Generierung, Pflege und Identifizierung von keimfreien Zebrafischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Gewinnung keimfreier (GF) Fischembryonen und deren Erhaltung von Larven bis zum Jugendstadium, einschließlich der Probenahme und des Nachweises ihres sterilen Status. Die Verwendung von GF-Modellen mit Infektionen ist wichtig, um die Rolle von Mikroben für die Gesundheit des Wirts zu verstehen.

Zusammenfassung

Zebrafische dienen als wertvolle Modelle für die Erforschung von Wachstum, Immunität und Darmmikrobiota aufgrund ihrer genomischen Ähnlichkeiten mit Säugetieren, transparenten Embryonen, die sich in einer relativ sauberen Chorionumgebung entwickelt haben, und der extrem schnellen Entwicklung von Larven im Vergleich zu Nagetiermodellen. Keimfreie (GF) Zebrafische (Danio rerio) sind entscheidend für die Bewertung der Schadstofftoxizität und die Etablierung menschenähnlicher Krankheitsmodelle in Bezug auf mikrobielle Funktionen. Im Vergleich zu konventionell gezüchteten (CR) Modellen (Fische in gemeinsamer Haltung) ermöglichen GF-Zebrafische eine genauere Manipulation der Wirtsmikrobiota und helfen bei der Bestimmung des kausalen Zusammenhangs zwischen Mikroorganismen und Wirten. Folglich spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung unseres Verständnisses dieser Beziehungen. GF-Zebrafischmodelle werden jedoch in der Regel in den frühen Lebensstadien (vom Embryo bis zur Larve) erstellt und erforscht, da die Immunfunktion und die Nährstoffaufnahme eingeschränkt sind. Diese Studie optimiert die Generierung, Erhaltung und Identifizierung von frühen GF-Zebrafischmodellen ohne Fütterung und mit langfristiger Fütterung mit GF-Futter (wie Artemia sp., Salinengarnelen). Während des gesamten Prozesses wurden täglich Probenahmen und Kulturen durchgeführt und durch mehrere Detektionen, einschließlich Platten und 16S rRNA-Sequenzierung, identifiziert. Die aseptische Rate, das Überleben und die Entwicklungsindizes von GF Zebrafischen wurden erfasst, um die Qualität und Quantität der generierten Modelle sicherzustellen. Wichtig ist, dass diese Studie Details zur bakteriellen Isolierung und zu Infektionstechniken für GF Fische liefert, die die effiziente Erstellung von GF Fischmodellen von der Larve bis zum Jungstadium mit GF Futterunterstützung ermöglichen. Durch die Anwendung dieser Verfahren in der biomedizinischen Forschung können Wissenschaftler die Zusammenhänge zwischen den bakteriellen Funktionen des Darms und der Gesundheit des Wirts besser verstehen.

Einleitung

Die Mikrobiota (d. h. Archaeen, Bakterien, Eukarya und Viren) spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gesundheit des Wirts und tragen zur Entwicklung verschiedener Krankheiten bei, indem sie physiologische und pathologische Prozesse durch symbiotische Wechselwirkungen innerhalb der Darmbarriere, der Epitheloberfläche und der Muzinfunktionen bei Individuen beeinflussen ^1,2,3. Die Zusammensetzung der Mikrobiota in verschiedenen Lebensstadien, vom Säuglingsalter bis zur Jugend, dem Erwachsenenalter und dem Altern, sowie ihre Präs....

Protokoll

Die Fischversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Animal Care and Use Committee von Chongqing und des Institutional Animal Care and Use Committee der Chongqing Medical University, China, sowie den vom State Bureau of Quality and Technical Supervision herausgegebenen Standards für Versuchstiere (Zulassungs-ID: GB14922-2001 bis GBT14927-2001) durchgeführt. Zebrafische (Danio rerio, Wildtyp, AB-Stamm) wurden vom Institut für Hydrobiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften bezogen und nach den zuvor beschriebenen Verfahren im Labor gehalten³⁶.

1. Pflege adulter Zebrafische und ....

Diskussion

Kritische Schritte innerhalb der Protokolle von GF Fisch und GF Speisenzubereitung
Bei der Generierung von GF Fischmodellen waren mehrere kritische Schritte erforderlich, darunter die Aufbereitung des sterilen Materials, die Sterilisation der Embryonen, die tägliche Erneuerung des GZM, die Entnahme verschiedener Proben und die sterile Untersuchung jeder Probe mit mehreren Methoden. Unter diesen Schritten ist die Erstbehandlung von Embryonen grundlegend und entscheidend für den Erfolg der GF Modelle........

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB-GZM	Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.	Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.	49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes	biosharp	BS-15-M	To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates	LABSELECT	11112	To culture fish
Aeronomas	NCBI database	No.MK178499	2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station	GENE SCIENCE	E200G	Bacterial isolation, sterile testing
Analysis	GraphPad Prism 5	v6.07	To analysis the data
API 20 E kits	BioMerieux SA, France	No.1005915090	Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)	Shangjia Aquarium Co., Ltd.	Aquamaster brand	Artemia cysts, and brine shrimp eggs
Auto cycle system for fish culture	Ningbo Hairui Technology Co., Ltd	No Cat	Maintain the fish
Autoclave	Zeal Way	G154DWS	Prepare the materials
BHI Aerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator	LongYue Co., Ltd	SPX	For fish and plates
Biosafety cabinet	Haier	HR40-IIA2	Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates	sheep blood:Solarbio	Cat. NO. TX0030	Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask	Corning	430639	To culture fish
CM-Dil dyes	Molecular Probes	Cat#C7000	To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator	Peiving Co., Ltd	HZQ-X100	Bacterial culture
Database	NCBI	Bacteria and Archaea database	Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette	biosharp	bs-xh-03l	Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish	biosharp	BS-90-D	To culture fish
DNA kits	Solaribio	Cat#D1600	Bacterial genomic DNA extraction kits
Electric pipette	SCILOGEX	Levo me	Change water
Exiguobacterium	NCBI database	No.MK178504	2019-JPP-ESN
GZM	Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.	No Cat	Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system	Hitech Co., Ltd	Prima-S15	Prepare the agents
Microscope	Nikon	SMZ18	With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits	TIANGEN	Cat#ET101	Taq DNA Polymerase kit
Pipette	LABSELECT	sp-013-10	Change water
Povidone iodine (PVP-I)	Aladdin	Lot#H1217005	Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter	PinYi Co., Ltd	AL-06	To regulate the light
TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench	Airtech	SW-CJ-2FD	Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture	Marine Biological Equipment company	No Cat	Produce water for fish
Vibrio	NCBI database	No.MK178501	2019-JPP-ESN