Generación, mantenimiento e identificación de modelos de pez cebra libres de gérmenes desde las larvas hasta las etapas juveniles

Resumen

Este protocolo describe los pasos principales para obtener embriones de peces libres de gérmenes (GF) y mantenerlos desde las larvas hasta la etapa juvenil, incluido el muestreo y la detección de su estado estéril. El uso de modelos de GF con infección es importante para comprender el papel de los microbios en la salud del huésped.

Resumen

El pez cebra sirve como modelos valiosos para la investigación sobre el crecimiento, la inmunidad y la microbiota intestinal debido a sus similitudes genómicas con los mamíferos, embriones transparentes desarrollados en un entorno de corion relativamente limpio y un desarrollo extremadamente rápido de las larvas en comparación con los modelos de roedores. El pez cebra libre de gérmenes (Danio rerio) es crucial para evaluar la toxicidad de los contaminantes y establecer modelos de enfermedades similares a las humanas relacionadas con las funciones microbianas. En comparación con los modelos de cría convencional (CR) (peces en cría común), el pez cebra GF permite una manipulación más precisa de la microbiota del huésped, lo que ayuda a determinar la relación causal entre los microorganismos y los huéspedes. En consecuencia, desempeñan un papel fundamental en el avance de nuestra comprensión de estas relaciones. Sin embargo, los modelos de pez cebra GF generalmente se generan e investigan durante las primeras etapas de la vida (desde embriones hasta larvas) debido a limitaciones en la función inmune y la absorción de nutrientes. Este estudio optimiza la generación, el mantenimiento y la identificación de modelos tempranos de pez cebra GF sin alimentación y con alimentación a largo plazo utilizando alimentos GF (como Artemia sp., camarones en salmuera). A lo largo del proceso, se realizaron muestreos e identificados diariamente a través de múltiples detecciones, incluidas placas y secuenciación de ARNr 16S. Se registraron la tasa de aséptica, la supervivencia y los índices de desarrollo del pez cebra GF para garantizar la calidad y cantidad de los modelos generados. Es importante destacar que este estudio proporciona detalles sobre el aislamiento bacteriano y las técnicas de infección para peces GF, lo que permite la creación eficiente de modelos de peces GF desde las etapas larvales hasta juveniles con el apoyo alimenticio de GF. Al aplicar estos procedimientos en la investigación biomédica, los científicos pueden comprender mejor las relaciones entre las funciones bacterianas intestinales y la salud del huésped.

Introducción

La microbiota (es decir, arqueas, bacterias, eucariotas y virus) desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la salud del huésped y contribuye al desarrollo de diversas enfermedades al influir en los procesos fisiológicos y patológicos a través de interacciones simbióticas dentro de la barrera intestinal, la superficie epitelial y las funciones de la mucina en los individuos ^1,2,3. La composición de la microbiota en las diferentes etapas de la vida, desde la infancia hasta la juventud, la adultez y el envejecimiento, así como su presencia en d....

Protocolo

Los experimentos con peces se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales de Chongqing y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Chongqing, China, así como con las normas para animales de experimentación emitidas por la Oficina Estatal de Calidad y Supervisión Técnica (ID de aprobación: GB14922-2001 a GBT14927-2001). El pez cebra (Danio rerio, tipo salvaje, cepa AB) se obtuvo del Instituto de Hidrobiología de la Academia China de Ciencias y se mantuvo en el laboratorio siguiendo los procedimientos previamente informados³⁶.

Discusión

Pasos críticos dentro de los protocolos de preparación de pescado y alimentos sin gluten
Durante la generación de los modelos de peces GF, se involucraron varios pasos críticos, incluida la preparación de materiales estériles, la esterilización de embriones, la renovación diaria de GZM, la recolección de varias muestras y el examen estéril de cada muestra utilizando múltiples métodos. Entre estos pasos, el tratamiento inicial de los embriones es fundamental y decisivo para el éxito de los.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB-GZM	Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.	Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.	49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes	biosharp	BS-15-M	To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates	LABSELECT	11112	To culture fish
Aeronomas	NCBI database	No.MK178499	2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station	GENE SCIENCE	E200G	Bacterial isolation, sterile testing
Analysis	GraphPad Prism 5	v6.07	To analysis the data
API 20 E kits	BioMerieux SA, France	No.1005915090	Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)	Shangjia Aquarium Co., Ltd.	Aquamaster brand	Artemia cysts, and brine shrimp eggs
Auto cycle system for fish culture	Ningbo Hairui Technology Co., Ltd	No Cat	Maintain the fish
Autoclave	Zeal Way	G154DWS	Prepare the materials
BHI Aerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator	LongYue Co., Ltd	SPX	For fish and plates
Biosafety cabinet	Haier	HR40-IIA2	Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates	sheep blood:Solarbio	Cat. NO. TX0030	Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask	Corning	430639	To culture fish
CM-Dil dyes	Molecular Probes	Cat#C7000	To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator	Peiving Co., Ltd	HZQ-X100	Bacterial culture
Database	NCBI	Bacteria and Archaea database	Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette	biosharp	bs-xh-03l	Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish	biosharp	BS-90-D	To culture fish
DNA kits	Solaribio	Cat#D1600	Bacterial genomic DNA extraction kits
Electric pipette	SCILOGEX	Levo me	Change water
Exiguobacterium	NCBI database	No.MK178504	2019-JPP-ESN
GZM	Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.	No Cat	Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system	Hitech Co., Ltd	Prima-S15	Prepare the agents
Microscope	Nikon	SMZ18	With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits	TIANGEN	Cat#ET101	Taq DNA Polymerase kit
Pipette	LABSELECT	sp-013-10	Change water
Povidone iodine (PVP-I)	Aladdin	Lot#H1217005	Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter	PinYi Co., Ltd	AL-06	To regulate the light
TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench	Airtech	SW-CJ-2FD	Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture	Marine Biological Equipment company	No Cat	Produce water for fish
Vibrio	NCBI database	No.MK178501	2019-JPP-ESN