Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Riepilogo

Questo protocollo delinea i passaggi principali per ottenere embrioni di pesce privi di germi (GF) e mantenerli dalle larve fino allo stadio giovanile, compreso il campionamento e il rilevamento del loro stato di sterilità. L'uso di modelli GF con infezione è importante per comprendere il ruolo dei microbi nella salute dell'ospite.

Abstract

I pesci zebra fungono da modelli preziosi per la ricerca sulla crescita, l'immunità e il microbiota intestinale grazie alle loro somiglianze genomiche con i mammiferi, agli embrioni trasparenti sviluppati in un ambiente corionico relativamente pulito e allo sviluppo estremamente rapido delle larve rispetto ai modelli di roditori. Il pesce zebra privo di germi (Danio rerio) è fondamentale per valutare la tossicità degli inquinanti e stabilire modelli di malattie simili a quelle umane correlate alle funzioni microbiche. Rispetto ai modelli allevati in modo convenzionale (CR) (pesci in allevamento comune), il pesce zebra GF consente una manipolazione più accurata del microbiota dell'ospite, aiutando a determinare la relazione causale tra microrganismi e ospiti. Di conseguenza, svolgono un ruolo fondamentale nel far progredire la nostra comprensione di queste relazioni. Tuttavia, i modelli di pesce zebra GF sono tipicamente generati e studiati durante le prime fasi di vita (dagli embrioni alle larve) a causa delle limitazioni nella funzione immunitaria e nell'assorbimento dei nutrienti. Questo studio ottimizza la generazione, il mantenimento e l'identificazione dei primi modelli di pesce zebra GF senza alimentazione e con alimentazione a lungo termine utilizzando alimenti GF (come Artemia sp., artemia salina). Durante tutto il processo, sono stati eseguiti campionamenti e colture giornalieri e identificati attraverso rilevamenti multipli, tra cui piastre e sequenziamento dell'rRNA 16S. Sono stati registrati il tasso asettico, la sopravvivenza e gli indici di sviluppo del pesce zebra GF per garantire la qualità e la quantità dei modelli generati. È importante sottolineare che questo studio fornisce dettagli sull'isolamento batterico e sulle tecniche di infezione per i pesci GF, consentendo la creazione efficiente di modelli di pesci GF dalle larve agli stadi giovanili con supporto alimentare GF. Applicando queste procedure nella ricerca biomedica, gli scienziati possono comprendere meglio le relazioni tra le funzioni batteriche intestinali e la salute dell'ospite.

Introduzione

Il microbiota (cioè Archaea, Batteri, Eucarya e virus) svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della salute dell'ospite e contribuisce allo sviluppo di varie malattie influenzando i processi fisiologici e patologici attraverso interazioni simbiotiche all'interno della barriera intestinale, della superficie epiteliale e delle funzioni della mucina negli individui ^1,2,3. La composizione del microbiota nelle diverse fasi della vita, dall'infanzia alla giovinezza, all'età adulta e all'invecchiamento, nonché la sua presenza in vari luoghi come narici, ....

Protocollo

Gli esperimenti sui pesci sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali di Chongqing e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università medica di Chongqing, in Cina, nonché con gli standard per gli animali da esperimento emessi dall'Ufficio statale per la qualità e la supervisione tecnica (ID approvazione: da GB14922-2001 a GBT14927-2001). Il pesce zebra (Danio rerio, wild type, ceppo AB) è stato acquistato dall'Istituto di idrobiologia dell'Accademia cinese delle scienze e mantenuto in laboratorio seguendo le procedure precedentemente riportate³⁶.

Discussione

Passaggi critici all'interno dei protocolli di GF fish e preparazione del cibo GF
Durante la generazione di modelli di pesci GF, sono state coinvolte diverse fasi critiche, tra cui la preparazione di materiali sterili, la sterilizzazione degli embrioni, il rinnovo giornaliero del GZM, la raccolta di vari campioni e l'esame sterile di ciascun campione utilizzando più metodi. Tra questi passaggi, il trattamento iniziale degli embrioni è fondamentale e decisivo per il successo dei modelli GF. Gli agent.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB-GZM	Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.	Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.	49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes	biosharp	BS-15-M	To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates	LABSELECT	11112	To culture fish
Aeronomas	NCBI database	No.MK178499	2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station	GENE SCIENCE	E200G	Bacterial isolation, sterile testing
Analysis	GraphPad Prism 5	v6.07	To analysis the data
API 20 E kits	BioMerieux SA, France	No.1005915090	Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)	Shangjia Aquarium Co., Ltd.	Aquamaster brand	Artemia cysts, and brine shrimp eggs
Auto cycle system for fish culture	Ningbo Hairui Technology Co., Ltd	No Cat	Maintain the fish
Autoclave	Zeal Way	G154DWS	Prepare the materials
BHI Aerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator	LongYue Co., Ltd	SPX	For fish and plates
Biosafety cabinet	Haier	HR40-IIA2	Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates	sheep blood:Solarbio	Cat. NO. TX0030	Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask	Corning	430639	To culture fish
CM-Dil dyes	Molecular Probes	Cat#C7000	To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator	Peiving Co., Ltd	HZQ-X100	Bacterial culture
Database	NCBI	Bacteria and Archaea database	Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette	biosharp	bs-xh-03l	Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish	biosharp	BS-90-D	To culture fish
DNA kits	Solaribio	Cat#D1600	Bacterial genomic DNA extraction kits
Electric pipette	SCILOGEX	Levo me	Change water
Exiguobacterium	NCBI database	No.MK178504	2019-JPP-ESN
GZM	Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.	No Cat	Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system	Hitech Co., Ltd	Prima-S15	Prepare the agents
Microscope	Nikon	SMZ18	With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits	TIANGEN	Cat#ET101	Taq DNA Polymerase kit
Pipette	LABSELECT	sp-013-10	Change water
Povidone iodine (PVP-I)	Aladdin	Lot#H1217005	Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter	PinYi Co., Ltd	AL-06	To regulate the light
TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench	Airtech	SW-CJ-2FD	Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture	Marine Biological Equipment company	No Cat	Produce water for fish
Vibrio	NCBI database	No.MK178501	2019-JPP-ESN