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Resumo

Um protocolo aprimorado para um ensaio de mobilização de cálcio com células endoteliais, usado para identificar ligantes de receptores ativados por protease (PARs), foi desenvolvido. O novo protocolo reduz o tempo total de ensaio em 90-120 min e produz curvas de concentração-resposta reprodutíveis.

Resumo

As mudanças na concentração de cálcio nas células são rapidamente monitoradas de forma de alto rendimento com o uso de corantes intracelulares, fluorescentes e de ligação ao cálcio e instrumentos de imagem que podem medir as emissões fluorescentes de até 1.536 poços simultaneamente. No entanto, esses instrumentos são muito mais caros e podem ser difíceis de manter em relação aos leitores de placas amplamente disponíveis que escaneiam os poços individualmente. Aqui é descrito um ensaio otimizado de leitor de placas para uso com uma linhagem de células endoteliais (EA.hy926) para medir a ativação acionada pelo receptor ativado por protease (PAR) da sinalização Gαq e subsequente mobilização de cálcio usando o corante de ligação ao cálcio Fluo-4. Este ensaio foi usado para caracterizar uma variedade de ligantes PAR, incluindo os ligantes anti-inflamatórios alostéricos de "parmodulina" direcionados a PAR1 identificados no laboratório de Dockendorff. Este protocolo evita a necessidade de um manipulador de líquido automatizado e permite a triagem de médio rendimento de ligantes PAR em placas de 96 poços e deve ser aplicável ao estudo de outros receptores que iniciam a mobilização de cálcio.

Introdução

Os receptores ativados por protease (PARs)1,2,3 são uma subfamília de receptores acoplados à proteína G classe A (GPCRs) que são expressos em uma variedade de tipos de células, incluindo plaquetas e células endoteliais 4,5,6,7. Ao contrário da maioria dos GPCRs, os PARs têm um modo intramolecular único de ativação. A maioria dos GPCRs é ativada por ligantes solúveis interagindo com uma bolsa de ligação distinta, mas os PARs são ativados pela clivagem proteolítica do terminal N, o que resulta em um novo ligante amarrado que pode interagir com o domínio da alça extracelular 2 na superfície de uma célula 6,8,9. Essa interação ativa o receptor e pode iniciar várias vias de sinalização, promovendo efeitos como inflamação e ativação plaquetária 4,10,11,12. Diferentes proteases podem ativar PARs por meio de clivagem em locais únicos no terminal N, revelando diferentes ligantes amarrados (TL) que estabilizam as conformações do receptor, que iniciam diferentes vias de sinalização 9,13,14,15. Por exemplo, no membro mais bem estudado da subfamília, PAR1, a clivagem pela trombina é usada para apoiar vários processos biológicos, incluindo ativação plaquetária e recrutamento de leucócitos para o endotélio, mas pode levar a efeitos deletérios quando o receptor é superexpresso ou superativado 4,16,17,18,19,20,21 . Por outro lado, a clivagem pela proteína C ativada (aPC) pode promover efeitos anti-inflamatórios e manutenção das barreiras endoteliais 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Os PARs também podem ser ativados por análogos peptídicos dos TLs de forma intermolecular 13,30,31. Esses peptídeos são rotineiramente usados para medir a inibição (modulação) de PAR no lugar de proteases direcionadas a PAR, e são usados neste protocolo.

Numerosos distúrbios estão associados à sinalização patológica de PAR1, incluindo sepse22,32, doença cardiovascular 33,34,35,36,37,38, doença renal 39,40,41,42, doença falciforme43, fibrose 44, osteoporose e osteoartrite45,46, neurodegeneração 47,48,49,50,51 e câncer 52,53,54,55,56,57,58,59. Os antagonistas do PAR1 têm sido estudados desde a década de 1990 como agentes antiplaquetários para doenças cardiovasculares, e a crescente lista de doenças associadas ao receptor requer a identificação de novos ligantes para uso como sondas biológicas (compostos de ferramentas) ou como potenciais terapêuticos. Atualmente, existe apenas um antagonista PAR1 aprovado pela FDA, o vorapaxar, que é usado para tratar a doença arterial coronariana em pacientes de alto risco 34,36,37,60. Um antagonista alternativo de PAR1, a pepducina PZ-128, completou um estudo de fase II bem-sucedido para prevenir trombose em pacientes com cateterismo cardíaco38. O grupo de Dockendorff concentrou-se na química medicinal e farmacologia de uma classe separada de pequenas moléculas, ligantes PAR1 conhecidos como parmodulinas 61,62. Ao contrário dos antagonistas de PAR1 relatados, como o vorapaxar, as parmodulinas são moduladores alostéricos e tendenciosos de PAR1 que bloqueiam seletivamente a via Gαq enquanto promovem efeitos citoprotetores semelhantes ao aPC. Ao contrário dos potentes antagonistas ortostéricos de PAR1, como o vorapaxar, as parmodulinas publicadas também são reversíveis 63,64,65.

Inicialmente, as parmodulinas foram identificadas por Flaumenhaft e colaboradores por sua capacidade de inibir a expressão da P-selectina ou a secreção de grânulos nas plaquetas61,66. No entanto, um método alternativo foi necessário para estudar os efeitos das parmodulinas nas células endoteliais. Um método comum para monitorar a sinalização relacionada ao GPCR é medir a mobilização intracelular de Ca2+, um importante mensageiro secundário que pode ser medido usando um corante de ligação de cálcio intracelular adequado67,68. Evidências substanciais foram fornecidas mostrando que a mobilização de cálcio induzida por PAR1 é através da ativação de Gαq69,70. Uma vez ativado por seu ligante ligado (ou um ligante exógeno adequado), o PAR1 sofre uma mudança conformacional que faz com que o difosfato de guanosina (GDP) ligado à subunidade Gαq seja substituído por trifosfato de guanosina (GTP) 68 . A subunidade Gαq então ativa a fosfolipase Cβ (PLC-β), que catalisa a hidrólise do fosfatidilinositol 4,5 bifosfato (PIP2), formando trifosfato de 1,4,5-inositol (IP3) e diacilglicerol (DAG). Finalmente, o IP3 se liga aos canais de Ca2+ sensíveis ao IP3 na membrana do retículo endoplasmático, permitindo que o Ca2+ seja liberado no citoplasma, onde pode se ligar a corantes fluorescentes dependentes de Ca2+, como o Fluo-4, que são adicionados às células71. Esse processo ocorre em segundos e pode aumentar a concentração de Ca2+ em 100 vezes, levando a uma mudança drástica na quantidade de corante ligado ao cálcio e a um sinal de fluorescência robusto.

Em 2018, o grupo de Dockendorff divulgou um ensaio de mobilização de Ca2+ de médio rendimento que poderia ser usado para identificar antagonistas da via Gαq de PAR172. O ensaio utilizou EA.hy92673, uma linhagem de células endoteliais humanas híbridas, que pode ser usada para múltiplas passagens sem uma alteração perceptível na expressão de PAR1, e é estabelecida para medições in vitro de efeitos citoprotetores.

O protocolo original utilizava células EA.hy926 em placas de 96 poços e carregadas com corante Fluo-4/AM, que foi escolhido devido à sua intensa fluorescência a 488 nm e alta permeabilidade celular. Uma vez que o corante foi carregado nas células, longas etapas de lavagem foram realizadas com um manipulador de líquido automatizado de 8 canais (métodos mais rápidos de manuseio de líquidos, como uma lavadora de 96 canais, eram inacessíveis). A reprodutibilidade deste ensaio foi superior àquela sem as mudanças cuidadosas e automatizadas de meios robóticos. Os antagonistas foram então incubados com as células, o PAR1 foi ativado através da adição sequencial de um agonista seletivo (16 poços por vez) e as alterações na fluorescência resultantes da mobilização de cálcio e ligação do corante foram medidas para determinar a atividade.

Embora este protocolo permita a medição da mobilização de cálcio mediada por PAR1, ele é limitado pelo tempo necessário para analisar cada placa de 96 poços. Longos tempos de experimento são problemáticos não apenas porque o número de compostos que podem ser rastreados a cada dia é limitado, mas também porque o efluxo de corante ocorre ao longo do tempo, estreitando a janela de ensaio aumentando a fluorescência basal. Um contribuinte para o longo tempo do experimento é o uso de um manipulador de líquidos de 8 canais para lavagem de chapas, que adiciona mais de 30 minutos a cada experimento. As dicas necessárias também se tornaram difíceis de obter devido a problemas na cadeia de suprimentos. Aqui, é relatado um protocolo atualizado para o ensaio de mobilização de cálcio mediado por PAR que não requer um manipulador de líquido e, portanto, pode ser executado em maior rendimento. Este protocolo também deve ser adequado para medir a sinalização com outros GPCRs que levam à mobilização intracelular de cálcio. Este protocolo de leitor de placas atualizado é ideal para laboratórios acadêmicos e industriais pequenos que não têm recursos para instrumentos caros de imagem celular, mas precisam rastrear rapidamente vários compostos. Para um exemplo de um ensaio de mobilização de cálcio usando um imageador de placas, ver Caers et al.74.

Protocolo

Todas as trocas/adições de mídia feitas nas etapas 1 e 2 do protocolo a seguir são realizadas em uma coifa estéril. Salvo indicação em contrário, todos os utensílios de plástico usados no capô estéril devem ser adquiridos esterilizados e selados ou esterilizados adequadamente por autoclave.

1. Iniciação da linhagem celular EA.hy926

  1. Adquira células EA.hy926.
  2. Armazene o(s) frasco(s) para injetáveis de células na fase de vapor de um tanque de nitrogênio líquido.
  3. Prepare o meio completo de DMEM aquecendo primeiro DMEM, FBS e caneta/estreptococo (consulte a Tabela de Materiais para detalhes específicos) em banho-maria a 37 °C por 15-30 min. Adicione 50 mL de FBS e 1 mL de caneta/estreptococo a 500 mL de DMEM. Misture suavemente a solução por inversão.
    NOTA: Misturar com muita força causa quantidades excessivas de bolhas.
  4. Remover um frasco para injetáveis de células de azoto líquido e aquecer num banho-maria a 37 °C durante 5 min.
  5. Esterilize o frasco de células e o frasco de meio completo DMEM pulverizando com álcool e, em seguida, passe para o capuz estéril.
  6. Use uma pipeta de 1.000 μL para transferir cuidadosamente as células para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Adicione 1 ml de DMEM ao frasco para enxaguar e adicione ao tubo de centrifugação.
  7. Fazer um grânulo de células com uma centrifugadora (150 × g, 5 min, 22 °C). Remover o meio do tubo de centrifugação por aspiração; Tenha cuidado para não perturbar o pellet celular.
  8. Adicione 3 mL de meio completo DMEM ao tubo de centrífuga e quebre suavemente o pellet misturando a suspensão celular usando uma pipeta de 1.000 μL.
    NOTA: Deve-se evitar causar bolhas ao misturar com muita força, pois isso pode ativar ou danificar as células.
  9. Misturar 10 μL da suspensão celular com 10 μl de azul de tripano num tubo de microcentrífuga utilizando uma pipeta com ponteiras de 20 μL ou 200 μL. Adicione 10 μL da mistura de suspensão celular/azul de tripano a um hemocitômetro e conte as células.
    NOTA: O uso de ponteiras de pipeta de 0,1-10 μL pode cisalhar as células. Pontas desse tamanho não devem ser usadas durante o manuseio da suspensão da célula.
  10. Adicione o meio completo DMEM à suspensão celular para fazer uma densidade de 66.000 células/mL usando uma pipeta sorológica de 10 ou 25 mL. Pipetar 15 ml da suspensão celular para o(s) balão(ões) de cultura T-75. Assegurar uma dispersão igual da suspensão celular, deslocando o balão de norte para sul e de leste para oeste.
  11. Incube as células até que atinjam a confluência (normalmente após 4-6 dias), conforme estimado pelo exame ao microscópio. Neste ponto, use as células do experimento (começando com a seção 2) ou semeie-as em novos frascos para expansão para preparar estoques congelados (a uma densidade de semeadura recomendada de 1.000.000 de células em 15 mL de meio completo por frasco T-75).
    NOTA: As células podem ser cultivadas nos frascos de cultura por até 3 semanas sem uma diferença perceptível na forma, saúde ou desempenho no ensaio. O meio completo deve ser trocado a cada 3-4 dias.

2. Adição de células EA.hy926 a placas de 96 poços

NOTA: As células de um frasco de cultura T-75 confluente podem ser usadas para preparar duas ou três placas de ensaio ou, opcionalmente, expandidas em até 15 frascos T-75 frescos. Pelo menos cinco placas de ensaio podem ser rastreadas usando o protocolo nas seções 4 e 5 em um dia normal de trabalho. As instruções a seguir descrevem a preparação e o teste de uma placa de ensaio, mas placas adicionais podem ser preparadas repetindo as etapas 2.2, 2.7, 2.12 e 3.2 para preparar o número desejado de placas de ensaio. Mais comumente, quatro placas de ensaio são preparadas por dia para medir as respostas de concentração com até 16 compostos, o que requer dois frascos T-75 com células confluentes.

  1. Aqueça o meio completo do DMEM em banho-maria a 37 °C por 15-30 min. Esterilize o frasco de meio completo DMEM borrifando-o com álcool e, em seguida, mova-o para o capuz estéril.
  2. Adicione 100 μL de uma solução esterilizada de gelatina a 0,4% a todos os poços de uma placa de parede preta, 96 poços, de fundo transparente com tampa. Incubar a placa com a solução de gelatina numa incubadora (37 °C, CO2 a 5%) durante 30 min.
  3. Confirmar se as células de um balão de cultura T-75 são 80-100% confluentes utilizando um microscópio invertido. Remover o meio completo DMEM do balão T-75 por aspiração.
  4. Lave as células do balão com 10 ml de PBS e mova suavemente o balão de norte para sul e de leste para oeste. Remover o PBS do balão por aspiração.
  5. Adicione 5 ml de solução de dissociação celular ao balão e incube o balão numa incubadora (37 °C, 5% CO2) durante ~12 min. Bata no frasco após 6 minutos para ajudar a facilitar a dissociação.
    NOTA: Incubar células por mais de 15 min com o agente de dissociação celular referenciado faz com que as células comecem a se aglomerar, o que dificulta a obtenção de uma contagem precisa de células e pode interferir no ensaio.
  6. Adicionar 5 ml do meio completo DMEM pré-aquecido ao balão e misturar suavemente na solução de dissociação celular/suspensão celular. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione a suspensão celular em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Fazer um grânulo de células utilizando uma centrífuga (150 × g, 5 min, 22 °C).
  7. Enquanto o pellet está sendo formado, remova a solução de gelatina da placa de 96 poços por aspiração usando uma pipeta Pasteur conectada a um vácuo. Remova a tampa da placa desde o momento da remoção da gelatina até que a solução esteja pronta para ser banhada.
    NOTA: Uma pipeta multicanal ou coletor estéril conectado a um vácuo pode ser usado opcionalmente.
  8. Remover o meio do tubo de centrifugação por aspiração com uma pipeta de Pasteur ligada a um vácuo ou a uma pipeta serológica; Tenha cuidado para não perturbar o pellet celular.
  9. Adicionar meio completo DMEM fresco ao tubo de centrifugação utilizando uma pipeta serológica de 5 ou 10 ml. Quebre suavemente o pellet celular misturando o meio completo DMEM com uma pipeta de 1.000 μL ou uma pipeta sorológica de 5 mL.
    NOTA: Oito mililitros de DMEM são normalmente usados, mas volumes maiores podem ser adicionados para facilitar a contagem de células.
  10. Misturar 10 μL da suspensão celular com 10 μl de azul de tripano num tubo de microcentrífuga utilizando uma pipeta com ponteiras de 20 μL ou 200 μL. Adicione 10 μL da mistura de suspensão celular/azul de tripano a um hemocitômetro e conte as células.
  11. Adicione o meio completo de DMEM à suspensão celular para obter uma densidade de 600.000 células/mL usando uma pipeta sorológica de 10 ou 25 mL. Isso dará uma densidade final de 60.000 células/poço em uma placa de 96 poços (determinada como a densidade ideal por experimentação).
    NOTA: Uma cultura de células normal bem-sucedida produzirá entre 12.000.000 e 15.000.000 de células, que podem semear de duas a três placas de 96 poços.
  12. Misture a suspensão celular invertendo suavemente o tubo de centrífuga e adicione-o a um reservatório de pipeta multicanal de 50 mL. Misturando a suspensão no reservatório a cada 30 s, balançando suavemente o reservatório de um lado para o outro, adicione 100 μL da suspensão celular a cada poço usando uma pipeta multicanal. Recoloque a tampa transparente da placa e agite suavemente a placa deslizando-a na superfície do exaustor estéril de norte a sul e de leste a oeste para garantir uma distribuição uniforme das células. Incubar a placa na incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 16-24 h.
    NOTA: A suspensão celular adicional pode ser usada para preparar placas adicionais, ou as etapas 1.10-1.11 podem ser repetidas para continuar a linha celular.

3. Preparação do ensaio de mobilização de cálcio

  1. Preparar reagentes de ensaio.
    1. Prepare a solução de probenecida (250 mM, aquosa) adicionando 36 mg de probenecida a um tubo de microcentrífuga e dissolvendo-o em NaOH 0,6 M (500 μL). Vortex a solução.
      NOTA: A probenecida melhora a retenção de corante na célula, inibindo os transportadores de íons orgânicos 75,76,77.
    2. Para fazer o tampão de ensaio HBSS-HEPES, adicione HEPES (1,19 g) a um frasco de 500 mL de HBSS sem vermelho de Ca/Mg/fenol (fazendo uma solução de 10 mM de HEPES). Suplementar o tampão com MgCl2 (solução aquosa 1 M, 500 μL) e CaCl2 (solução aquosa 1 M, 500 μL). Misturar a solução e conservar no frigorífico a 5 °C quando não estiver a ser utilizado.
      1. Para cada placa de 96 poços, adicione 50 mL do tampão de ensaio HBSS-HEPES a um tubo de centrífuga de 50 mL, complemente com 500 μL da solução de probenecida e misture bem. Aqueça o tampão à temperatura ambiente antes de usar.
    3. Faça uma solução de Pluronic F-127 a 10% em DMSO adicionando Pluronic F-127 (20 mg) a um tubo de microcentrífuga ou frasco de HPLC e dissolvendo-o com 200 μL de DMSO.
      NOTA: Esta solução pode ser armazenada em temperatura ambiente e é suficiente para cerca de 30 placas. O Pluronic F-127 se dissolve muito lentamente à temperatura ambiente e deve ser aquecido suavemente para facilitar a dissolução.
    4. Prepare o tampão de carregamento de corante adicionando primeiro 24 μL de DMSO a um frasco de Fluo-4/AM (50 μg) para dissolver o corante. Em um tubo de centrífuga de 15 mL envolto em papel alumínio, adicione 6 mL de tampão de ensaio HBSS-HEPES e complemente com 6 μL de Pluronic F-127 a 10% e 6 μL de solução de Fluo-4 / AM. Vortex breve da solução e deixar descansar em temperatura ambiente, sem luz, por 10 min.
      NOTA: Para evitar o fotobranqueamento do Fluo-4, mantenha o corante fora da luz enrolando papel alumínio ao redor do tubo de centrífuga contendo a solução de corante e a tampa da placa de ensaio.
  2. Prepare placas de ensaio.
    1. Remova a placa de ensaio da incubadora e confirme a confluência usando um microscópio invertido. Remova manualmente a mídia completa do DMEM jogando-a em uma pia e enxugando a parte superior da placa com uma toalha de papel.
      NOTA: O meio é suficientemente removido segurando a placa horizontalmente e sacudindo, seguido de girar a placa 180° e repetir.
    2. Adicione o tampão de ensaio HBSS-HEPES mais a solução de probenecida a um reservatório de solvente de pipeta multicanal de 50 mL.
      NOTA: Esta solução será usada para etapas de lavagem posteriores e deve ser colocada de lado e coberta com papel alumínio até que seja necessário.
    3. Adicione 100 μL do tampão de ensaio HBSS-HEPES mais solução de probenecida a cada poço com uma pipeta multicanal e deixe as células repousarem na presença de probenecida por 5 min. Remova o buffer de ensaio HBSS-HEPES movendo para dentro da pia da mesma maneira que na etapa 3.2.1.
    4. Adicione o tampão de carregamento de corante a um reservatório de solvente de pipeta multicanal de 50 mL separado. Adicione 50 μL do tampão de carga de corante a cada poço da placa de ensaio usando uma pipeta multicanal. Incubar a placa durante 45 min (37 °C, 5% CO2).
    5. Enquanto a placa estiver na incubadora, prepare as soluções agonistas / antagonistas.
      1. As soluções antagonistas são armazenadas como soluções de 31,6 mM no DMSO. Em um tubo de PCR, dilua 2 μL da solução estoque com 38 μL de BSA a 0,1% / água para obter uma solução de 1,58 mM. 2 μL desta solução darão uma concentração final de 31,6 μM na placa de ensaio. Diluir 4 μL da solução antagonista de 1,58 mM com 36 μL de DMSO a 5% / água (sem adição de BSA) e preparar as concentrações restantes por meio de diluições seriadas.
      2. Prepare uma solução de 108,3 μM (16,7x) de TFLLRN-NH2 em tampão de ensaio HBSS-HEPES, que dará uma concentração final de 6,5 μM quando 6 μL forem adicionados a cada poço da placa de ensaio. Por exemplo, dissolva uma alíquota de 2 mg de TFLLRN-NH2 com 5,244 mL de tampão de ensaio HBSS-HEPES para obter uma solução estoque de 0,5 mM. Misture 1,083 mL desta solução com 3,917 mL de tampão de ensaio HBSS-HEPES para obter uma solução de 108,3 μM.
        NOTA: As soluções TFLLRN-NH2 devem ser armazenadas em um freezer de -20 ° C quando não estiverem em uso.
    6. Remova a placa da incubadora e garanta a absorção do corante usando um microscópio de fluorescência em uma configuração adequada (normalmente para proteína fluorescente verde, consulte a Figura 1 para obter um exemplo de Fluo-4 carregado com sucesso nas células). Remova o tampão de carregamento de corante sacudindo a placa da mesma maneira que a etapa 3.2.1.
    7. Lave as células 2x com 50 μL do tampão de ensaio HBSS-HEPES mais solução de probenecida (da etapa 3.2.3) em cada poço (remova jogando o meio na pia).
    8. Adicione 92 μL de tampão de ensaio HBSS-HEPES a cada poço e visualize novamente as células com um microscópio de fluorescência para garantir que o excesso de corante tenha sido totalmente removido e que as células permaneçam aderentes.
    9. Use uma pipeta multicanal para adicionar 2 μL das soluções antagonistas e veículo aos poços apropriados (consulte a Tabela 1 para obter um mapa de placas representativo).

4. Realização do ensaio de mobilização de cálcio

  1. Ajuste o leitor de placas da seguinte forma: temperatura: 37 °C; comprimento de onda de excitação: 485 nm; comprimento de onda de emissão: 525 nm; altura de medição: 7,8 mm (otimizada); número de flashes: 100; Número de repetições: 20.
  2. Incubar a placa durante 15 min no leitor de placas a 37 °C. Meça a fluorescência de fundo nas colunas 1 e 2 (cinco varreduras por poço).
  3. Ejete a placa do leitor de placas e adicione rapidamente 6 μL de solução agonista a cada poço nas colunas 1 e 2 de uma tira de PCR de 8 tubos usando uma pipeta multicanal.
    NOTA: Para esta etapa, usamos uma pipeta eletrônica de 8 canais com pontas de pipeta de 0,1-10 μL.
  4. Meça a mudança na fluorescência à medida que ocorre a mobilização de cálcio nas células. Execute 20 varreduras de cada poço de acordo com as configurações acima.
    NOTA: A varredura de cada poço em duas colunas 20x cada leva aproximadamente 5 min (ou seja, ~ 15 s entre as varreduras de cada poço).
  5. Repita as etapas 4.2 a 4.4 para as colunas 3 a 12 em incrementos de duas colunas.

5. Análise dos dados

  1. Exporte dados do ensaio como planilhas separadas para cada grupo de duas colunas.
  2. Encontre a média das leituras de fluorescência basal usando a função AVG(primeira varredura: última varredura). Faça isso para todos os poços em ambas as colunas.
  3. Encontre a fluorescência máxima após a adição de agonista usando a função MAX(primeira varredura: última varredura).
  4. Calcule a mudança na fluorescência subtraindo a fluorescência basal da fluorescência máxima.
  5. Subtraia a mudança de fluorescência calculada para o controle negativo (adição de veículo sem agonista) de cada poço na mesma coluna.
  6. Encontre a mudança relativa (normalizada) na fluorescência dividindo a mudança na fluorescência em cada poço pela mudança na fluorescência no veículo (0,1% DMSO/água) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 poço.
  7. Copie os valores sem controle, como porcentagens, em um programa de software de estatística e gráficos. Se estiver usando o software referenciado, escolha a opção de tabela XY, com os números escolhidos como o eixo X e replique os valores em subcolunas lado a lado como o eixo Y.
  8. Use o programa para traçar curvas de concentração-resposta (CRCs) a partir dos dados. Se estiver usando o software referenciado, escolha a opção log(inibidor) vs. resposta - Inclinação variável (quatro parâmetros).

Resultados

O objetivo deste ensaio é geralmente produzir curvas de concentração-resposta (CRCs) para três a quatro novas parmodulinas. Em cada placa de ensaio, é frequentemente gerado um CRC adicional para um composto conhecido, como NRD-21, que atua como uma verificação de qualidade para o experimento devido ao seu IC50 conhecido. Para gerar CRCs, um mapa de placas como o representado na Tabela 1 deve ser planejado. Se, em vez disso, forem desejadas respostas de ...

Discussão

Enquanto o protocolo72 relatado anteriormente era geralmente confiável e nos permitia identificar uma nova parmodulina de chumbo, NRD-21,62 um protocolo mais eficiente era desejado. O ensaio foi ainda mais comprometido durante a escassez de suprimentos causada pela pandemia de COVID-19. A aquisição de ponteiras para o manipulador automatizado de líquidos tornou-se difícil, e a tentativa de lavar, esterilizar e reutilizar as ponteiras p...

Divulgações

C.D. é inventor de patentes envolvendo parmodulinas e é o fundador e acionista da Function Therapeutics, Inc., que está desenvolvendo parmodulinas para uso clínico.

Agradecimentos

Agradecemos a Irene Hernandez, Trudy Holyst, Dr. Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) e Dr. Leggy Arnold (University of Wisconsin-Milwaukee) por fornecer espaço e apoio indireto a este projeto, e ao Dr. John McCorvy (Medical College of Wisconsin) pelos conselhos pertinentes. Agradecemos ao Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (R15HL127636), ao Departamento de Defesa dos EUA (W81XWH22101) e à National Science Foundation (2223225) pelo apoio financeiro.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

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