A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
يحدد هذا البروتوكول الخطوات الأساسية للحصول على أجنة الأسماك الخالية من الجراثيم (GF) والحفاظ عليها من اليرقات حتى مرحلة الأحداث ، بما في ذلك أخذ العينات والكشف عن حالتها العقيمة. يعد استخدام نماذج GF المصابة بالعدوى أمرا مهما لفهم دور الميكروبات في صحة المضيف.
يعمل الزرد كنماذج قيمة للبحث في النمو والمناعة وميكروبات الأمعاء بسبب أوجه التشابه الجينومية مع الثدييات ، والأجنة الشفافة التي تم تطويرها في بيئة مشيمية نظيفة نسبيا ، والتطور السريع للغاية لليرقات مقارنة بنماذج القوارض. تعتبر أسماك الزرد الخالية من الجراثيم (Danio rerio) ضرورية لتقييم سمية الملوثات وإنشاء نماذج أمراض شبيهة بالإنسان تتعلق بالوظائف الميكروبية. بالمقارنة مع النماذج التي يتم تربيتها تقليديا (CR) (الأسماك في التربية الشائعة) ، يسمح الزرد GF بمعالجة أكثر دقة للميكروبات المضيفة ، مما يساعد في تحديد العلاقة السببية بين الكائنات الحية الدقيقة والمضيفين. وبالتالي ، فإنها تلعب دورا حاسما في تعزيز فهمنا لهذه العلاقات. ومع ذلك ، عادة ما يتم إنشاء نماذج الزرد GF والبحث عنها خلال مراحل الحياة المبكرة (من الأجنة إلى اليرقات) بسبب القيود في وظيفة المناعة وامتصاص المغذيات. تعمل هذه الدراسة على تحسين توليد وصيانة وتحديد نماذج الزرد GF المبكرة دون تغذية ومع التغذية طويلة الأجل باستخدام أغذية GF (مثل Artemia sp. ، الجمبري الملحي). طوال العملية ، تم إجراء أخذ العينات اليومية والمزرعة وتحديدها من خلال عمليات الكشف المتعددة ، بما في ذلك اللوحات وتسلسل 16S rRNA. تم تسجيل معدل التعقيم والبقاء على قيد الحياة ومؤشرات النمو لسمك الزرد GF لضمان جودة وكمية النماذج التي تم إنشاؤها. الأهم من ذلك ، تقدم هذه الدراسة تفاصيل حول تقنيات العزل البكتيري والعدوى لأسماك GF ، مما يتيح إنشاء نماذج أسماك GF بكفاءة من اليرقات إلى مراحل الأحداث بدعم غذائي من GF. من خلال تطبيق هذه الإجراءات في البحوث الطبية الحيوية ، يمكن للعلماء فهم أفضل للعلاقات بين الوظائف البكتيرية المعوية وصحة المضيف.
تلعب الجراثيم (أي العتائق والبكتيريا وحقيقيات النوى والفيروسات) أدوارا حاسمة في الحفاظ على صحة المضيف والمساهمة في تطور الأمراض المختلفة من خلال التأثير على العمليات الفسيولوجية والمرضية من خلال التفاعلات التكافلية داخل الحاجز المعوي والسطح الظهاري ووظائف الميوسين لدى الأفراد1،2،3. يتشكل تكوين الجراثيم عبر مراحل الحياة المختلفة ، من الطفولة إلى الأحداث ، والبلوغ ، والشيخوخة ، بالإضافة إلى وجودها في مواقع مختلفة مثل مواقع الفم والفم والجلد والأمعاء ، بشكل ديناميكي من خلال الموائل والبيئات المتنوعة4. تشارك الجراثيم المعوية في ا....
أجريت تجارب الأسماك وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام في تشونغتشينغ واللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في جامعة تشونغتشينغ الطبية ، الصين ، وكذلك معايير التجارب الصادرة عن مكتب الدولة للجودة والإشراف الفني (معرف الموافقة: GB14922-2001 إلى GBT14927-2001). تم الحصول على الزرد (Danio rerio ، النوع البري ، سلالة AB) من معهد علم الأحياء المائية ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، وتم الاحتفاظ بها في المختبر باتباع الإجراءات المبلغ عنها سابقا36.
1. صيانة الزرد البالغ وجمع الأجنة
ملاحظة: بالاعتماد على التعديلات من الدراسات والتقارير السابقة16....
يمكن إنتاج نماذج أسماك الزرد GF بكفاءة من خلال الاستفادة من البيض الوفير الذي تنتجه أزواج من أسماك الزرد ، مع تحسين البروتوكول بناء على نماذج أسماك GF السابقة35. يمكن للوحة واحدة مكونة من 6 آبار زراعة ما يقرب من 30-48 جنينا / يرقة ، مما يسمح بجمع بيانات وافرة وتحليل إحصائي. بعد المعال.......
الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكولات أسماك GF وإعداد الطعام GF
خلال توليد نماذج أسماك GF ، تم تضمين العديد من الخطوات الحاسمة ، بما في ذلك تحضير المواد المعقمة ، وتعقيم الأجنة ، والتجديد اليومي ل GZM ، وجمع العينات المختلفة ، والفحص المعقم لكل عينة باستخدام طرق متعددة. من بين هذه الخطوات ،.......
تم منح بروتوكول GF Artemia كبراءة اختراع من قبل الإدارة الوطنية الصينية للملكية الفكرية ، والتي ستخفف من الاستخدام المقيد للطريقة بعد الحصول على إذن المؤلفين. يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح منافسة أو مالية أخرى.
نشكر بصدق الدعم المقدم من مشروع المواهب بجامعة تشونغتشينغ الطبية (رقم R4014 إلى DSP و R4020 إلى PPJ) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، رقم 32200386 إلى PPJ) ، واستوديو تشونغتشينغ للابتكار بعد الدكتوراه (X7928 DSP) ، وبرنامج المركز الصيني السريلانكي المشترك لأبحاث تكنولوجيا المياه ومظاهرة من قبل الأكاديمية الصينية للعلوم (CAS) / المركز المشترك بين الصين وسريلانكا للتعليم والبحث من قبل CAS.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. | 49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. | The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. | TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; | TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; | TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved