Создание, поддержание и идентификация стерильных моделей данио-рерио от личинок до ювенильных стадий

Резюме

В этом протоколе изложены основные шаги по получению стерильных эмбрионов рыб (GF) и поддержанию их от личинок до ювенильной стадии, включая отбор проб и определение их стерильного статуса. Использование моделей GF с инфекцией важно для понимания роли микробов в здоровье хозяина.

Аннотация

Рыбки данио служат ценными моделями для исследований роста, иммунитета и микробиоты кишечника из-за их геномного сходства с млекопитающими, прозрачных эмбрионов, развивающихся в относительно чистой среде хориона, и чрезвычайно быстрого развития личинок по сравнению с моделями грызунов. Стерильные (GF) данио-рерио (Danio rerio) имеют решающее значение для оценки токсичности загрязняющих веществ и создания моделей заболеваний, подобных человеческим, связанных с микробными функциями. По сравнению с моделями, выращенными традиционным способом (CR) (рыбы в общем хозяйстве), рыбки данио-рерио GF позволяют более точно манипулировать микробиотой хозяина, помогая определить причинно-следственную связь между микроорганизмами и хозяевами. Следовательно, они играют решающую роль в продвижении нашего понимания этих отношений. Тем не менее, модели рыбок данио-рерио GF обычно создаются и исследуются на ранних стадиях жизни (от эмбрионов до личинок) из-за ограничений иммунной функции и усвоения питательных веществ. Это исследование оптимизирует создание, поддержание и идентификацию ранних моделей рыбок данио рерио без кормления и с длительным кормлением с использованием корма GF (например, Artemia sp., артемия, артемия). На протяжении всего процесса выполнялся ежедневный отбор проб и бактериологическое исследование, которые были идентифицированы с помощью нескольких обнаружений, включая секвенирование планшетов и 16S рРНК. Для обеспечения качества и количества сгенерированных моделей были зарегистрированы показатели асептической скорости, выживаемости и развития рыбок данио-рерио. Важно отметить, что это исследование предоставляет подробную информацию о бактериальной изоляции и методах заражения рыб GF, что позволяет эффективно создавать модели рыб GF от личинок до молодых стадий с пищевой поддержкой GF. Применяя эти процедуры в биомедицинских исследованиях, ученые могут лучше понять взаимосвязь между бактериальными функциями кишечника и здоровьем хозяина.

Введение

Микробиота (т. е. археи, бактерии, эукария и вирусы) играет решающую роль в поддержании здоровья хозяина и способствует развитию различных заболеваний, влияя на физиологические и патологические процессы посредством симбиотических взаимодействий в кишечном барьере, эпителиальной поверхности и функциях муцина у людей ^1,2,3. Состав микробиоты на разных этапах жизни, от младенчества до юности, взрослого возраста и старения, а также ее присутствие в различных местах, таких как ноздри, полость рта, кожа и кишечник, динамически формируется различными среда....

протокол

Эксперименты с рыбами проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и их использованию г. Чунцин и Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Чунцинского медицинского университета, Китай, а также стандартами для экспериментальных животных, выпущенными Государственным бюро качества и технического надзора (идентификационный номер одобрения: GB14922-2001 г. - GBT14927-2001 г.). Данио-рерио (Danio rerio, дикий тип, штамм AB) были получены из Института гидробиологии Китайской академии наук и содержались в лаборатории в соответствии с ранее описанными процедурами³⁶.

Результаты

Модели GF данио рерио могут быть эффективно получены за счет использования обильной икры, отнерестящейся парами рыбок данио, с протоколом, оптимизированным на основе предыдущих моделей рыб GF³⁵. Один 6-луночный планшет может культивировать примерно 30-48 эмбрионов/личинок, что .......

Обсуждение

Важнейшие этапы в рамках протоколов приготовления рыбы и пищи для ГФ
Во время создания моделей рыб GF было задействовано несколько важных этапов, включая подготовку стерильных материалов, стерилизацию эмбрионов, ежедневное обновление GZM, сбор различных образцов и стерильное.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB-GZM	Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.	Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.	49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes	biosharp	BS-15-M	To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates	LABSELECT	11112	To culture fish
Aeronomas	NCBI database	No.MK178499	2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station	GENE SCIENCE	E200G	Bacterial isolation, sterile testing
Analysis	GraphPad Prism 5	v6.07	To analysis the data
API 20 E kits	BioMerieux SA, France	No.1005915090	Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)	Shangjia Aquarium Co., Ltd.	Aquamaster brand	Artemia cysts, and brine shrimp eggs
Auto cycle system for fish culture	Ningbo Hairui Technology Co., Ltd	No Cat	Maintain the fish
Autoclave	Zeal Way	G154DWS	Prepare the materials
BHI Aerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic	Coolaber	Cat#PM0640	BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator	LongYue Co., Ltd	SPX	For fish and plates
Biosafety cabinet	Haier	HR40-IIA2	Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO	XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.	CAS: 7681-52-9	Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates	sheep blood:Solarbio	Cat. NO. TX0030	Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask	Corning	430639	To culture fish
CM-Dil dyes	Molecular Probes	Cat#C7000	To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator	Peiving Co., Ltd	HZQ-X100	Bacterial culture
Database	NCBI	Bacteria and Archaea database	Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette	biosharp	bs-xh-03l	Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish	biosharp	BS-90-D	To culture fish
DNA kits	Solaribio	Cat#D1600	Bacterial genomic DNA extraction kits
Electric pipette	SCILOGEX	Levo me	Change water
Exiguobacterium	NCBI database	No.MK178504	2019-JPP-ESN
GZM	Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.	No Cat	Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system	Hitech Co., Ltd	Prima-S15	Prepare the agents
Microscope	Nikon	SMZ18	With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits	TIANGEN	Cat#ET101	Taq DNA Polymerase kit
Pipette	LABSELECT	sp-013-10	Change water
Povidone iodine (PVP-I)	Aladdin	Lot#H1217005	Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter	PinYi Co., Ltd	AL-06	To regulate the light
TSA plates	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx.	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0.	TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic	tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;	tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112;	TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench	Airtech	SW-CJ-2FD	Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture	Marine Biological Equipment company	No Cat	Produce water for fish
Vibrio	NCBI database	No.MK178501	2019-JPP-ESN