유충에서 유년기까지 무균 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별

요약

이 프로토콜은 무균(GF) 어류 배아를 얻고 유충에서 유년기까지 유지하기 위한 주요 단계를 간략하게 설명하며, 여기에는 불임 상태 샘플링 및 감지가 포함됩니다. 감염과 함께 GF 모델을 사용하는 것은 숙주 건강에서 미생물의 역할을 이해하는 데 중요합니다.

초록

제브라피쉬는 포유류와의 게놈적 유사성, 상대적으로 깨끗한 융모막 환경에서 발달한 투명한 배아, 설치류 모델에 비해 매우 빠른 유충 발달로 인해 성장, 면역 및 장내 미생물군에 대한 연구에 귀중한 모델 역할을 합니다. 무균(GF) 제브라피시(Danio rerio)는 오염 물질 독성을 평가하고 미생물 기능과 관련된 인간과 유사한 질병 모델을 확립하는 데 중요합니다. Conventionally Raised (CR) 모델 (일반 양식의 물고기)과 비교하여 GF 제브라피쉬는 숙주 미생물군을 보다 정확하게 조작할 수 있어 미생물과 숙주 간의 인과 관계를 결정하는 데 도움이 됩니다. 결과적으로, 그들은 이러한 관계에 대한 우리의 이해를 발전시키는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 GF 제브라피시 모델은 일반적으로 면역 기능과 영양소 흡수의 제한으로 인해 초기 생애 단계(배아에서 유충까지)에서 생성 및 연구됩니다. 이 연구는 GF 식품( 예: Artemia sp., 염수 새우)을 사용하여 먹이를 주지 않고 장기간 먹이를 주는 초기 GF 제브라피시 모델의 생성, 유지 관리 및 식별을 최적화합니다. 프로세스 전반에 걸쳐 일일 샘플링 및 배양이 수행되었으며 플레이트 및 16S rRNA 염기서열분석을 포함한 여러 검출을 통해 식별되었습니다. GF 제브라피쉬의 무균 속도, 생존 및 발달 지수를 기록하여 생성된 모델의 품질과 수량을 보장했습니다. 중요한 것은 이 연구가 GF 물고기에 대한 박테리아 분리 및 감염 기술에 대한 세부 정보를 제공하여 GF 식품 지원을 통해 유충에서 유년기까지 GF 물고기 모델을 효율적으로 생성할 수 있다는 것입니다. 이러한 절차를 생물 의학 연구에 적용함으로써 과학자들은 장내 박테리아 기능과 숙주 건강 간의 관계를 더 잘 이해할 수 있습니다.

서문

미생물군(즉, 고세균, 박테리아, 진핵생물 및 바이러스)은 개인의 장 장벽, 상피 표면 및 점액 기능 내에서 공생적 상호 작용을 통해 생리학적 및 병리학적 과정에 영향을 미침으로써 숙주의 건강을 유지하고 다양한 질병의 발병에 기여하는 데 중요한 역할을 합니다 ^1,2,3. 유아기에서 청소년기, 성인기, 노화기에 이르기까지 다양한 생애 단계에 걸친 미생물군의 구성과 비강, 구강, 피부 및 장 부위와 같은 다양한 위치에 존재하는 미생물총은 다양한 서식지와 환경에 의해 동적으로 형성됩니다⁴. 유기체의 장내 미생물군은 영양소 흡수, 면역 반응, 병원체 침입, 대사 조절 등에 관여합니다 ^5,6. 환자에 대한 연구에 따르면 장내 미생물군의 교란은 인간의 비만, 수면 장애, 우울증, 염증성 장 질환(IBD), 신경 퇴행성 질환(파킨슨병, 알츠하이머병), 노화 및 다양한 암과 관련이 있습니다 ^7,8....

프로토콜

물고기 실험은 중국 충칭 동물 관리 및 사용 위원회와 중국 충칭 의과대학 기관 동물 보호 및 사용 위원회의 지침과 국가 품질 기술 감독국(승인 ID: GB14922-2001 - GBT14927-2001)에서 발행한 실험 동물 표준에 따라 수행되었습니다. 제브라피시(Danio rerio, 야생형, AB 균주)는 중국과학원(Chinese Academy of Sciences)의 수생물학 연구소(Institute of Hydrobiology)에서 공급받았으며, 이전에 보고된 절차에 따라 실험실에서 관리되었다³⁶.

1. 성체 제브라피시 유지 및 배아 채취

참고: 이전 연구 및 보고서 16,37,38,39의 수정 사항을 바탕으로 우리 실험실에서 성체 제브라피시, 유충 사육 및 무균(GF) 모델에 대한 관행의 유지 관리는 아래에 설명된 단계에 따라 수행되었습니다. 어류 양식을 위한 초순수 흐름 ....

토론

GF fish 및 GF 식품 준비 프로토콜 내의 중요한 단계
GF 물고기 모델을 생성하는 동안 멸균 물질 준비, 배아 멸균, GZM의 일일 갱신, 다양한 샘플 채취 및 여러 방법을 사용한 각 샘플의 멸균 검사를 포함하여 몇 가지 중요한 단계가 포함되었습니다. 이러한 단계 중 배아의 초기 치료는 GF 모델의 성공에 기본적이고 결정적인 역할을 합니다. 제제, 농도 및 처리 시간을 제어하는 것은 최적?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB-GZM	Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.	Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.	49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes	biosharp	BS-15-M	To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates	LABSELECT	11112	To culture fish
Aeronomas	NCBI database	No.MK178499	2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station	GENE SCIENCE	E200G	Bacterial isolation, sterile testing
Analysis	GraphPad Prism 5	v6.07	To analysis the data
API 20 E kits	BioMerieux SA, France	No.1005915090	Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)	Shangjia Aquarium Co., Ltd.	Aquamaster brand	Artemia cysts, and brine shrimp eggs
Auto cycle system for fish culture	Ningbo Hairui Technology Co., Ltd	No Cat	Maintain the fish
Autoclave	Zeal Way	G154DWS	Prepare the materials
BHI Aerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator	LongYue Co., Ltd	SPX	For fish and plates
Biosafety cabinet	Haier	HR40-IIA2	Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates	sheep blood:Solarbio	Cat. NO. TX0030	Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask	Corning	430639	To culture fish
CM-Dil dyes	Molecular Probes	Cat#C7000	To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator	Peiving Co., Ltd	HZQ-X100	Bacterial culture
Database	NCBI	Bacteria and Archaea database	Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette	biosharp	bs-xh-03l	Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish	biosharp	BS-90-D	To culture fish
DNA kits	Solaribio	Cat#D1600	Bacterial genomic DNA extraction kits
Electric pipette	SCILOGEX	Levo me	Change water
Exiguobacterium	NCBI database	No.MK178504	2019-JPP-ESN
GZM	Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.	No Cat	Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system	Hitech Co., Ltd	Prima-S15	Prepare the agents
Microscope	Nikon	SMZ18	With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits	TIANGEN	Cat#ET101	Taq DNA Polymerase kit
Pipette	LABSELECT	sp-013-10	Change water
Povidone iodine (PVP-I)	Aladdin	Lot#H1217005	Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter	PinYi Co., Ltd	AL-06	To regulate the light
TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench	Airtech	SW-CJ-2FD	Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture	Marine Biological Equipment company	No Cat	Produce water for fish
Vibrio	NCBI database	No.MK178501	2019-JPP-ESN