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Resumen

Este protocolo describe los pasos principales para obtener embriones de peces libres de gérmenes (GF) y mantenerlos desde las larvas hasta la etapa juvenil, incluido el muestreo y la detección de su estado estéril. El uso de modelos de GF con infección es importante para comprender el papel de los microbios en la salud del huésped.

Resumen

El pez cebra sirve como modelos valiosos para la investigación sobre el crecimiento, la inmunidad y la microbiota intestinal debido a sus similitudes genómicas con los mamíferos, embriones transparentes desarrollados en un entorno de corion relativamente limpio y un desarrollo extremadamente rápido de las larvas en comparación con los modelos de roedores. El pez cebra libre de gérmenes (Danio rerio) es crucial para evaluar la toxicidad de los contaminantes y establecer modelos de enfermedades similares a las humanas relacionadas con las funciones microbianas. En comparación con los modelos de cría convencional (CR) (peces en cría común), el pez cebra GF permite una manipulación más precisa de la microbiota del huésped, lo que ayuda a determinar la relación causal entre los microorganismos y los huéspedes. En consecuencia, desempeñan un papel fundamental en el avance de nuestra comprensión de estas relaciones. Sin embargo, los modelos de pez cebra GF generalmente se generan e investigan durante las primeras etapas de la vida (desde embriones hasta larvas) debido a limitaciones en la función inmune y la absorción de nutrientes. Este estudio optimiza la generación, el mantenimiento y la identificación de modelos tempranos de pez cebra GF sin alimentación y con alimentación a largo plazo utilizando alimentos GF (como Artemia sp., camarones en salmuera). A lo largo del proceso, se realizaron muestreos e identificados diariamente a través de múltiples detecciones, incluidas placas y secuenciación de ARNr 16S. Se registraron la tasa de aséptica, la supervivencia y los índices de desarrollo del pez cebra GF para garantizar la calidad y cantidad de los modelos generados. Es importante destacar que este estudio proporciona detalles sobre el aislamiento bacteriano y las técnicas de infección para peces GF, lo que permite la creación eficiente de modelos de peces GF desde las etapas larvales hasta juveniles con el apoyo alimenticio de GF. Al aplicar estos procedimientos en la investigación biomédica, los científicos pueden comprender mejor las relaciones entre las funciones bacterianas intestinales y la salud del huésped.

Introducción

La microbiota (es decir, arqueas, bacterias, eucariotas y virus) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la salud del huésped y contribuye al desarrollo de diversas enfermedades al influir en los procesos fisiológicos y patológicos a través de interacciones simbióticas dentro de la barrera intestinal, la superficie epitelial y las funciones de la mucina en los individuos 1,2,3. La composición de la microbiota en las diferentes etapas de la vida, desde la infancia hasta la juventud, la adultez y el envejecimiento, así como su presencia en diversos lugares, como las narinas, la boca, la piel y los intestinos, está moldeada dinámicamente por diversos hábitats y entornos4. La microbiota intestinal de los organismos está implicada en la absorción de nutrientes, la respuesta inmunitaria, la invasión de patógenos, la regulación metabólica, etcétera 5,6. Los estudios en pacientes han demostrado que las alteraciones de la microbiota intestinal están relacionadas con la obesidad humana, los trastornos del sueño, la depresión, la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), las enfermedades neurodegenerativas (Parkinson, Alzheimer), el envejecimiento y diversos tipos de cáncer 7,8,9. Además, las vías interactivas entre la microbiota intestinal y los huéspedes involucran factores inflamatorios, neurotransmisores, metabolitos, barrera intestinal y estrés oxidativo, como se observó en investigaciones anteriores con modelos de ratones y peces10,11.

Recientemente, se han explorado múltiples enfoques o terapias relacionados con las bacterias, incluidos los posibles probióticos y el trasplante de microbiota fecal (TMF), para estos trastornos en modelos clínicos y animales. Estas exploraciones se basan en descubrimientos relacionados con el eje microbiota-intestino-cerebro/hígado/riñón, los productos derivados de la microbiota y la alteración de la actividad de los receptores12,13. Sin embargo, el desarrollo, las diversas funciones y los mecanismos del sistema microbiota-huésped aún no se comprenden e identifican completamente debido a la complejidad de la comunidad microbiana y al desafío de generar modelos potentes de enfermedades similares a los humanos.

Para abordar estos problemas, a mediadosdel siglo XIX se propusieron urgentemente modelos animales libres de gérmenes (GF) y se desarrollaron principalmente durante el sigloXX. Los refinamientos posteriores, incluidos los modelos tratados con antibióticos y gnotobióticos, junto con los avances en las tecnologías de detección y observación microbiana, perfeccionaron aún más estos modelos 14,15,16. Los animales GF, creados borrando su propio fondo y evitando los microbios ambientales, ofrecen una excelente estrategia para explorar las interacciones entre los microorganismos y sus huéspedes17. A través de la aplicación de modelos animales y protocolos refinados, los investigadores han replicado con éxito composiciones microbianas similares encontradas en pacientes con ratones y peces GF. Además, otros modelos animales de GF, como perros, pollos y cerdos, ofrecen diversas opciones como sujetos de investigación 18,19,20,21. Este enfoque ha permitido investigar los posibles efectos terapéuticos de los microbiomas comensales en diversas enfermedades, incluida la inmunoterapia contra el cáncer en humanos16,18. Los modelos GF ofrecen información más precisa sobre las características y los mecanismos de la colonización, migración, multiplicación e interacción bacteriana específica dentro de los huéspedes. Esto proporciona nuevos conocimientos cruciales sobre la aparición y el desarrollo de enfermedades relacionadas con la microbiota22,23. La historia del establecimiento y la aplicación del pez cebra GF en la investigación microbiana ha evolucionado desde los informes de Rawls et al. en 2004 y Bates et al. en 2006 hasta el protocolo de Melancon et al. en 2017 16,24,25. Sin embargo, la viabilidad de los modelos de GF adultos o reproductivos sigue siendo un proceso prolongado, acompañado de longevidad, tasas de éxito y desafíos de salud variables.

Entre varios modelos animales, el pez cebra (Danio rerio) se destaca como una herramienta crítica para la investigación básica y biomédica debido a su ventajosa similitud con los órganos humanos y la genómica, su corto ciclo de desarrollo, su alta fecundidad y sus embriones transparentes19,26. El pez cebra, que sirve como modelo fiable de enfermedades humanas, ofrece una representación visual de los procesos fisiológicos y patológicos in vivo, proporcionando información sobre las atractivas características de las interacciones huésped-microbio. En particular, el pez cebra exhibe linajes celulares distintos, lo que permite obtener imágenes de la fisiología intestinal, la dinámica microbiana, las gónadas y el desarrollo reproductivo, la maduración del sistema inmunológico del huésped, el comportamiento y el metabolismo. Los embriones de pez cebra se desarrollan dentro de coriones protectores hasta la eclosión, convirtiéndose en larvas a los 3 días después de la fertilización (dpf). Cazan activamente alimento a los 5 dpf y alcanzan la madurez sexual alrededor de los 3 meses después de la fertilización (mpf)28. El primer pez cebra libre de gérmenes (GF) exitoso, reportado por Rawls et al.24, mostró que las larvas alimentadas con alimento esterilizado en autoclave después de la absorción de la yema exhibieron necrosis tisular a partir de 8 dpf y muerte total a 20 dpf. Esto indicó los efectos de la dieta o la importancia de considerar el suministro de nutrientes exógenos en experimentos con peces GF a largo plazo (>7 dpf)29. Estudios posteriores mejoraron el protocolo de generación de peces GF, empleando alimentos estériles y métodos perfeccionados en diferentes modelos de peces16.

Sin embargo, la mayoría de las investigaciones sobre modelos de pez cebra GF se han centrado en las primeras etapas de la vida, involucrando infección bacteriana a 5 dpf durante 24 h a 48 h, con muestras recolectadas antes de 7 dpf al final de los experimentos 25,30,31. Es ampliamente reconocido que la microbiota de los organismos, incluidos los humanos y el pez cebra, se coloniza al comienzo de la vida y se moldea durante el crecimiento y el desarrollo. La composición se mantiene estable en las etapas adultas, y el papel de la microbiota en el huésped es crucial a lo largo de la vida, especialmente en los aspectos relacionados con el envejecimiento, la obesidad neurodegenerativa, la obesidad metabólica y las enfermedades intestinales3. Por lo tanto, las perspectivas de los animales GF con una supervivencia más larga pueden proporcionar información sobre los mecanismos de los roles microbianos en el desarrollo y las funciones de los órganos del huésped, considerando los sistemas inmunológico y reproductivo inmaduros de las larvas de peces en los primeros años de vida. Si bien las cepas bacterianas en los intestinos del pez cebra se han aislado e identificado en estudios previos, lo que ofrece el potencial de infectar modelos animales GF para seleccionar probióticos o investigar las funciones bacterianas en el huésped19,25, la generación y aplicación de modelos de peces GF se ha restringido principalmente a las primeras etapas de la vida. Esta limitación, atribuida al complejo proceso de producción, a los elevados costes de mantenimiento y a los problemas asociados con la alimentación y la inmunidad, dificulta los esfuerzos de investigación destinados a investigar los efectos crónicos y del desarrollo de la microbiota en el huésped.

La tasa de supervivencia, el comportamiento, el crecimiento, la maduración y la salud general de los peces, especialmente en modelos libres de gérmenes (GF), están significativamente influenciados por las prácticas de alimentación, que abarcan la ingesta y absorción de nutrientes durante el período de apertura de la boca desde las larvas tempranas hasta los juveniles32,33. Sin embargo, uno de los desafíos en la cría de peces transgénicos es la escasez de dietas estériles adecuadas, lo que limita la efectividad del apoyo nutricional para mantener el crecimiento y la supervivencia de las larvas. Resolver este problema es crucial para restaurar la vida de los peces GF, teniendo en cuenta sus mecanismos de defensa del desarrollo y su débil capacidad de digestión debido a la ausencia de un microbioma intestinal. En términos de alimentación, el camarón de salmuera vivo (Artemia sp.) emerge como la dieta más adecuada para las larvas con la boca abierta a los peces juveniles. Se ha observado que los peces alimentados con camarones vivos exhiben mayores tasas de crecimiento y supervivencia en comparación con los alimentados con yema de huevo cocida u otros cebos naturales y sintéticos34. Si bien los modelos de vida temprana de los peces GF pueden sobrevivir con el apoyo de la yema y los modelos de larvas GF pueden mantenerse con alimentación estéril, la generación de modelos a largo plazo desde larvas hasta juveniles y alcanzar la madurez sexual sigue siendo un desafío. Además, los alimentos en escamas o en polvo están limitados por una composición nutricional desigual y pueden afectar la calidad del agua. Por el contrario, la Artemia viva tiene ventajas como la supervivencia tanto en agua salada como dulce, tamaño pequeño adecuado para larvas y adultos, facilidad de procesamiento por lotes y mayor calidad de eclosión35. Sobre la base de los métodos anteriores 16,24,30, hemos simplificado el complejo proceso de tratamiento y abordado el desafío de la dieta al establecer Artemia sp. viva GF fácilmente incubable como alimento estéril durante períodos más largos que los peces GF tempranos.

Este estudio presenta un protocolo optimizado que cubre (1) la generación, (2) el mantenimiento, (3) la identificación de la tasa de esterilidad y (4) el mantenimiento y la alimentación para garantizar el crecimiento del pez cebra libre de gérmenes (GF) desde los embriones hasta las larvas y las etapas juveniles. Los resultados ofrecen evidencia preliminar sobre la eclosión, supervivencia, crecimiento y esterilidad del pez cebra GF, junto con índices esenciales para GF Artemia sp. como alimento estéril. Los pasos detallados en la generación de modelos y la preparación de alimentos vivos estériles proporcionan un apoyo técnico crucial para la construcción y aplicación de modelos a largo plazo de peces GF, así como de GF Artemia sp. en la investigación de la interacción entre la microbiota y el huésped. El protocolo aborda el aislamiento, la identificación y la infección bacteriana en modelos de peces GF, describiendo métodos para el etiquetado de fluorescencia bacteriana y observando su colonización en los intestinos de los peces bajo un microscopio. Los peces GF, los peces gnotobióticos con infección bacteriana o los modelos de microbiota humana transferidos se someterán a diversas detecciones para dilucidar sus funciones y efectos sobre la inmunidad del huésped, la digestión, el comportamiento, la regulación transcriptómica y los aspectos metabólicos. A largo plazo, este protocolo puede extenderse a diferentes especies de peces de tipo salvaje, como la medaka marina, y potencialmente a otras líneas de pez cebra transgénicas seleccionadas correlacionadas con tejidos o enfermedades específicas.

Protocolo

Los experimentos con peces se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales de Chongqing y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Chongqing, China, así como con las normas para animales de experimentación emitidas por la Oficina Estatal de Calidad y Supervisión Técnica (ID de aprobación: GB14922-2001 a GBT14927-2001). El pez cebra (Danio rerio, tipo salvaje, cepa AB) se obtuvo del Instituto de Hidrobiología de la Academia China de Ciencias y se mantuvo en el laboratorio siguiendo los procedimientos previamente informados36.

1. Mantenimiento y recolección de embriones de pez cebra adulto

NOTA: Sobre la base de las modificaciones de los estudios e informes anteriores 16,37,38,39, el mantenimiento del pez cebra adulto, la cría de larvas y las prácticas para modelos libres de gérmenes (GF) en nuestro laboratorio se llevaron a cabo siguiendo los pasos que se describen a continuación. El sistema de flujo ultrapuro para el cultivo de peces se obtuvo comercialmente (ver Tabla de Materiales). El agua, mantenida con un pH, sal y álcali equilibrados, se filtra durante el ciclo para garantizar condiciones limpias.

  1. Mantener peces adultos con el siguiente procedimiento estándar en el sistema de ciclo automático (ver Tabla de Materiales) con un fotoperiodo de oscuridad: luz = 10 h: 14 h a 28 °C ± 0,5 °C y alimentados con Artemia sp fresca incubada. dos veces al día.
  2. Coloque el pez cebra adulto sexualmente maduro (macho: hembra = 2:1) en tanques con agua fresca y limpia la noche anterior.
  3. Deje que los peces desoven a la mañana siguiente (aproximadamente a las 8:30 a.m.) bajo estimulación lumínica regular en el laboratorio. Después de 1-2 h, transfiera el pez a otro tanque.
  4. Recoja los embriones en agua desde el sistema de auto-ciclado como medio de cría en una placa de cultivo utilizando una pipeta Pasteur desechable.

2. Generación de pez cebra GF de embriones a larvas

NOTA: El procedimiento para generar peces libres de gérmenes (GF) se describe en la Figura 1, mientras que los índices básicos de desarrollo de los modelos convencionales (CR) y GF se presentan en la Figura 1 suplementaria. Siga los pasos que se describen a continuación en una cabina de seguridad biológica de sobremesa o una campana de flujo laminar utilizando una técnica aséptica estéril en una sala limpia.

  1. Lavar los embriones con el agua de cultivo de peces y eliminar las heces, las impurezas y los huevos muertos o no fertilizados.
  2. Transfiera los embriones a 2 hpf a placas esterilizadas (hasta 480 embriones por placa estéril de 10 cm de diámetro) llenas de solución de medio antibiótico para pez cebra libre de gérmenes (AB-GZM, consulte la tabla de materiales) y cultive a 28,5 °C durante 6-8 h.
    NOTA: AB-GZM se utiliza para tratar los embriones durante varias horas para eliminar los microorganismos de la superficie, y GZM sin antibióticos se utiliza para cultivar peces GF en subsecuencia. Por lo general, el tiempo de cultivo perfeccionado es de 6 h).
  3. Excluya los huevos con manchas blancas o de aspecto blanquecino, y seleccione aquellos que estén normalmente desarrollados, mostrando sobres transparentes e intactos para su posterior procesamiento.
  4. Enjuague los embriones con AB-GZM tres veces en 10 minutos.
  5. Remojar los embriones en una solución de povidona yodada (PVP-I) de 0,2 g/L durante 1 min (ver Tabla de Materiales).
    NOTA: Una concentración más alta y más de 2 minutos influirá en la tasa de muerte y eclosión de los embriones.
  6. Lave los embriones con medio de pez cebra libre de gérmenes (GZM) tres veces en 10 minutos.
  7. Agregue los embriones a la solución de trabajo de hipoclorito de sodio (NaClO), cubra herméticamente los tubos de microcentrífuga de 50 ml y lejíbase durante 15 minutos. Durante este período, suspenda los embriones en una solución de lejía agitándolos suavemente.
  8. Lavar los embriones con GZM tres veces en 10 minutos.
  9. Transfiera los embriones a placas estériles de 6 pocillos con 5 embriones y 10 mL de GZM por pocillo. Cultivarlos en una plataforma o incubadora ultralimpia con un fotoperiodo de oscuridad: luz = 10 h: 14 h a 28 °C ± 0,5 °C. La densidad de cultivo influirá en la tasa de esterilidad.
  10. Renueve el medio de cultivo diariamente eliminando el GZM gastado, recogiéndolo como muestras para la detección del estado estéril y reponiendo cada pocillo con el mismo volumen de GZM estéril.
  11. Registre los índices básicos de desarrollo de los embriones/larvas GF, incluida la tasa de supervivencia, la tasa de eclosión, los latidos del corazón, la longitud y el peso corporales, etcétera19.
  12. Transfiera el pez GF a recipientes adecuados (platos, matraces de cultivo celular o botellas de vidrio con tapas) con volumen expandido, proporcionando alimento estéril durante todo el proceso de crecimiento.

3. Mantenimiento del pez cebra GF desde larvas hasta juveniles

  1. Renueve el GZM sin alimentación antes de los 7 dpf y detecte diariamente los estados estériles (ver paso 5).
  2. Alimente las larvas de pez cebra desde los 8 dpf hasta las etapas juveniles con yema de huevo estéril (10 μL de solución madre preparada por pocillo) una vez al día antes de cambiar GZM.
  3. Alimente a los juveniles GF a partir de 14 dpf con yema de huevo esterilizada mezclada con GF Artemia sp. una vez al día (1-3 Artemia/larvas, ver paso 4), aumentando gradualmente la masa alimenticia con el crecimiento y desarrollo de los peces GF.
  4. Proporcione yema de huevo hasta que todos los peces puedan consumir nauplios de Artemia.
    NOTA: GF Artemia debe someterse a pruebas de esterilidad antes de su uso. Evalúe el número de nauplios de Artemia que quedan, observe el progreso de la persecución y la captura, y examine el cuerpo del pez con el alimento consumido para indicar el éxito de la alimentación.
  5. Desde los 28 dpf hasta las primeras etapas adultas, alimentar a GF Artemia una vez al día (3-5 Artemia/larvas) y limpiar Artemia muerta o sin explotar, y peces muertos en los residuos de GZM como muestras diarias.
  6. Durante el crecimiento de los peces GF, cambie las placas de 6 pocillos después de 7 dpf por placas estériles o matraces de cultivo celular de 8 a 21 dpf, y luego a botellas estériles después de 21 dpf. Aumente el medio de cultivo y la masa de alimento de acuerdo con el número y peso de peces GF en cada recipiente.
  7. Renueve GZM diariamente y verifique las muestras para garantizar el éxito de los modelos GF.
    NOTA: Mantener modelos de peces libres de gérmenes (GF) hasta la edad adulta temprana y la madurez sexual es un desafío, con una tasa de supervivencia promedio baja a 30 dpf, generalmente menos del 10%. Esto se atribuye principalmente a una inmunidad débil, un retraso en el desarrollo y un deterioro de la función intestinal.

4. Preparación de nauplios de Artemia GF como alimento estéril para modelos de peces GF crónicos

NOTA: El método de cultivo y preparación de Artemia libre de gérmenes (GF) se describe en la Figura 2. Tenga en cuenta que todos los pasos siguientes se llevan a cabo en un gabinete de seguridad biológica de sobremesa, utilizando una técnica aséptica estéril.

  1. Enjuague 0,25 g de quistes de Artemia con 2,4 g/L de hipoclorito de sodio (NaClO, ver Tabla de Materiales) durante 5 min.
  2. Filtre los quistes de Artemia enjuagados con un filtro ultradenso esterilizado (alrededor de 170 mallas de apertura) y lave con agua ultrapura esterilizada tres veces, cada vez durante 1-2 minutos.
  3. Transfiera los quistes de Artemia lavados a 100 mL de agua salina esterilizada al 2.5%, mezcle y empaque para la eclosión aséptica de acuerdo con los pasos que se mencionan a continuación.
  4. Envasar la solución de mezcla de quistes de Artemia tratados con 50 ml en un frasco estéril con un volumen de 100 ml, sellarlo con una película e incubar en una incubadora agitadora a 150 rpm, 30 °C durante 18 h a 24 h con luz.
  5. Extraiga aproximadamente 30 mL de nauplios de Artemia para eclosionar de las capas intermedia e inferior utilizando una pipeta Pasteur desechable.
    NOTA: Evite que los huevos flotantes y las cáscaras vacías alcancen la capa superior. En la Figura 3 se presentan los índices de quistes y nauplios de Artemia libres de gérmenes (GF) incubados durante 24 h.
  6. Filtre las Artemias con un filtro esterilizante y lávelas en un vaso de precipitados esterilizante con agua ultrapura esterilizante tres veces, aproximadamente de 30 s a 1 min cada vez. Por último, añadir 4 mL de agua ultrapura esterilizada para preparar la solución mezclada de Artemia .
  7. Con una pipeta Pasteur desechable, recupere la Artemia que nada activamente de la capa superior, lave y prepare la solución de nauplios para la alimentación y la identificación aséptica.

5. Identificación de modelos de peces GF en todas las etapas de la vida

NOTA: A lo largo de todas las etapas de vida de los peces libres de gérmenes (GF), los índices clave y las detecciones diarias de muestras son cruciales para garantizar el éxito de los modelos. Este paso resume la clasificación común de las muestras y los métodos habituales de identificación (Figura 4).

  1. Observe y cuente diariamente el estado de supervivencia y la tasa de larvas de pez cebra GF. En experimentos que calculan tasas relacionadas, los peces GF se cultivan en placas de 24 o 48 pocillos con un pez por pocillo.
    1. Tasa de supervivencia = (número de peces vivos en el momento de la observación / número total de huevos) × 100%.
    2. Tasa de esterilidad = (número de peces estériles/número de peces supervivientes) × 100%.
      NOTA: Este protocolo se centra en la tasa de esterilidad de peces vivos. El número de peces estériles se determina contando los peces GF exitosos después de múltiples controles entre los peces vivos. Cualquier modelo de GF de peces muertos o peces vivos que haya fallado debido a la presencia bacteriana se elimina durante los procedimientos posteriores de GF.
  2. Recoja las siguientes muestras de larvas de pez cebra GF.
    1. Medio de cultivo de pez cebra GF de cada pocillo o contenedor de botella.
    2. Alimento para peces, como yema de huevo estéril y GF Artemia.
    3. Medio de desecho, incluidos fragmentos de la membrana del huevo después de la eclosión y residuos de alimentos o heces durante los períodos de alimentación de larvas a peces juveniles.
    4. Muestras de peces muertos para identificar la presencia de bacterias.
    5. Medio y agentes de peces utilizados en el tratamiento embrionario como control estéril.
    6. Muestras de materiales, plataforma operativa e incubadora, etcétera.
  3. Detecte las muestras recogidas diariamente utilizando múltiples métodos.
    1. En primer lugar, utilice el método de la placa extendida y las placas de cultivo en una incubadora a 30 °C.
      1. Cubra con 20-50 μL de muestra de medio residual en la placa de agar de soja tripticasa (TSA) (consulte la tabla de materiales) en condiciones aeróbicas.
      2. Cubrir con 20-50 μL de muestra de medio residual en la placa TSA en condiciones anaeróbicas.
      3. Cubrir con 20-50 μL de muestra de medio residual en las placas de TSA de sangre (ver Tabla de Materiales) en condiciones aeróbicas.
      4. Cubrir con 20-50 μL de muestra de medio residual en las placas de TSA de sangre en condiciones anaeróbicas.
    2. En segundo lugar, utilice el método de cultivo líquido.
      1. Introducir 200 μL de muestra en tubos aeróbicos con medio Brain Heart Infusion Calth (BHI) (ver Tabla de Materiales) y cultivar en la incubadora de agitación a 30 °C, 150-180 rpm.
      2. Añadir 200 μL de muestra en tubos anaeróbicos con medio BHI y cultivar en la incubadora a 30 °C.
      3. Añadir 200 μL de muestra en tubos aeróbicos con medio de caldo de soja tripticasada (TSB) y, a continuación, cultivar en la incubadora agitadora a 30 °C, 150-180 rpm.
      4. Añadir 200 μL de muestra en tubos anaeróbicos con medio TSB y cultivar en la incubadora a 30 °C.
    3. En tercer lugar, utilice técnicas moleculares-ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 16s.
      1. Analice la muestra de aguas residuales con dos pares de cebadores 27F y 1492R, así como 63F y 1387R (Tabla 1).
        NOTA: La mezcla maestra de PCR se preparó de acuerdo con la Tabla 2 utilizando un kit de ADN polimerasa disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales), y la máquina de PCR se configuró con el programa especificado en la Tabla 3.
      2. Una vez completado el programa de PCR, examine los productos mediante electroforesis en gel de agarosaal 1% 40 en bandas objetivo de 1465 pb (utilizando los cebadores 27F y 1492R) o 1324 pb (utilizando los cebadores 63F y 1387R) para inferir la esterilidad de las muestras.
  4. Registre y observe las pruebas de esterilidad, incluyendo el cultivo en placa y en medio de 24 h a 3 días y 7 días, durante los cuales ninguna colonia en las placas y ninguna turbidez en el líquido indican el éxito de la construcción de los modelos GF. Observe y registre la placa y el medio a las 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h y 168 h.

6. Identificación de muestras de Artemia GF antes de alimentarse de peces GF

NOTA: Para detectar las muestras de GF Artemia , que son indispensables como alimento vivo antes de alimentarse de peces GF (Figura 4), siga los pasos a continuación.

  1. Recoja muestras de modelos de GF Artemia .
    1. Quistes de artemia no tratados.
    2. Quistes de artemia GF tratados.
    3. Nauples de Artemia GF eclosionados.
    4. Agua ultrapura esterilizada como control.
  2. Detecte la artemia GF con los siguientes métodos.
    1. Utilice el método de placa extendida para detectar las muestras recubriéndolas con placas TSA y placas TSA sanguíneas en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. Incubarlos a 30 °C.
    2. Utilice un medio líquido para detectar las muestras en tubos TSB y BHI aeróbicos y anaeróbicos. Cultivo en agitador a 150-180 rpm, 30 °C.
    3. Utilice el ensayo de PCR para detectar la presencia de bacterias en las muestras recogidas utilizando los genes diana de ARN ribosómico 16s cebadores 27F y 1492R, 63F y 1387R (Tabla 1). El volumen y el programa se muestran en la Tabla 2 y la Tabla 3.
  3. Registre los resultados: Detecte el producto de PCR mediante electroforesis en gel de agarosaal 1% 40 para bandas diana que midan 1465 pb (con cebadores 27F y 1492R) o 1324 pb (con cebadores 63F y 1387R). Los resultados de las placas y el medio líquido pueden garantizar el estado estéril de GF Artemia antes de ser utilizado como alimento para peces GF.

7. Aislamiento e identificación de cepas bacterianas intestinales de pez cebra

NOTA: Para explorar las funciones intestinales in vitro e in vivo, es necesario aislar las cepas bacterianas del pez cebra, que también proporcionan la fuente de la especie para los posibles probióticos cribados por infección con animales GF (Figura 5). En este protocolo, describimos el método tradicional de disección para obtener el contenido intestinal, mientras que las muestras también se pueden recolectar directamente de peces vivos anestesiados (datos no mostrados).

  1. Elija peces cebra adultos sanos y lávelos con agua estéril. Realice los siguientes pasos en el banco limpio.
  2. Anestesiar al pez con 100 mg/L MS-222 durante 5-10 min.
  3. Use alcohol al 75% para tratar la superficie corporal del pez.
  4. Diseccionar los intestinos de los peces y extruir el contenido intestinal con medio TSB o BHI.
  5. Incubar el sobrenadante intestinal mediante la aplicación de TSA, placa de sangre, TSB y medio BHI en condiciones aeróbicas y anaeróbicas.
  6. Traduzca las bacterias para obtener la tensión de señal y registre las características de las diferentes colonias.
  7. Almacene las bacterias dentro de un 30% de glicerol a -80 °C.
  8. A continuación, identificar las bacterias intestinales mediante extracción de ADN genómico y secuenciación por PCR.
    NOTA: Los pasos principales de la extracción de ADN genómico bacteriano incluyen la centrifugación líquida, la disociación de la RNasa A y la proteasa K, la extracción, el enjuague y la disolución con alcohol etílico utilizando kits disponibles comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
  9. Analice las secuencias 16S utilizando el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y la Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica (BLAST) con la base de datos de Bacterias y Arqueas40,41 (ver Tabla de Materiales).
  10. Elija las bacterias y los caracteres que mejor coincidan para identificar las cepas intestinales aisladas a nivel de género.
  11. Detectar las funciones metabólicas de las cepas bacterianas utilizando kits disponibles en el mercado (ver Tabla de Materiales).

8. Etiqueta de gripe, infección y colonización de bacterias en intestinos de pez cebra GF

NOTA: Antes de infectar al pez cebra GF, las bacterias aisladas se modificaron con colorantes y se contaron, haciendo visible la colonización y migración microbiana de forma continua e in vivo (Figura 6).

  1. Elija bacterias potencialmente beneficiosas o cepas dominantes con alta abundancia en el huésped para infectar los modelos de peces GF.
    NOTA: Las bacterias utilizadas en este estudio fueron Aeromonas sp. y Vibrio sp. (ver Tabla de Materiales), seleccionadas de los 8 géneros que se aislaron e identificaron a partir de peces cebra adultos tipo silvestre en el laboratorio42.
  2. Etiquete las bacterias frescas con colorantes CM-Dil (consulte la Tabla de materiales) y expóngalas al pez cebra GF a 5 dpf con una concentración de 10 6-10 8 Unidades Formadoras de Colonias (UFC)/mL.
  3. Observe la fluorescencia bajo el microscopio fluorescente con un aumento de 3× para indicar la colonización y distribución de bacterias en el intestino de las larvas de pez cebra GF de 6 dpf a 14 dpf.
  4. Cuente manualmente el número de bacterias en los peces GF por cultivo en placa en cada punto de tiempo.
  5. Detecte las colonias y secuencias para asegurarse de que la infección tuvo éxito con las cepas bacterianas objetivo.
  6. Recoja muestras de peces GF con infección bacteriana para ensayos posteriores, incluidos el comportamiento neurológico, los índices de desarrollo, el análisis histopatológico y las mediciones hormonales, etcétera 43,44,45.
    NOTA: Las bacterias utilizadas en el experimento de infección deben ser recién recuperadas y recién cultivadas por el medio líquido.

Resultados

Los modelos de pez cebra GF se pueden producir de manera eficiente utilizando los abundantes huevos desovados por parejas de peces cebra, con el protocolo optimizado sobre la base de modelos anteriores de peces GF35. Una sola placa de 6 pocillos puede cultivar aproximadamente de 30 a 48 embriones/larvas, lo que permite una amplia recopilación de datos y análisis estadísticos. Después del tratamiento estéril, los embriones GF se cultivan en una incubadora limpia hasta la eclosión de las larva...

Discusión

Pasos críticos dentro de los protocolos de preparación de pescado y alimentos sin gluten
Durante la generación de los modelos de peces GF, se involucraron varios pasos críticos, incluida la preparación de materiales estériles, la esterilización de embriones, la renovación diaria de GZM, la recolección de varias muestras y el examen estéril de cada muestra utilizando múltiples métodos. Entre estos pasos, el tratamiento inicial de los embriones es fundamental y decisivo para el éxito de los...

Divulgaciones

El protocolo de GF Artemia ha sido concedido como patente por la Administración Nacional de Propiedad Intelectual de China, lo que aliviará el uso restringido del método después de obtener el permiso de los autores. Los autores declaran que no tienen otros intereses contrapuestos o financieros.

Agradecimientos

Agradecemos sinceramente el apoyo del Proyecto de Talento de la Universidad Médica de Chongqing (No. R4014 para DSP y R4020 para PPJ), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC, No.32200386 para PPJ), el Estudio Mentor de Innovación Postdoctoral de Chongqing (X7928 DSP) y el Programa del Centro Conjunto China-Sri Lanka para la Investigación y Demostración de Tecnología del Agua de la Academia China de Ciencias (CAS) / Centro Conjunto China-Sri Lanka para la Educación y la Investigación de CAS.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AB-GZMAmphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.Amphotericin:CAS:1397-89-3;
kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.		49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubesbiosharpBS-15-MTo collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well platesLABSELECT 11112To culture fish
AeronomasNCBI databaseNo.MK1784992019-JPP-ESN
Anaerobic TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work stationGENE SCIENCEE200GBacterial isolation, sterile testing
AnalysisGraphPad Prism 5v6.07To analysis the data
API 20 E kits BioMerieux SA, FranceNo.1005915090Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)Shangjia Aquarium Co., Ltd.Aquamaster brandArtemia cysts, and brine shrimp eggs 
Auto cycle system for fish cultureNingbo Hairui Technology Co., LtdNo CatMaintain the fish
AutoclaveZeal WayG154DWSPrepare the materials
BHI AerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI AnaerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubatorLongYue Co., LtdSPXFor fish and plates
Biosafety cabinetHaierHR40-IIA2Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood platessheep blood:SolarbioCat. NO. TX0030Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flaskCorning430639To culture fish
CM-Dil dyesMolecular ProbesCat#C7000  To label the bacteria
Constant temperature shaking incubatorPeiving Co., LtdHZQ-X100Bacterial culture
DatabaseNCBIBacteria and Archaea databaseLink: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipettebiosharpbs-xh-03lUsed to change water, and transfer eggs
Disposable petri dishbiosharpBS-90-DTo culture fish
DNA kitsSolaribioCat#D1600Bacterial genomic DNA extraction kits 
Electric pipetteSCILOGEXLevo meChange water
ExiguobacteriumNCBI databaseNo.MK1785042019-JPP-ESN
GZMSea salt:LANDEBAO Co., Ltd.No CatComposed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water systemHitech Co., LtdPrima-S15Prepare the agents
MicroscopeNikonSMZ18With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kitsTIANGENCat#ET101Taq DNA Polymerase kit
PipetteLABSELECT sp-013-10Change water
Povidone iodine (PVP-I)AladdinLot#H1217005Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converterPinYi Co., LtdAL-06To regulate the light
TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbenchAirtechSW-CJ-2FDSterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish cultureMarine Biological Equipment companyNo CatProduce water for fish
VibrioNCBI databaseNo.MK1785012019-JPP-ESN

Referencias

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