Génération, maintenance et identification de modèles de poissons-zèbres exempts de germes, des larves aux stades juvéniles

Résumé

Ce protocole décrit les principales étapes à suivre pour obtenir des embryons de poissons exempts de germes (GF) et les maintenir depuis l’état larvaire jusqu’au stade juvénile, y compris l’échantillonnage et la détection de leur statut stérile. L’utilisation de modèles GF avec infection est importante pour comprendre le rôle des microbes dans la santé de l’hôte.

Résumé

Les poissons-zèbres servent de modèles précieux pour la recherche sur la croissance, l’immunité et le microbiote intestinal en raison de leurs similitudes génomiques avec les mammifères, de leurs embryons transparents développés dans un environnement de chorion relativement propre et du développement extrêmement rapide des larves par rapport aux modèles de rongeurs. Les poissons-zèbres exempts de germes (Danio rerio) sont essentiels pour évaluer la toxicité des polluants et établir des modèles de maladies similaires à celles de l’homme liées aux fonctions microbiennes. Par rapport aux modèles élevés de manière conventionnelle (RC) (poissons en élevage commun), le poisson-zèbre GF permet une manipulation plus précise du microbiote de l’hôte, aidant à déterminer la relation de cause à effet entre les micro-organismes et les hôtes. Par conséquent, ils jouent un rôle essentiel dans l’avancement de notre compréhension de ces relations. Cependant, les modèles de poisson-zèbre GF sont généralement générés et étudiés au cours des premiers stades de la vie (de l’embryon à la larve) en raison des limitations de la fonction immunitaire et de l’absorption des nutriments. Cette étude optimise la génération, la maintenance et l’identification des premiers modèles de poissons-zèbres GF sans alimentation et avec une alimentation à long terme avec des aliments GF (tels que Artemia sp., artémias ). Tout au long du processus, des échantillonnages et des cultures quotidiens ont été effectués et identifiés grâce à de multiples détections, y compris des plaques et le séquençage de l’ARNr 16S. Le taux d’asepsie, la survie et les indices de développement du poisson-zèbre GF ont été enregistrés pour garantir la qualité et la quantité des modèles générés. Il est important de noter que cette étude fournit des détails sur les techniques d’isolement bactérien et d’infection des poissons GF, permettant la création efficace de modèles de poissons GF des larves aux stades juvéniles avec un soutien alimentaire GF. En appliquant ces procédures dans la recherche biomédicale, les scientifiques peuvent mieux comprendre les relations entre les fonctions bactériennes intestinales et la santé de l’hôte.

Introduction

Le microbiote (c’est-à-dire les archées, les bactéries, les eucarya et les virus) joue un rôle crucial dans le maintien de la santé de l’hôte et contribue au développement de diverses maladies en influençant les processus physiologiques et pathologiques par le biais d’interactions symbiotiques au sein de la barrière intestinale, de la surface épithéliale et des fonctions de la mucine chez les individus ^1,2,3. La composition du microbiote à travers les différents stades de la vie, de la petite enfance à la jeunesse, à l’âge adulte et au vieillissemen....

Protocole

Les expériences sur les poissons ont été menées conformément aux directives du Comité de protection et d’utilisation des animaux de Chongqing et du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Chongqing, en Chine, ainsi qu’aux normes pour les animaux de laboratoire publiées par le Bureau d’État de la qualité et de la supervision technique (ID d’approbation : GB14922-2001 à GBT14927-2001). Les poissons-zèbres (Danio rerio, type sauvage, souche AB) proviennent de l’Institut d’hydrobiologie de l’Académie chinoise des sciences et sont conservés en laboratoire selon les procédures précédemment rapportées

Discussion

Étapes critiques dans les protocoles du poisson GF et de la préparation des aliments GF
Au cours de la génération des modèles de poissons GF, plusieurs étapes critiques ont été impliquées, notamment la préparation du matériel stérile, la stérilisation des embryons, le renouvellement quotidien du GZM, la collecte de divers échantillons et l’examen stérile de chaque échantillon à l’aide de plusieurs méthodes. Parmi ces étapes, le traitement initial des embryons est fondamental et .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB-GZM	Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.	Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.	49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes	biosharp	BS-15-M	To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates	LABSELECT	11112	To culture fish
Aeronomas	NCBI database	No.MK178499	2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station	GENE SCIENCE	E200G	Bacterial isolation, sterile testing
Analysis	GraphPad Prism 5	v6.07	To analysis the data
API 20 E kits	BioMerieux SA, France	No.1005915090	Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)	Shangjia Aquarium Co., Ltd.	Aquamaster brand	Artemia cysts, and brine shrimp eggs
Auto cycle system for fish culture	Ningbo Hairui Technology Co., Ltd	No Cat	Maintain the fish
Autoclave	Zeal Way	G154DWS	Prepare the materials
BHI Aerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator	LongYue Co., Ltd	SPX	For fish and plates
Biosafety cabinet	Haier	HR40-IIA2	Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates	sheep blood:Solarbio	Cat. NO. TX0030	Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask	Corning	430639	To culture fish
CM-Dil dyes	Molecular Probes	Cat#C7000	To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator	Peiving Co., Ltd	HZQ-X100	Bacterial culture
Database	NCBI	Bacteria and Archaea database	Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette	biosharp	bs-xh-03l	Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish	biosharp	BS-90-D	To culture fish
DNA kits	Solaribio	Cat#D1600	Bacterial genomic DNA extraction kits
Electric pipette	SCILOGEX	Levo me	Change water
Exiguobacterium	NCBI database	No.MK178504	2019-JPP-ESN
GZM	Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.	No Cat	Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system	Hitech Co., Ltd	Prima-S15	Prepare the agents
Microscope	Nikon	SMZ18	With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits	TIANGEN	Cat#ET101	Taq DNA Polymerase kit
Pipette	LABSELECT	sp-013-10	Change water
Povidone iodine (PVP-I)	Aladdin	Lot#H1217005	Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter	PinYi Co., Ltd	AL-06	To regulate the light
TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench	Airtech	SW-CJ-2FD	Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture	Marine Biological Equipment company	No Cat	Produce water for fish
Vibrio	NCBI database	No.MK178501	2019-JPP-ESN