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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Un protocole amélioré pour un test de mobilisation du calcium avec des cellules endothéliales, utilisé pour identifier les ligands des récepteurs activés par la protéase (PAR), a été développé. Le nouveau protocole réduit le temps total de dosage de 90 à 120 minutes et permet d’obtenir des courbes concentration-réponse reproductibles.

Résumé

Les changements dans la concentration de calcium dans les cellules sont rapidement surveillés à haut débit à l’aide de colorants intracellulaires, fluorescents, liant le calcium et d’instruments d’imagerie pouvant mesurer les émissions fluorescentes d’un maximum de 1 536 puits simultanément. Cependant, ces instruments sont beaucoup plus coûteux et peuvent être difficiles à entretenir par rapport aux lecteurs de plaques largement disponibles qui scannent les puits individuellement. Il est décrit ici un test de lecteur de plaque optimisé à utiliser avec une lignée cellulaire endothéliale (EA.hy926) pour mesurer l’activation de la signalisation Gαq par le récepteur activé par la protéase (PAR) et la mobilisation ultérieure du calcium à l’aide du colorant de liaison au calcium Fluo-4. Ce test a été utilisé pour caractériser une gamme de ligands PAR, y compris les ligands anti-inflammatoires allostériques ciblant PAR1 « parmoduline » identifiés dans le laboratoire de Dockendorff. Ce protocole évite d’avoir besoin d’un manipulateur de liquide automatisé et permet le criblage à moyen débit de ligands PAR dans des plaques de 96 puits et devrait être applicable à l’étude d’autres récepteurs qui initient la mobilisation du calcium.

Introduction

Les récepteurs activés par la protéase (PAR)1,2,3 sont une sous-famille de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A qui sont exprimés dans divers types de cellules, y compris les plaquettes et les cellules endothéliales 4,5,6,7. Contrairement à la majorité des RCPG, les PAR ont un mode d’activation intramoléculaire unique. La plupart des RCPG sont activés par des ligands solubles interagissant avec une poche de liaison distincte, mais les PAR sont activés par le clivage protéolytique de l’extrémité N-terminale, ce qui se traduit par un nouveau ligand attaché qui peut interagir avec le domaine de la boucle extracellulaire 2 à la surface d’une cellule 6,8,9. Cette interaction active le récepteur et peut initier plusieurs voies de signalisation, favorisant des effets tels que l’inflammation et l’activation plaquettaire 4,10,11,12. Différentes protéases peuvent activer les PAR par clivage à des sites uniques sur l’extrémité N-terminale, révélant différents ligands attachés (TL) qui stabilisent les conformations des récepteurs, qui initient différentes voies de signalisation 9,13,14,15. Par exemple, chez le membre le mieux étudié de la sous-famille, PAR1, le clivage par la thrombine est utilisé pour soutenir de nombreux processus biologiques, y compris l’activation plaquettaire et le recrutement des leucocytes dans l’endothélium, mais peut entraîner des effets délétères lorsque le récepteur est surexprimé ou suractivé 4,16,17,18,19,20,21 . À l’inverse, le clivage par la protéine C activée (aPC) peut favoriser les effets anti-inflammatoires et le maintien des barrières endothéliales 15,22,23,24,25,26,27,28,29. Les PAR peuvent également être activés par des analogues peptidiques des TL de manière intermoléculaire 13,30,31. Ces peptides sont couramment utilisés pour mesurer l’inhibition (modulation) de la PAR à la place des protéases ciblant la PAR, et ils sont utilisés dans ce protocole.

De nombreux troubles sont associés à la signalisation pathologique PAR1, notamment la septicémie22,32, les maladies cardiovasculaires 33,34,35,36,37,38, les maladies rénales 39,40,41,42, la drépanocytose43, la fibrose44, l’ostéoporose et l’arthrose 45,46, neurodégénérescence 47,48,49,50,51 et cancer 52,53,54,55,56,57,58,59 . Les antagonistes de PAR1 sont étudiés depuis les années 1990 en tant qu’agents antiplaquettaires pour les maladies cardiovasculaires, et la liste croissante de maladies associées au récepteur nécessite l’identification de nouveaux ligands à utiliser comme sondes biologiques (composés outils) ou comme traitements potentiels. À l’heure actuelle, il n’existe qu’un seul antagoniste de PAR1 approuvé par la FDA, le vorapaxar, qui est utilisé pour traiter les maladies coronariennes chez les patients à haut risque 34,36,37,60. Un antagoniste alternatif de PAR1, la pepducine PZ-128, a mené à bien une étude de phase II pour prévenir la thrombose chez les patients atteints de cathétérisme cardiaque38. Le groupe Dockendorff s’est concentré sur la chimie médicinale et la pharmacologie d’une classe distincte de petites molécules, les ligands PAR1 connus sous le nom de parmodulines61,62. Contrairement aux antagonistes de PAR1 tels que le vorapaxar, les parmodulines sont des modulateurs allostériques et biaisés de PAR1 qui bloquent sélectivement la voie Gαq tout en favorisant des effets cytoprotecteurs similaires à ceux de l’aPC. Contrairement aux antagonistes orthostériques puissants de PAR1 tels que le vorapaxar, les parmodulines publiées sont également réversibles 63,64,65.

Initialement, les parmodulines ont été identifiées par Flaumenhaft et ses collègues pour leur capacité à inhiber l’expression de la P-sélectine ou la sécrétion de granules dans les plaquettes61,66. Cependant, une méthode alternative était nécessaire pour étudier les effets des parmodulines sur les cellules endothéliales. Une méthode courante pour surveiller la signalisation liée aux RCPG consiste à mesurer la mobilisation intracellulaire du Ca2+, un messager secondaire important qui peut être mesuré à l’aide d’un colorant de liaison au calcium intracellulaire approprié67,68. Des preuves substantielles ont été fournies montrant que la mobilisation du calcium induite par PAR1 se fait par l’activation de Gαq69,70. Une fois activé par son ligand attaché (ou un ligand exogène approprié), PAR1 subit un changement de conformation qui provoque le remplacement de la guanosine diphosphate (GDP) liée à la sous-unité Gαq par la guanosine triphosphate (GTP)68. La sous-unité Gαq active ensuite la phospholipase Cβ (PLC-β), qui catalyse l’hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2), formant le 1,4,5-inositol triphosphate (IP3) et le diacylglycérol (DAG). Enfin, l’IP3 se lie aux canaux Ca2+ sensibles à l’IP3 dans la membrane du réticulum endoplasmique, ce qui permet au Ca2+ d’être libéré dans le cytoplasme, où il peut se lier aux colorants fluorescents dépendants du Ca2+, tels que le Fluo-4, qui sont ajoutés aux cellules71. Ce processus se produit en quelques secondes et peut multiplier par 100 la concentration de Ca2+, ce qui entraîne un changement radical de la quantité de colorant lié au calcium et un signal de fluorescence robuste.

En 2018, le groupe Dockendorff a divulgué un test de mobilisation du Ca2+ à moyen débit qui pourrait être utilisé pour identifier les antagonistes de la voie Gαq de PAR172. Le test a utilisé EA.hy92673, une lignée cellulaire endothéliale humaine hybride, qui peut être utilisée pour plusieurs passages sans changement notable de l’expression de PAR1, et qui est établie pour les mesures in vitro des effets cytoprotecteurs.

Le protocole original utilisait des cellules EA.hy926 dans des plaques de 96 puits et chargées avec un colorant Fluo-4/AM, qui a été choisi en raison de sa fluorescence intense à 488 nm et de sa haute perméabilité cellulaire. Une fois le colorant chargé dans les cellules, de longues étapes de lavage ont été effectuées à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé à 8 canaux (les méthodes plus rapides de manipulation des liquides, telles qu’une laveuse à 96 canaux, étaient inaccessibles). La reproductibilité de ce test était supérieure à celle sans les changements de support robotisés minutieux et automatisés. Les antagonistes ont ensuite été incubés avec les cellules, PAR1 a été activé par l’ajout séquentiel d’un agoniste sélectif (16 puits à la fois), et les changements de fluorescence résultant de la mobilisation du calcium et de la liaison du colorant ont été mesurés pour déterminer l’activité.

Bien que ce protocole permette de mesurer la mobilisation du calcium médiée par PAR1, il est limité par le temps nécessaire pour analyser chaque plaque de 96 puits. Les longues durées d’expérience sont problématiques non seulement parce que le nombre de composés pouvant être criblés chaque jour est limité, mais aussi parce que l’efflux de colorant se produit au fil du temps, réduisant la fenêtre de test en augmentant la fluorescence basale. L’utilisation d’un manipulateur de liquide à 8 canaux pour le lavage des plaques, ce qui ajoute plus de 30 minutes à chaque expérience, contribue à la longue durée de l’expérience. Les pourboires requis sont également devenus difficiles à obtenir en raison de problèmes de chaîne d’approvisionnement. Ici, un protocole mis à jour pour le test de mobilisation du calcium médié par PAR, qui ne nécessite pas de manipulateur de liquides, et peut donc être exécuté à un débit plus élevé, est rapporté. Ce protocole devrait également convenir à la mesure de la signalisation avec d’autres RCPG qui conduisent à la mobilisation intracellulaire du calcium. Ce protocole de lecteur de plaques mis à jour est idéal pour les laboratoires universitaires et industriels qui ne disposent pas des ressources nécessaires pour des instruments d’imagerie cellulaire coûteux, mais qui ont besoin de cribler rapidement de nombreux composés. Pour un exemple d’essai de mobilisation du calcium à l’aide d’un imageur à plaque, voir Caers et al.74.

Protocole

Tous les échanges/ajouts de milieux effectués aux étapes 1 et 2 du protocole suivant sont effectués dans une hotte stérile. Sauf indication contraire, tous les articles en plastique utilisés dans la cagoule stérile doivent être achetés stérilisés et scellés ou stérilisés de manière appropriée via autoclave.

1. Initiation de la lignée cellulaire EA.hy926

  1. Acquisition de cellules EA.hy926.
  2. Stocker le(s) flacon(s) de cellules dans la phase vapeur d’un réservoir d’azote liquide.
  3. Préparez le milieu complet DMEM en réchauffant d’abord le DMEM, le FBS et le stylo/streptocoque (voir la table des matériaux pour plus de détails) dans un bain-marie à 37 °C pendant 15 à 30 min. Ajouter 50 ml de FBS et 1 ml de pen/streptocoque à 500 ml de DMEM. Mélangez doucement la solution par inversion.
    REMARQUE : Un mélange trop vigoureux provoque des quantités excessives de bulles.
  4. Retirer un flacon de cellules de l’azote liquide et le réchauffer au bain-marie à 37 °C pendant 5 min.
  5. Stérilisez le flacon de cellules et le flacon de milieu complet DMEM en les vaporisant d’alcool, puis passez au capot stérile.
  6. À l’aide d’une pipette de 1 000 μL, transférez soigneusement les cellules dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml. Ajouter 1 mL de DMEM dans le flacon à rincer et l’ajouter dans le tube à centrifuger.
  7. Fabriquer une pastille de cellules à l’aide d’une centrifugeuse (150 × g, 5 min, 22 °C). Retirer le fluide du tube de centrifugation par aspiration ; Veillez à ne pas déranger la pastille cellulaire.
  8. Ajoutez 3 ml de milieu complet DMEM dans le tube à centrifuger et décomposez doucement la pastille en mélangeant la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette de 1 000 μL.
    REMARQUE : Il faut éviter de provoquer des bulles en mélangeant trop vigoureusement car cela pourrait activer ou endommager les cellules.
  9. Mélangez 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu de trypan dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette avec des pointes de 20 μL ou 200 μL. Ajouter 10 μL du mélange suspension cellulaire/bleu de trypan dans un hémocytomètre et compter les cellules.
    REMARQUE : L’utilisation de pointes de pipette de 0,1 à 10 μL peut cisailler les cellules. Des embouts de cette taille ne doivent pas être utilisés lors de la manipulation de la suspension cellulaire.
  10. Ajoutez du milieu complet DMEM à la suspension cellulaire pour obtenir une densité de 66 000 cellules/ml à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ou 25 ml. Pipeter 15 mL de suspension cellulaire dans le(s) flacon(s) de culture T-75. Assurez-vous d’une dispersion égale de la suspension cellulaire en déplaçant le ballon du nord au sud et d’est en ouest.
  11. Incuber les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence (généralement après 4 à 6 jours), comme estimé par examen au microscope. À ce stade, utilisez les cellules de l’expérience (en commençant par la section 2) ou ensemencez-les dans de nouveaux flacons pour les étendre afin de préparer des stocks congelés (à une densité de semis recommandée de 1 000 000 de cellules dans 15 mL de milieu complet par fiole T-75).
    REMARQUE : Les cellules peuvent être cultivées dans les flacons de culture pendant jusqu’à 3 semaines sans différence notable de forme, de santé ou de performance dans le test. Le support complet doit être remplacé tous les 3-4 jours.

2. Ajout de cellules EA.hy926 aux plaques de 96 puits

REMARQUE : Les cellules d’un flacon de culture T-75 confluent peuvent être utilisées pour préparer deux ou trois plaques d’essai ou, éventuellement, être élargies en jusqu’à 15 fioles T-75 fraîches. Au moins cinq plaques d’essai peuvent être dépistées à l’aide du protocole des sections 4 et 5 au cours d’une journée de travail normale. Les instructions suivantes décrivent la préparation et l’analyse d’une plaque d’essai, mais des plaques supplémentaires peuvent être préparées en répétant les étapes 2.2, 2.7, 2.12 et 3.2 pour préparer le nombre souhaité de plaques d’essai. Le plus souvent, quatre plaques d’essai sont préparées par jour pour mesurer les réponses de concentration avec jusqu’à 16 composés, ce qui nécessite deux fioles T-75 avec des cellules confluentes.

  1. Milieu complet DMEM chaud dans un bain-marie à 37 °C pendant 15-30 min. Stérilisez le flacon de milieu complet DMEM en le vaporisant d’alcool, puis déplacez-le vers le capot stérile.
  2. Ajouter 100 μL d’une solution de gélatine stérilisée à 0,4 % dans tous les puits d’une plaque à paroi noire à 96 puits à fond transparent avec un couvercle. Incuber la plaque avec la solution de gélatine dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant 30 min.
  3. Confirmez à l’aide d’un microscope inversé que les cellules d’un flacon de culture T-75 sont confluentes à 80-100 %. Retirer le milieu complet DMEM de la fiole T-75 par aspiration.
  4. Lavez les cellules dans le ballon avec 10 mL de PBS et déplacez doucement le ballon du nord vers le sud et d’est vers l’ouest. Retirer le PBS de la fiole par aspiration.
  5. Ajouter 5 mL de solution de dissociation cellulaire dans le ballon et incuber le ballon dans un incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant ~12 min. Tapotez le ballon après 6 minutes pour faciliter la dissociation.
    REMARQUE : L’incubation de cellules pendant plus de 15 minutes avec l’agent de dissociation cellulaire référencé provoque l’agglutination des cellules, ce qui rend plus difficile l’obtention d’un numération cellulaire précise et peut interférer avec le dosage.
  6. Ajouter 5 mL du milieu complet DMEM préchauffé dans la fiole et mélanger délicatement à la solution de dissociation cellulaire/suspension cellulaire. À l’aide d’une pipette sérologique de 10 ml, ajouter la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml. Fabriquer une pastille de cellules à l’aide d’une centrifugeuse (150 × g, 5 min, 22 °C).
  7. Pendant la formation de la pastille, prélever la solution de gélatine de la plaque à 96 puits par aspiration à l’aide d’une pipette Pasteur reliée à un vide. Retirez le couvercle de la plaque à partir du moment où la gélatine est retirée jusqu’à ce que la solution soit prête à être plaquée.
    REMARQUE : Une pipette multicanaux ou un collecteur stérile connecté à un vide peut être utilisé en option.
  8. Prélever le milieu du tube de centrifugation par aspiration à l’aide d’une pipette Pasteur reliée à un vide ou d’une pipette sérologique ; Veillez à ne pas déranger la pastille cellulaire.
  9. Ajouter le milieu complet DMEM frais dans le tube à centrifuger à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ou 10 ml. Brisez doucement la pastille cellulaire en mélangeant le milieu complet DMEM avec une pipette de 1 000 μL ou une pipette sérologique de 5 mL.
    REMARQUE : Huit millilitres de DMEM sont généralement utilisés, mais des volumes plus élevés peuvent être ajoutés pour faciliter le comptage des cellules.
  10. Mélangez 10 μL de suspension cellulaire avec 10 μL de bleu de trypan dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette avec des pointes de 20 μL ou 200 μL. Ajouter 10 μL du mélange suspension cellulaire/bleu de trypan dans un hémocytomètre et compter les cellules.
  11. Ajoutez un milieu complet DMEM à la suspension cellulaire pour obtenir une densité de 600 000 cellules/ml à l’aide d’une pipette sérologique de 10 ou 25 ml. Cela donnera une densité finale de 60 000 cellules/puits dans une plaque de 96 puits (déterminée comme étant la densité optimale par l’expérimentation).
    REMARQUE : Une culture cellulaire normale réussie produira entre 12 000 000 et 15 000 000 de cellules, qui peuvent ensemencer deux à trois plaques de 96 puits.
  12. Mélangez la suspension cellulaire en inversant doucement le tube de centrifugation et ajoutez-la dans un réservoir de pipette multicanaux de 50 ml. En mélangeant la suspension dans le réservoir toutes les 30 s en balançant doucement le réservoir d’un côté à l’autre, ajoutez 100 μL de suspension cellulaire dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Replacez le couvercle transparent de la plaque et secouez doucement la plaque en la faisant glisser sur la surface du capot stérile du nord au sud et d’est en ouest pour assurer une distribution uniforme des cellules. Incuber la plaque dans l’incubateur (37 °C, 5 % CO2) pendant 16 à 24 h.
    REMARQUE : Une suspension cellulaire supplémentaire peut être utilisée pour préparer des plaques supplémentaires, ou les étapes 1.10-1.11 peuvent être répétées pour continuer la lignée cellulaire.

3. Préparation du test de mobilisation du calcium

  1. Préparez les réactifs de dosage.
    1. Préparez une solution de probénécide (250 mM, aqueuse) en ajoutant 36 mg de probénécide dans un tube de microcentrifugation et en la dissolvant dans 0,6 M de NaOH (500 μL). Vortex la solution.
      REMARQUE : Le probénécide améliore la rétention du colorant dans la cellule en inhibant les transporteurs d’ions organiques 75,76,77.
    2. Pour fabriquer un tampon de dosage HBSS-HEPES, ajoutez HEPES (1,19 g) dans une bouteille de 500 mL de HBSS sans Ca/Mg/rouge de phénol (pour obtenir une solution de 10 mM de HEPES). Compléter le tampon avec du MgCl2 (1 M solution aqueuse, 500 μL) et du CaCl2 (1 M solution aqueuse, 500 μL). Mélangez la solution et conservez-la au réfrigérateur à 5 °C lorsqu’elle n’est pas utilisée.
      1. Pour chaque plaque à 96 puits, ajouter 50 mL du tampon de dosage HBSS-HEPES dans un tube à centrifuger de 50 mL, compléter avec 500 μL de solution de probénécide et bien mélanger. Réchauffez le tampon à température ambiante avant de l’utiliser.
    3. Préparez une solution de Pluronic F-127 à 10 % dans du DMSO en ajoutant du Pluronic F-127 (20 mg) dans un tube de microcentrifugation ou un flacon HPLC et en le dissolvant avec 200 μL de DMSO.
      REMARQUE : Cette solution peut être conservée à température ambiante et est suffisante pour environ 30 plaques. Pluronic F-127 se dissout très lentement à température ambiante et doit être chauffé doucement pour faciliter la dissolution.
    4. Préparez le tampon de chargement du colorant en ajoutant d’abord 24 μL de DMSO dans un flacon de Fluo-4/AM (50 μg) pour dissoudre le colorant. Dans un tube à centrifuger de 15 ml enveloppé d’une feuille d’aluminium, ajouter 6 ml de tampon de dosage HBSS-HEPES et compléter avec 6 μL de Pluronic F-127 à 10 % et 6 μL de solution Fluo-4/AM. Agitez brièvement la solution et laissez-la reposer à température ambiante, à l’abri de la lumière, pendant 10 min.
      REMARQUE : Pour éviter le photoblanchiment de Fluo-4, gardez le colorant à l’abri de la lumière en enroulant une feuille d’aluminium autour du tube de centrifugation contenant la solution de colorant et le couvercle de la plaque de test.
  2. Préparer les plaques d’essai.
    1. Retirez la plaque de dosage de l’incubateur et confirmez la confluence à l’aide d’un microscope inversé. Retirez manuellement le support DMEM complet en le plongeant dans un évier et en épongeant le dessus de la plaque avec une serviette en papier.
      REMARQUE : Le fluide est suffisamment retiré en tenant la plaque horizontalement et en la frappant, puis en tournant la plaque à 180° et en répétant.
    2. Ajouter le tampon de dosage HBSS-HEPES et la solution de probénécide dans un réservoir de solvant pour pipette multicanaux de 50 ml.
      REMARQUE : Cette solution sera utilisée pour les étapes de lavage ultérieures et doit être mise de côté et recouverte de papier d’aluminium jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    3. Ajouter 100 μL du tampon de dosage HBSS-HEPES et de la solution de probénécide dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux et laisser les cellules reposer en présence de probénécide pendant 5 min. Retirez le tampon de dosage HBSS-HEPES en le glissant dans l’évier de la même manière qu’à l’étape 3.2.1.
    4. Ajouter le tampon de chargement du colorant dans un réservoir de solvant de pipette multicanaux séparé de 50 ml. Ajouter 50 μL de tampon de chargement de colorant dans chaque puits de la plaque d’essai à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber la plaque pendant 45 min (37 °C, 5% CO2).
    5. Pendant que la plaque est dans l’incubateur, préparez les solutions agonistes/antagonistes.
      1. Les solutions antagonistes sont stockées sous forme de solutions de 31,6 mM dans le DMSO. Dans un tube PCR, diluer 2 μL de la solution mère avec 38 μL de BSA à 0,1 %/eau pour obtenir une solution de 1,58 mM. 2 μL de cette solution donneront une concentration finale de 31,6 μM dans la plaque de dosage. Diluer 4 μL de la solution d’antagoniste de 1,58 mM avec 36 μL de DMSO à 5 %/eau (sans ajout de BSA), et préparer les concentrations restantes par dilutions en série.
      2. Préparer une solution de 108,3 μM (16,7x) de TFLLRN-NH2 dans un tampon de dosage HBSS-HEPES, ce qui donnera une concentration finale de 6,5 μM lorsque 6 μL sont ajoutés à chaque puits de la plaque de dosage. Par exemple, dissoudre une aliquote de 2 mg de TFLLRN-NH2 avec 5,244 mL de tampon de dosage HBSS-HEPES pour obtenir une solution mère de 0,5 mM. Mélanger 1,083 mL de cette solution avec 3,917 mL de tampon de dosage HBSS-HEPES pour obtenir une solution de 108,3 μM.
        REMARQUE : Les solutions TFLLRN-NH2 doivent être conservées dans un congélateur à -20 °C lorsqu’elles ne sont pas utilisées.
    6. Retirez la plaque de l’incubateur et assurez-vous de l’absorption du colorant à l’aide d’un microscope à fluorescence à un réglage approprié (généralement pour les protéines fluorescentes vertes, voir la figure 1 pour un exemple de Fluo-4 chargé avec succès dans les cellules). Retirez le tampon de chargement du colorant en agitant la plaque de la même manière qu’à l’étape 3.2.1.
    7. Lavez les cellules 2 fois avec 50 μL de tampon de dosage HBSS-HEPES et de solution de probénécide (à partir de l’étape 3.2.3) dans chaque puits (retirer en jetant le milieu dans l’évier).
    8. Ajoutez 92 μL de tampon de dosage HBSS-HEPES dans chaque puits et observez à nouveau les cellules avec un microscope à fluorescence pour vous assurer que l’excès de colorant a été complètement éliminé et que les cellules restent adhérentes.
    9. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 2 μL de solutions antagonistes et de véhicule aux puits appropriés (voir le tableau 1 pour une carte représentative des plaques).

4. Réalisation du test de mobilisation du calcium

  1. Réglez le lecteur de plaques comme suit : température : 37 °C ; longueur d’onde d’excitation : 485 nm ; longueur d’onde d’émission : 525 nm ; Hauteur de mesure : 7,8 mm (optimisée) ; nombre de clignotements : 100 ; Nombre de répétitions : 20.
  2. Incuber la plaque pendant 15 min dans le lecteur de plaques à 37 °C. Mesurez la fluorescence de fond dans les colonnes 1 et 2 (cinq balayages par puits).
  3. Éjectez la plaque du lecteur de plaques et ajoutez rapidement 6 μL de solution agoniste dans chaque puits des colonnes 1 et 2 à partir d’une bandelette PCR à 8 tubes à l’aide d’une pipette multicanaux.
    REMARQUE : Pour cette étape, nous utilisons une pipette électronique à 8 canaux avec des pointes de pipette de 0,1 à 10 μL.
  4. Mesurez le changement de fluorescence lorsque la mobilisation du calcium se produit dans les cellules. Effectuez 20 balayages de chaque puits selon les paramètres ci-dessus.
    REMARQUE : Le balayage de chaque puits en deux colonnes 20x chacune prend environ 5 min (c’est-à-dire ~15 s entre les balayages de chaque puits).
  5. Répétez les étapes 4.2 à 4.4 pour les colonnes 3 à 12 par incréments de deux colonnes.

5. Analyse des données

  1. Exportez les données du test sous forme de feuilles de calcul distinctes pour chaque groupe à deux colonnes.
  2. Trouvez la moyenne des lectures de fluorescence basale à l’aide de la fonction AVG (premier balayage : dernier balayage). Faites cela pour chaque puits dans les deux colonnes.
  3. Trouvez la fluorescence maximale après l’ajout d’agoniste en utilisant la fonction MAX (premier balayage : dernier balayage).
  4. Calculez la variation de fluorescence en soustrayant la fluorescence basale de la fluorescence maximale.
  5. Soustrayez la variation de fluorescence calculée pour le témoin négatif (ajout du véhicule sans agoniste) de chaque puits de la même colonne.
  6. Déterminez la variation relative (normalisée) de la fluorescence en divisant la variation de la fluorescence dans chaque puits par la variation de la fluorescence dans le véhicule (0,1 % DMSO/eau) + 6,5 μM TFLLRN-NH2 puits.
  7. Copiez les valeurs non contrôlées, sous forme de pourcentages, dans un logiciel de statistiques et de graphiques. Si vous utilisez le logiciel référencé, choisissez l’option de table XY, avec les nombres choisis comme axe X et répliquez les valeurs dans des sous-colonnes côte à côte comme axe Y.
  8. Utilisez le programme pour tracer des courbes concentration-réponse (CRC) à partir des données. Si vous utilisez le logiciel référencé, choisissez l’option log(inhibiteur) vs. réponse - Pente variable (quatre paramètres).

Résultats

Le but de ce test est généralement de produire des courbes concentration-réponse (CRC) pour trois à quatre nouvelles parmodulines. Sur chaque plaque d’essai, un CRC supplémentaire pour un composé connu, tel que NRD-21, est souvent généré qui sert de contrôle de qualité pour l’expérience en raison de son IC50 connu. Pour générer des CRC, il faut prévoir une carte de plaque telle que celle illustrée dans le tableau 1 . Si l’on souhaite plut...

Discussion

Alors que le protocole72 précédemment rapporté était généralement fiable et nous a permis d’identifier une nouvelle parmoduline de plomb, NRD-21,62 un protocole plus efficace était souhaité. Le test a été encore compromis pendant la pénurie d’approvisionnement causée par la pandémie de COVID-19. Il est devenu difficile d’obtenir des embouts pour le manipulateur automatisé de liquides, et tenter de laver, de stériliser e...

Déclarations de divulgation

C.D. est l’inventeur de brevets impliquant des parmodulines et est le fondateur et l’actionnaire de Function Therapeutics, Inc., qui développe des parmodulines à des fins cliniques.

Remerciements

Nous remercions Irene Hernandez, Trudy Holyst, le Dr Hartmut Weiler (Versiti Blood Research Institute) et le Dr Leggy Arnold (Université du Wisconsin-Milwaukee) pour avoir fourni de l’espace et un soutien indirect à ce projet, ainsi que le Dr John McCorvy (Medical College of Wisconsin) pour ses conseils pertinents. Nous remercions le National Heart, Lung, and Blood Institute (R15HL127636), le Département de la Défense des États-Unis (W81XWH22101) et la National Science Foundation (2223225) pour leur subvention.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cellsATCCCRL-2922
CellStripper cell dissociation reagentCorning25-056-CITrypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol redCorning10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)Avantor97068-091
Gelatin from porcine skinMilliporeSigmaG2500Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)Corning25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Thermo172571000
Bovine serum albumin (BSA)Avantor97061-420
Calcium chloride dihydrateThermo42352-0250
Dimethyl sulfoxideThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)Corning21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrateMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Sodium hydroxideVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plateCorning3603with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mLAvantor89039-664
Centrifuge tube, 50 mLAvantor89039-656
Culture flask, T-75Corning353136tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mLCorningRES-V-50-S
Enspire plate readerPerkin ElmerDiscontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mLAvantor20170-038
Pasteur pipette, 9"Fisher13-678-6Bmust be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap stripsAvantor76318-802
Pipette tips, 20 µLBiotix63300042sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µLBiotix63300044sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µLBiotix63300047sterile, filtered tips
PrismGraphPadvolume 6 used
Serological pipette, 5 mLTradewinds Direct 07-5005
Serological pipette, 10 mLTradewinds Direct 07-5010
Serological pipette, 25 mLTradewinds Direct 07-5025

Références

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