A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول الخطوات الأساسية للحصول على أجنة الأسماك الخالية من الجراثيم (GF) والحفاظ عليها من اليرقات حتى مرحلة الأحداث ، بما في ذلك أخذ العينات والكشف عن حالتها العقيمة. يعد استخدام نماذج GF المصابة بالعدوى أمرا مهما لفهم دور الميكروبات في صحة المضيف.

Abstract

يعمل الزرد كنماذج قيمة للبحث في النمو والمناعة وميكروبات الأمعاء بسبب أوجه التشابه الجينومية مع الثدييات ، والأجنة الشفافة التي تم تطويرها في بيئة مشيمية نظيفة نسبيا ، والتطور السريع للغاية لليرقات مقارنة بنماذج القوارض. تعتبر أسماك الزرد الخالية من الجراثيم (Danio rerio) ضرورية لتقييم سمية الملوثات وإنشاء نماذج أمراض شبيهة بالإنسان تتعلق بالوظائف الميكروبية. بالمقارنة مع النماذج التي يتم تربيتها تقليديا (CR) (الأسماك في التربية الشائعة) ، يسمح الزرد GF بمعالجة أكثر دقة للميكروبات المضيفة ، مما يساعد في تحديد العلاقة السببية بين الكائنات الحية الدقيقة والمضيفين. وبالتالي ، فإنها تلعب دورا حاسما في تعزيز فهمنا لهذه العلاقات. ومع ذلك ، عادة ما يتم إنشاء نماذج الزرد GF والبحث عنها خلال مراحل الحياة المبكرة (من الأجنة إلى اليرقات) بسبب القيود في وظيفة المناعة وامتصاص المغذيات. تعمل هذه الدراسة على تحسين توليد وصيانة وتحديد نماذج الزرد GF المبكرة دون تغذية ومع التغذية طويلة الأجل باستخدام أغذية GF (مثل Artemia sp. ، الجمبري الملحي). طوال العملية ، تم إجراء أخذ العينات اليومية والمزرعة وتحديدها من خلال عمليات الكشف المتعددة ، بما في ذلك اللوحات وتسلسل 16S rRNA. تم تسجيل معدل التعقيم والبقاء على قيد الحياة ومؤشرات النمو لسمك الزرد GF لضمان جودة وكمية النماذج التي تم إنشاؤها. الأهم من ذلك ، تقدم هذه الدراسة تفاصيل حول تقنيات العزل البكتيري والعدوى لأسماك GF ، مما يتيح إنشاء نماذج أسماك GF بكفاءة من اليرقات إلى مراحل الأحداث بدعم غذائي من GF. من خلال تطبيق هذه الإجراءات في البحوث الطبية الحيوية ، يمكن للعلماء فهم أفضل للعلاقات بين الوظائف البكتيرية المعوية وصحة المضيف.

Introduction

تلعب الجراثيم (أي العتائق والبكتيريا وحقيقيات النوى والفيروسات) أدوارا حاسمة في الحفاظ على صحة المضيف والمساهمة في تطور الأمراض المختلفة من خلال التأثير على العمليات الفسيولوجية والمرضية من خلال التفاعلات التكافلية داخل الحاجز المعوي والسطح الظهاري ووظائف الميوسين لدى الأفراد1،2،3. يتشكل تكوين الجراثيم عبر مراحل الحياة المختلفة ، من الطفولة إلى الأحداث ، والبلوغ ، والشيخوخة ، بالإضافة إلى وجودها في مواقع مختلفة مثل مواقع الفم والفم والجلد والأمعاء ، بشكل ديناميكي من خلال الموائل والبيئات المتنوعة4. تشارك الجراثيم المعوية في ا....

Protocol

أجريت تجارب الأسماك وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية واستخدام في تشونغتشينغ واللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في جامعة تشونغتشينغ الطبية ، الصين ، وكذلك معايير التجارب الصادرة عن مكتب الدولة للجودة والإشراف الفني (معرف الموافقة: GB14922-2001 إلى GBT14927-2001). تم الحصول على الزرد (Danio rerio ، النوع البري ، سلالة AB) من معهد علم الأحياء المائية ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، وتم الاحتفاظ بها في المختبر باتباع الإجراءات المبلغ عنها سابقا36.

1. صيانة الزرد البالغ وجمع الأجنة

ملاحظة: بالاعتماد على التعديلات من الدراسات والتقارير السابقة16....

النتائج

يمكن إنتاج نماذج أسماك الزرد GF بكفاءة من خلال الاستفادة من البيض الوفير الذي تنتجه أزواج من أسماك الزرد ، مع تحسين البروتوكول بناء على نماذج أسماك GF السابقة35. يمكن للوحة واحدة مكونة من 6 آبار زراعة ما يقرب من 30-48 جنينا / يرقة ، مما يسمح بجمع بيانات وافرة وتحليل إحصائي. بعد المعال.......

Discussion

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكولات أسماك GF وإعداد الطعام GF
خلال توليد نماذج أسماك GF ، تم تضمين العديد من الخطوات الحاسمة ، بما في ذلك تحضير المواد المعقمة ، وتعقيم الأجنة ، والتجديد اليومي ل GZM ، وجمع العينات المختلفة ، والفحص المعقم لكل عينة باستخدام طرق متعددة. من بين هذه الخطوات ،.......

Disclosures

تم منح بروتوكول GF Artemia كبراءة اختراع من قبل الإدارة الوطنية الصينية للملكية الفكرية ، والتي ستخفف من الاستخدام المقيد للطريقة بعد الحصول على إذن المؤلفين. يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح منافسة أو مالية أخرى.

Acknowledgements

نشكر بصدق الدعم المقدم من مشروع المواهب بجامعة تشونغتشينغ الطبية (رقم R4014 إلى DSP و R4020 إلى PPJ) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، رقم 32200386 إلى PPJ) ، واستوديو تشونغتشينغ للابتكار بعد الدكتوراه (X7928 DSP) ، وبرنامج المركز الصيني السريلانكي المشترك لأبحاث تكنولوجيا المياه ومظاهرة من قبل الأكاديمية الصينية للعلوم (CAS) / المركز المشترك بين الصين وسريلانكا للتعليم والبحث من قبل CAS.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AB-GZMAmphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.Amphotericin:CAS:1397-89-3;
kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubesbiosharpBS-15-MTo collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well platesLABSELECT 11112To culture fish
AeronomasNCBI databaseNo.MK1784992019-JPP-ESN
Anaerobic TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work stationGENE SCIENCEE200GBacterial isolation, sterile testing
AnalysisGraphPad Prism 5v6.07To analysis the data
API 20 E kits BioMerieux SA, FranceNo.1005915090Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)Shangjia Aquarium Co., Ltd.Aquamaster brandArtemia cysts, and brine shrimp eggs 
Auto cycle system for fish cultureNingbo Hairui Technology Co., LtdNo CatMaintain the fish
AutoclaveZeal WayG154DWSPrepare the materials
BHI AerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI AnaerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubatorLongYue Co., LtdSPXFor fish and plates
Biosafety cabinetHaierHR40-IIA2Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood platessheep blood:SolarbioCat. NO. TX0030Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flaskCorning430639To culture fish
CM-Dil dyesMolecular ProbesCat#C7000  To label the bacteria
Constant temperature shaking incubatorPeiving Co., LtdHZQ-X100Bacterial culture
DatabaseNCBIBacteria and Archaea databaseLink: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipettebiosharpbs-xh-03lUsed to change water, and transfer eggs
Disposable petri dishbiosharpBS-90-DTo culture fish
DNA kitsSolaribioCat#D1600Bacterial genomic DNA extraction kits 
Electric pipetteSCILOGEXLevo meChange water
ExiguobacteriumNCBI databaseNo.MK1785042019-JPP-ESN
GZMSea salt:LANDEBAO Co., Ltd.No CatComposed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water systemHitech Co., LtdPrima-S15Prepare the agents
MicroscopeNikonSMZ18With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kitsTIANGENCat#ET101Taq DNA Polymerase kit
PipetteLABSELECT sp-013-10Change water
Povidone iodine (PVP-I)AladdinLot#H1217005Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converterPinYi Co., LtdAL-06To regulate the light
TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbenchAirtechSW-CJ-2FDSterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish cultureMarine Biological Equipment companyNo CatProduce water for fish
VibrioNCBI databaseNo.MK1785012019-JPP-ESN

References

  1. Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
  2. Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host de....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 206 GF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved