Caractérisation des modulateurs des récepteurs activés par la protéase à l’aide d’un test de mobilisation du calcium à l’aide d’un lecteur de plaques

Résumé

Un protocole amélioré pour un test de mobilisation du calcium avec des cellules endothéliales, utilisé pour identifier les ligands des récepteurs activés par la protéase (PAR), a été développé. Le nouveau protocole réduit le temps total de dosage de 90 à 120 minutes et permet d’obtenir des courbes concentration-réponse reproductibles.

Résumé

Les changements dans la concentration de calcium dans les cellules sont rapidement surveillés à haut débit à l’aide de colorants intracellulaires, fluorescents, liant le calcium et d’instruments d’imagerie pouvant mesurer les émissions fluorescentes d’un maximum de 1 536 puits simultanément. Cependant, ces instruments sont beaucoup plus coûteux et peuvent être difficiles à entretenir par rapport aux lecteurs de plaques largement disponibles qui scannent les puits individuellement. Il est décrit ici un test de lecteur de plaque optimisé à utiliser avec une lignée cellulaire endothéliale (EA.hy926) pour mesurer l’activation de la signalisation G_αq par le récepteur activé par la protéase (PAR) et la mobilisation ultérieure du calcium à l’aide du colorant de liaison au calcium Fluo-4. Ce test a été utilisé pour caractériser une gamme de ligands PAR, y compris les ligands anti-inflammatoires allostériques ciblant PAR1 « parmoduline » identifiés dans le laboratoire de Dockendorff. Ce protocole évite d’avoir besoin d’un manipulateur de liquide automatisé et permet le criblage à moyen débit de ligands PAR dans des plaques de 96 puits et devrait être applicable à l’étude d’autres récepteurs qui initient la mobilisation du calcium.

Introduction

Les récepteurs activés par la protéase (PAR)^1,2,3 sont une sous-famille de récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A qui sont exprimés dans divers types de cellules, y compris les plaquettes et les cellules endothéliales ^4,5,6,7. Contrairement à la majorité des RCPG, les PAR ont un mode d’activation intramoléculaire unique. La plupart des RCPG sont activés par des ligands solubles interagissant avec une ....

Protocole

Tous les échanges/ajouts de milieux effectués aux étapes 1 et 2 du protocole suivant sont effectués dans une hotte stérile. Sauf indication contraire, tous les articles en plastique utilisés dans la cagoule stérile doivent être achetés stérilisés et scellés ou stérilisés de manière appropriée via autoclave.

1. Initiation de la lignée cellulaire EA.hy926

1. Acquisition de cellules EA.hy926.
2. Stocker le(s) flacon(s) de cellules dans la phase vapeur d’un réservoir d’azote liquide.
3. Préparez le milieu complet DMEM en réchauffant d’abord le DMEM, le FBS et le stylo/strep....

Discussion

Alors que le protocole⁷² précédemment rapporté était généralement fiable et nous a permis d’identifier une nouvelle parmoduline de plomb, NRD-21,62 un protocole plus efficace était souhaité. Le test a été encore compromis pendant la pénurie d’approvisionnement causée par la pandémie de COVID-19. Il est devenu difficile d’obtenir des embouts pour le manipulateur automatisé de liquides, et tenter de laver, de stériliser e.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 cells	ATCC	CRL-2922
CellStripper cell dissociation reagent	Corning	25-056-CI	Trypsin can optionally be used, but should definitely be avoided with PAR2 assays.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) w/phenol red	Corning	10-013-CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-091
Gelatin from porcine skin	MilliporeSigma	G2500	Use to make an aqueous 0.4% (w/v) solution with deionized water. Autoclave before use to sterilize.
Pen/Strep (100X)	Corning	30-002-CI
Phosphate-buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Trypan Blue (0.4% w/v)	Corning	25-900-CI
Calcium Mobilization Reagents
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Thermo	172571000
Bovine serum albumin (BSA)	Avantor	97061-420
Calcium chloride dihydrate	Thermo	42352-0250
Dimethyl sulfoxide	Thermo	J66650-AD
Fluo-4/AM	Invitrogen	F14201
Hank's balanced salt solution (Ca/Mg/phenol-red free)	Corning	21-022-CV
Magnesium chloride hexahydrate	MilliporeSigma	M2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)	Spectrum Chemical	P1166
Probenecid	TCI America	P1975
Sodium hydroxide	VWR International	BDH9292
TFLLRN-NH2 (TFA salt)			Prepared by Trudy Holyst at the Versiti Blood Research Institute
Materials
96-well culture-treated, black-walled, clear bottom assay plate	Corning	3603	with transparent lids
Centrifuge tube, 15 mL	Avantor	89039-664
Centrifuge tube, 50 mL	Avantor	89039-656
Culture flask, T-75	Corning	353136	tissue culture treated
Disposable reagent reservoir, 50 mL	Corning	RES-V-50-S
Enspire plate reader	Perkin Elmer		Discontinued
Microcentrifuge tube, 1.5 mL	Avantor	20170-038
Pasteur pipette, 9"	Fisher	13-678-6B	must be sterilized
PCR tube strip with separate flat cap strips	Avantor	76318-802
Pipette tips, 20 µL	Biotix	63300042	sterile, filtered tips
Pipette tips, 200 µL	Biotix	63300044	sterile, filtered tips
Pipette tips, 1250 µL	Biotix	63300047	sterile, filtered tips
Prism	GraphPad		volume 6 used
Serological pipette, 5 mL	Tradewinds Direct	07-5005
Serological pipette, 10 mL	Tradewinds Direct	07-5010
Serological pipette, 25 mL	Tradewinds Direct	07-5025