm;発光波長:525nm;測定高さ:7.8 mm(最適化);フラッシュの数:100;繰り返し回数:20回。
  2. プレートリーダーでプレートを37°Cで15分間インキュベートします。 カラム 1 および 2 のバックグラウンド蛍光を測定します(ウェルあたり 5 回のスキャン)。
  3. プレートリーダーからプレートを取り出し、マルチチャンネルピペットを使用して、8チューブPCRストリップのカラム1および2の各ウェルに6 μLのアゴニスト溶液を迅速に加えます。
    注:このステップでは、0.1〜10μLのピペットチップを備えた電動8チャンネルピペットを使用します。
  4. 細胞内でカルシウムの動員が起こるときの蛍光の変化を測定します。上記の設定に従って、各ウェルのスキャンを20回実行します。
    注:各ウェルを2列ずつ20回ずつスキャンするには、約5分かかります(つまり、各ウェルのスキャン間は~15秒)。
  5. 列 3 から 12 に対して、手順 4.2 から 4.4 を 2 列ずつ繰り返します。

5. データ分析

  1. アッセイからデータを 2 列グループごとに個別のスプレッドシートとしてエクスポートします。
  2. 機能 AVG(first scan:last scan)を使用して、基礎蛍光測定値の平均を求めます。これは、両方の列のすべてのウェルに対して行います。
  3. アゴニスト添加後の最大蛍光は、 MAX(First scan:Last Scan)機能を用いて求めます。
  4. 最大蛍光から基礎蛍光を差し引いて、蛍光の変化を計算します。
  5. ネガティブコントロール(アゴニストを含まないビヒクルの追加)について計算された蛍光の変化を、同じカラムの各ウェルから差し引きます。
  6. 蛍光の相対的な(正規化された)変化を求めるには、各ウェルの蛍光の変化をビヒクル内の蛍光の変化(0.1% DMSO/水)+ 6.5 μM TFLLRN-NH2 ウェルで割ります。
  7. 非制御値をパーセンテージとして、統計およびグラフ作成ソフトウェアプログラムにコピーします。参照されているソフトウェアを使用している場合は、XYテーブルオプションを選択し、数値をX軸として選択し、サイドバイサイドのサブカラムの値をY軸として複製します。
  8. このプログラムを使用して、データから濃度反応曲線(CRC)をプロットします。参照されているソフトウェアを使用する場合は、 log(inhibitor) vs. response - Variable slope (4 つのパラメーター) オプションを選択します。

結果

このアッセイの目的は、一般に、3〜4個の新しいパルモジュリンの濃度反応曲線(CRC)を作成することです。各アッセイプレートでは、既知の化合物、例えばNRD-21に対する追加のCRCがしばしば生成され、既知のIC50により実験の品質チェックとして機能します。CRCを生成するには、 表1 に示されているようなプレートマップを計画する必要があります...

ディスカッション

以前に報告されたプロトコル72は一般的に信頼性が高く、新しいリードパルモジュリンであるNRD-21,62を特定することができましたが、より効率的なプロトコルが望まれていました。このアッセイは、COVID-19のパンデミックによって引き起こされた供給不足の間にさらに損なわれました。自動リキッドハンドラーのチップを入手する?...

開示事項

C.D.は、パルモジュリンに関する特許の発明者であり、臨床用パルモジュリンを開発しているFunction Therapeutics, Inc.の創設者であり、株主でもあります。

謝辞

このプロジェクトにスペースを提供し、間接的に支援してくださったIrene Hernandez氏、Trudy Holyst氏、Hartmut Weiler博士(Versiti Blood Research Institute)、Leggy Arnold博士(ウィスコンシン大学ミルウォーキー校)、および適切なアドバイスを提供してくださったJohn McCorvy博士(ウィスコンシン医科大学)に感謝します。National Heart, Lung, and Blood Institute(R15HL127636)、U.S. Dept. of Defense(W81XWH22101)、National Science Foundation(2223225)の助成金支援に感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

参考文献

  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4 (2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582 (2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -. M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597 (2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062 (2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124 (2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100 (2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -. A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23 (2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516 (2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

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