JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе изложены основные шаги по получению стерильных эмбрионов рыб (GF) и поддержанию их от личинок до ювенильной стадии, включая отбор проб и определение их стерильного статуса. Использование моделей GF с инфекцией важно для понимания роли микробов в здоровье хозяина.

Аннотация

Рыбки данио служат ценными моделями для исследований роста, иммунитета и микробиоты кишечника из-за их геномного сходства с млекопитающими, прозрачных эмбрионов, развивающихся в относительно чистой среде хориона, и чрезвычайно быстрого развития личинок по сравнению с моделями грызунов. Стерильные (GF) данио-рерио (Danio rerio) имеют решающее значение для оценки токсичности загрязняющих веществ и создания моделей заболеваний, подобных человеческим, связанных с микробными функциями. По сравнению с моделями, выращенными традиционным способом (CR) (рыбы в общем хозяйстве), рыбки данио-рерио GF позволяют более точно манипулировать микробиотой хозяина, помогая определить причинно-следственную связь между микроорганизмами и хозяевами. Следовательно, они играют решающую роль в продвижении нашего понимания этих отношений. Тем не менее, модели рыбок данио-рерио GF обычно создаются и исследуются на ранних стадиях жизни (от эмбрионов до личинок) из-за ограничений иммунной функции и усвоения питательных веществ. Это исследование оптимизирует создание, поддержание и идентификацию ранних моделей рыбок данио рерио без кормления и с длительным кормлением с использованием корма GF (например, Artemia sp., артемия, артемия). На протяжении всего процесса выполнялся ежедневный отбор проб и бактериологическое исследование, которые были идентифицированы с помощью нескольких обнаружений, включая секвенирование планшетов и 16S рРНК. Для обеспечения качества и количества сгенерированных моделей были зарегистрированы показатели асептической скорости, выживаемости и развития рыбок данио-рерио. Важно отметить, что это исследование предоставляет подробную информацию о бактериальной изоляции и методах заражения рыб GF, что позволяет эффективно создавать модели рыб GF от личинок до молодых стадий с пищевой поддержкой GF. Применяя эти процедуры в биомедицинских исследованиях, ученые могут лучше понять взаимосвязь между бактериальными функциями кишечника и здоровьем хозяина.

Введение

Микробиота (т. е. археи, бактерии, эукария и вирусы) играет решающую роль в поддержании здоровья хозяина и способствует развитию различных заболеваний, влияя на физиологические и патологические процессы посредством симбиотических взаимодействий в кишечном барьере, эпителиальной поверхности и функциях муцина у людей 1,2,3. Состав микробиоты на разных этапах жизни, от младенчества до юности, взрослого возраста и старения, а также ее присутствие в различных местах, таких как ноздри, полость рта, кожа и кишечник, динамически формируется различными средами обитания и средамиобитания 4. Кишечная микробиота организмов участвует в усвоении питательных веществ, иммунном ответе, инвазии патогенов, метаболической регуляции и т. д. 5,6. Исследования на пациентах показали, что нарушения микробиоты кишечника связаны с ожирением человека, нарушениями сна, депрессией, воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК), нейродегенеративными заболеваниями (болезнь Паркинсона, Альцгеймера), старением и различными видами рака 7,8,9. Кроме того, интерактивные пути между микробиотой кишечника и хозяевами включают воспалительные факторы, нейротрансмиттеры, метаболиты, кишечный барьер и окислительный стресс, как наблюдалось в предыдущих исследованиях с использованием моделей мышей и рыб10,11.

В последнее время было изучено несколько подходов или методов лечения, связанных с бактериями, включая потенциальные пробиотики и трансплантацию фекальной микробиоты (ТФМ), для этих расстройств на клинических и животных моделях. Эти исследования основаны на открытиях, связанных с осью микробиота-кишечник-мозг/печень/почки, продуктами, полученными из микробиоты, и измененной активностью рецепторов12,13. Однако развитие, различные функции и механизмы системы микробиота-хозяин до сих пор не до конца изучены и идентифицированы из-за сложности микробного сообщества и проблемы создания мощных моделей заболеваний, подобных человеческим.

Для решения этих проблем в середине19-го века были срочно предложены модели на животных, не содержащие микробов, и в основном они были разработаны в течение20-го века. Последующие усовершенствования, в том числе модели, обработанные антибиотиками и гнотобиотические модели, наряду с достижениями в технологиях обнаружения и наблюдения за микроорганизмами, еще больше усовершенствовали эти модели 14,15,16. Животные GF, созданные путем стирания своего собственного фона и избегания микробов окружающей среды, предлагают прекрасную стратегию для изучения взаимодействия между микроорганизмами иих хозяевами. Применяя животные модели и усовершенствованные протоколы, исследователи успешно воспроизвели аналогичные микробные составы, обнаруженные у пациентов, у мышей и рыб GF. Кроме того, другие животные модели ГФ, такие как собаки, куры и свиньи, предоставляют различные варианты в качестве объектов исследования 18,19,20,21. Этот подход позволил исследовать потенциальное терапевтическое воздействие комменсальных микробиомов на различные заболевания, включая иммунотерапию рака у людей 16,18. Модели GF дают более точное представление о характеристиках и механизмах специфической бактериальной колонизации, миграции, размножения и взаимодействия внутри хозяев. Это дает важную новую информацию о возникновении и развитии заболеваний, связанных с микробиотой22,23. История создания и применения рыбок данио-рерио в микробных исследованиях развивалась от отчетов Ролза и др. в 2004 году и Бейтса и др. в 2006 году до протокола Меланкона и др. в 2017 году 16,24,25. Тем не менее, осуществимость взрослых или размножающихся моделей GF все еще является длительным процессом, сопровождающимся переменной продолжительностью жизни, показателями успеха и проблемами со здоровьем.

Среди различных животных моделей данио (Danio rerio) выделяется как важнейший инструмент как для фундаментальных, так и для биомедицинских исследований из-за ее выгодного сходства с человеческими органами и геномикой, короткого цикла развития, высокой плодовитости и прозрачных эмбрионов19,26. Рыбки данио, служащие надежными моделями заболеваний человека, предлагают визуальное представление физиологических и патологических процессов in vivo, давая представление о привлекательных особенностях взаимодействия хозяина и микроба. Примечательно, что рыбки данио демонстрируют различные клеточные линии, что позволяет визуализировать физиологию кишечника, микробную динамику, гонады и репродуктивное развитие, созревание иммунной системы хозяина, поведение и метаболизм27. Эмбрионы данио-рерио развиваются в защитных хорионах до вылупления, становясь личинками через 3 дня после оплодотворения (dpf). Они активно охотятся за пищей при 5 dpf и достигают половой зрелости примерно через 3 месяца после оплодотворения (mpf)28. Первая успешная бесмикробная (GF) рыбка данио, о которой сообщили Rawls et al.24, показала, что личинки, которых кормили автоклавным кормом после поглощения желтка, демонстрировали некроз тканей при 8 dpf и полную гибель при 20 dpf. Это указывало на влияние диеты или важность учета экзогенных питательных веществ в экспериментах с участием долгосрочных (>7 dpf) рыбGF 29. Последующие исследования улучшили протокол генерации рыб GF, используя стерильную пищу и методы, усовершенствованные на различных моделях рыб16.

Тем не менее, большинство исследований на моделях рыбок данио-рерио были сосредоточены на ранних стадиях жизни, включая бактериальную инфекцию при 5 dpf в течение 24-48 часов, с образцами, собранными до 7 dpf по завершении экспериментов 25,30,31. Широко признано, что микробиота организмов, включая людей и рыбок данио, колонизируется в начале жизни и формируется во время роста и развития. Состав остается стабильным на взрослых стадиях, при этом роль микробиоты в организме хозяина имеет решающее значение на протяжении всей жизни, особенно при старении, нейродегенеративном, метаболическом ожирении и кишечных заболеваниях3. Таким образом, взгляды животных с более длительной выживаемостью могут дать представление о механизмах роли микробов в развитии и функциях органов хозяина, учитывая незрелую иммунную и репродуктивную системы личинок рыб в раннем возрасте. В то время как штаммы бактерий в кишечнике рыбок данио были выделены и идентифицированы в предыдущих исследованиях, что дает возможность заражать животные модели GF для выбора пробиотиков или исследования бактериальных функций в организме хозяина19,25, создание и применение моделей рыб GF в основном ограничивалось ранними стадиями жизни. Это ограничение, связанное со сложным производственным процессом, высокими затратами на содержание и связанными с этим проблемами с питанием и иммунитетом, препятствует исследовательским усилиям, направленным на изучение последствий микробиоты для развития и хронических эффектов микробиоты в организме хозяина.

Выживаемость, поведение, рост, созревание и общее состояние здоровья рыб, особенно в стерильных моделях (GF), значительно зависят от практики кормления, охватывающей потребление и поглощение питательных веществ в течение открытого периода от ранних личинок до молоди32,33. Однако одной из проблем в рыбоводстве ГФ является нехватка подходящих стерильных рационов, что ограничивает эффективность питательной поддержки для поддержания роста и выживания личинок. Решение этой проблемы имеет решающее значение для восстановления жизни рыб GF, учитывая их защитные механизмы развития и слабые способности к пищеварению из-за отсутствия кишечного микробиома. С точки зрения питания, живая артемия (Artemia sp.) является наиболее подходящей диетой для личинок с открытым ртом и молодью рыб. Было замечено, что рыбы, которых кормили живыми солеными креветками, демонстрируют более высокие показатели роста и выживаемости по сравнению с рыбами, которых кормили вареным яичным желтком или другими натуральными исинтетическими приманками. В то время как ранние модели рыб GF могут выживать при поддержке желтком, а модели личинок GF могут поддерживаться стерильным питанием, создание долгосрочных моделей от личинок до молодых особей и достижение половой зрелости остается сложной задачей. Кроме того, хлопья или порошки ограничены неравномерным питательным составом и могут повлиять на качество воды. Напротив, живая артемия имеет такие преимущества, как выживание как в соленой, так и в пресной воде, небольшой размер, подходящий для личинок и взрослых особей, простота пакетирования и болеевысокое качество вылупления. Основываясь на предыдущих методах 16,24,30, мы упростили сложный процесс лечения и решили проблему диеты, установив легко инкубируемую живую артемию в качестве стерильного корма в течение более длительного времени, чем рыбы в раннем возрасте.

В этом исследовании представлен оптимизированный протокол, охватывающий (1) поколение, (2) поддержание, (3) идентификацию стерильности и (4) поддержание и кормление для обеспечения роста стерильных рыбок данио (GF) от эмбрионов до личинок и молодых стадий. Результаты дают предварительные данные о вылуплении, выживаемости, росте и стерильности рыбок данио-рерио GF, а также основные показатели GF Artemia sp. в качестве стерильного корма. Подробные этапы создания моделей и приготовления стерильных живых кормов обеспечивают важную техническую поддержку для построения и применения долгосрочных моделей рыб GF, а также GF Artemia sp. в исследованиях взаимодействия микробиоты с хозяином. В протоколе рассматриваются бактериальная изоляция, идентификация и инфекция на моделях рыб GF, описываются методы бактериального флуоресцентного мечения и наблюдение за их колонизацией в кишечнике рыб под микроскопом. Рыбы ГФ, гнотобиотические рыбы с бактериальной инфекцией или перенесенные модели микробиоты человека будут подвергаться различным детекциям, чтобы выяснить их функции и влияние на иммунитет хозяина, пищеварение, поведение, транскриптомную регуляцию и метаболические аспекты. В долгосрочной перспективе этот протокол может быть распространен на различные виды рыб дикого типа, такие как морская медака, и, возможно, на другие выбранные трансгенные линии данио-рерио, связанные с конкретными тканями или заболеваниями.

протокол

Эксперименты с рыбами проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и их использованию г. Чунцин и Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Чунцинского медицинского университета, Китай, а также стандартами для экспериментальных животных, выпущенными Государственным бюро качества и технического надзора (идентификационный номер одобрения: GB14922-2001 г. - GBT14927-2001 г.). Данио-рерио (Danio rerio, дикий тип, штамм AB) были получены из Института гидробиологии Китайской академии наук и содержались в лаборатории в соответствии с ранее описанными процедурами36.

1. Содержание взрослых рыбок данио и сбор эмбрионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на изменениях из предыдущих исследований и отчетов 16,37,38,39, содержание взрослых рыбок данио-рерио, выращивание личинок и методы работы с стерильными моделями (GF) в нашей лаборатории проводились в соответствии с шагами, описанными ниже. Коммерчески получена сверхчистая система потока для рыбоводства (см. таблицу материалов). Вода, поддерживаемая сбалансированным pH, солью и щелочью, проходит фильтрацию во время езды на велосипеде для обеспечения чистоты.

  1. Содержание взрослых рыб с помощью следующей стандартной процедуры в системе автоматического цикла (см. Таблицу материалов) с фотопериодом темноты: свет = 10 ч: 14 ч при 28 °C ± 0,5 °C и кормление свежими инкубированными Artemia sp. два раза в день.
  2. Поместите половозрелых взрослых рыбок данио (самец: самка = 2:1) в резервуары со свежей и чистой водой накануне вечером.
  3. Дайте рыбе нереститься на следующее утро (примерно в 8:30 утра) при регулярной световой стимуляции в лаборатории. Через 1-2 ч перенесите рыбок в другой резервуар.
  4. Соберите эмбрионы в воду из системы автоматического цикла в качестве питательной среды в чашке для культивирования с помощью одноразовой пипетки Пастера.

2. Генерация данио-рерио GF от эмбрионов до личинок

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура получения стерильной (GF) рыбы описана на рисунке 1, в то время как основные индексы развития обычных (CR) и GF-моделей представлены на дополнительном рисунке 1. Пожалуйста, выполните шаги, описанные ниже, в настольном шкафу биологической безопасности или вытяжке с ламинарным потоком, используя метод стерильной асептики в чистом помещении.

  1. Промойте эмбрионы водой для рыбоводства и удалите фекалии, примеси и мертвую или неоплодотворенную икру.
  2. Перенесите эмбрионы при 2 hpf в стерилизованные планшеты (до 480 эмбрионов на стерильную чашку диаметром 10 см), заполненные раствором антибиотической стерильной среды данио-рерио (AB-GZM, см. Таблицу материалов) и культивируйте при 28,5 °C в течение 6-8 ч.
    Примечание: AB-GZM используется для обработки эмбрионов в течение нескольких часов для уничтожения поверхностных микроорганизмов, а GZM без антибиотиков используется для последовательного культивирования рыб GF. Обычно совершенное время культивирования составляет 6 ч).
  3. Исключите яйца с белыми пятнами или беловатым внешним видом, а те, которые нормально развиты, с прозрачными и неповрежденными конвертами для дальнейшей обработки.
  4. Промойте эмбрионы с помощью AB-GZM три раза в течение 10 минут.
  5. Замочите эмбрионы в 0,2 г/л раствора повидон-йода (ПВП-I) на 1 мин (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокая концентрация и продолжительность более 2 минут влияют на гибель и скорость вылупления эмбрионов.
  6. Промойте эмбрионы стерильной средой данио-рерио (GZM) три раза в течение 10 минут.
  7. Добавьте эмбрионы в рабочий раствор гипохлорита натрия (NaClO), плотно накройте пробирки микроцентрифуги объемом 50 мл и отбеливайте в течение 15 минут. В течение этого периода подвешивайте эмбрионы в растворе отбеливателя, аккуратно встряхивая их.
  8. Промойте эмбрионы с помощью GZM три раза в течение 10 минут.
  9. Перенесите эмбрионы в стерильные 6-луночные планшеты с 5 эмбрионами и 10 мл GZM на лунку. Культивируйте их на сверхчистой платформе или в инкубаторе с фотопериодом темноты: свет = 10 ч: 14 ч при 28 °C ± 0,5 °C. Плотность культуры будет влиять на стерильность.
  10. Ежедневно обновляйте питательную среду, удаляя отработанный GZM, собирая его в виде образцов для определения стерильного статуса и пополняя каждую лунку одним и тем же объемом стерильного GZM.
  11. Запишите основные индексы развития эмбрионов/личинок GF, включая выживаемость, скорость вылупления, сердцебиение, длину и массу тела и т. д.19.
  12. Переложите рыбу GF в подходящие контейнеры (посуду, колбы для клеточных культур или стеклянные бутылки с крышками) с увеличенным объемом, обеспечивая стерильным кормом на протяжении всего процесса роста.

3. Содержание данио-рерио от личинок до молоди

  1. Возобновить ГЗМ без кормления до 7 dpf и ежедневно выявлять стерильные состояния (см. шаг 5).
  2. Кормите личинок данио рерио от 8 dpf до ювенильных стадий стерильным яичным желтком (10 мкл приготовленного исходного раствора на лунку) один раз в день перед сменой GZM.
  3. Кормите молодь GF от 14 dpf стерилизованным яичным желтком, смешанным с GF Artemia sp. один раз в день (1-3 артемии/личинки, см. шаг 4), постепенно увеличивая кормовую массу по мере роста и развития рыб GF.
  4. Обеспечьте яичным желтком до тех пор, пока все рыбы не смогут употреблять науплии артемии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед применением GF Artemia следует пройти тестирование на стерильность. Оцените количество оставшихся науплиев артемии , понаблюдайте за ходом преследования и отлова, а также исследуйте тело рыбы с потребляемым кормом, чтобы определить успешность кормления.
  5. Начиная с 28 dpf и до ранних взрослых стадий, кормите GF артемию один раз в день (3-5 артемий/личинок) и убирайте нетронутую или мертвую артемию и мертвую рыбу в отходы GZM в качестве ежедневных образцов.
  6. Во время роста рыб GF замените 6-луночные планшеты после 7 dpf на стерильные планшеты или колбы для клеточных культур с 8 до 21 dpf, а затем на стерильные флаконы после 21 dpf. Увеличивайте питательную среду и кормовую массу в соответствии с количеством и весом рыб GF в каждой емкости.
  7. Ежедневно обновляйте GZM и проверяйте образцы, чтобы убедиться в успехе моделей GF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддержание стерильных моделей рыб (GF) до раннего взрослого возраста и половой зрелости является сложной задачей, с низкой средней выживаемостью на уровне 30 dpf, обычно менее 10%. В первую очередь это связано со слабым иммунитетом, задержкой развития, нарушением работы кишечника.

4. Приготовление науплии GF Artemia в качестве стерильного корма для хронических моделей рыб GF

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод культивирования и получения стерильной артемии (GF) описан на рисунке 2. Обратите внимание, что все следующие шаги выполняются в настольном шкафу биологической безопасности с использованием метода стерильной асептики.

  1. Промыть 0,25 г цист артемии , используя 2,4 г/л гипохлорита натрия (NaClO, см. Таблицу материалов) в течение 5 мин.
  2. Промытые цисты артемии отфильтровать стерилизованным сверхплотным фильтром (около 170 меш в отверстии) и трижды промыть стерилизованной сверхчистой водой, каждый раз в течение 1-2 мин.
  3. Переложите промытые цисты артемии в 100 мл 2,5% стерилизованной соленой воды, перемешайте и упакуйте для асептического вывода в соответствии с инструкциями, указанными ниже.
  4. Расфасовать 50 мл обработанного раствора смеси цист артемии в стерильный флакон объемом 100 мл, запечатать пленкой и инкубировать в встряхивающем инкубаторе при 150 об/мин, 30 °С в течение 18–24 ч при освещении.
  5. Извлеките примерно 30 мл науплии вылупившихся артемий из средних и нижних слоев с помощью одноразовой пипетки Пастера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте попадания плавающих яиц и пустой скорлупы в верхний слой. Показатели цист и науплиусов артемии, инкубированных в течение 24 ч, представлены на рисунке 3.
  6. Артемию отфильтровать стерилизующим фильтром и промыть в стерилизующем стакане стерилизующей сверхчистой водой три раза, примерно от 30 с до 1 минуты каждый раз. Наконец, добавьте 4 мл стерилизованной сверхчистой воды, чтобы приготовить смешанный раствор артемии.
  7. С помощью одноразовой пипетки Пастера извлеките активно плавающую артемию из верхнего слоя, промойте и приготовьте раствор науплиусов для кормления и асептической идентификации.

5. Идентификация моделей рыб GF на всех этапах жизни

ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всех этапов жизни стерильных рыб (GF) ключевые показатели и ежедневное обнаружение образцов имеют решающее значение для обеспечения успеха моделей. На этом этапе обобщена общая классификация образцов и обычные методы идентификации (рис. 4).

  1. Ежедневно наблюдайте и подсчитывайте статус выживаемости и скорость личинки данио-рерио GF. В экспериментах по расчету соответствующих норм рыба GF выращивается в 24- или 48-луночных планшетах по одной рыбе в лунке.
    1. Выживаемость = (количество живой рыбы на момент наблюдения/общее количество икринок) × 100%.
    2. Коэффициент стерильности = (количество стерильных рыб/количество выживших рыб) × 100%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол фокусируется на стерильности живой рыбы. Количество стерильных рыб определяется путем подсчета успешных рыб GF после многократных проверок среди живой рыбы. Любая мертвая рыба или живая рыба, модели GF, которые вышли из строя из-за присутствия бактерий, устраняются во время последующих процедур GF.
  2. Соберите следующие образцы личинок данио-рерио GF.
    1. Питательная среда GF данио-рерио из каждой лунки или бутылочного контейнера.
    2. Корм для рыб, например, стерильный яичный желток и ГФ артемия.
    3. Отработанная среда, включая фрагменты оболочки яйца после вылупления и остатки пищи или фекалии в периоды кормления от личинок до молоди рыб.
    4. Образцы мертвой рыбы для выявления наличия бактерий.
    5. Рыбная среда и средства, используемые при лечении эмбрионов в качестве стерильного контроля.
    6. Образцы материалов, операционной платформы, инкубатора и т.д.
  3. Обнаруживайте образцы, собираемые ежедневно, с помощью нескольких методов.
    1. Сначала используйте метод разбрасывающих пластин и планшеты для культивирования в инкубаторе при 30 °C.
      1. Покрыть 20-50 мкл образца отработанной среды на планшете Trypticase Soy Agar (TSA) (см. Таблицу материалов) в аэробных условиях.
      2. Покрытие 20-50 мкл образца отработанной среды на планшете TSA в анаэробных условиях.
      3. Покрыть 20-50 мкл образца отработанной среды на кровяных планшетах TSA (см. Таблицу материалов) в аэробных условиях.
      4. Покрыть 20-50 мкл образца отработанной среды на кровяных планшетах TSA в анаэробных условиях.
    2. Во-вторых, используйте метод жидкой культуры.
      1. Возьмите 200 μл образца в аэробные пробирки со средой для инфузионного бульона для мозгового сердца (BHI) (см. Таблицу материалов) и заквашивайте в встряхивающем инкубаторе при 30 °C, 150-180 об/мин.
      2. Добавьте 200 мкл образца в анаэробные пробирки со средой BHI и заквашивайте в инкубаторе при 30 °C.
      3. Добавьте 200 μл образца в аэробные пробирки со средой Trypticase Soy Brath (TSB), затем культивируйте в встряхивающем инкубаторе при 30 °C, 150-180 об/мин.
      4. Добавьте 200 μл образца в анаэробные пробирки со средой TSB и культурой в инкубаторе при 30 °C.
    3. В-третьих, используйте молекулярные методы — анализ полимеразной цепной реакции (ПЦР) 16s.
      1. Проведите анализ пробы сточных вод с помощью двух пар грунтовок 27F и 1492R, а также 63F и 1387R (табл. 1).
        Мастер-смесь для ПЦР готовили в соответствии с таблицей 2 с использованием коммерчески доступного набора ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалов), а ПЦР-машину настраивали с программой, указанной в таблице 3.
      2. После завершения программы ПЦР исследуют продукты с помощью электрофореза40 с помощью 1% агарозного геля в целевых полосах 1465.о. (с использованием праймеров 27F и 1492R) или 1324.о. (с использованием праймеров 63F и 1387R), чтобы сделать вывод о стерильности образцов.
  4. Регистрация и наблюдение за тестами на стерильность, включая посев в планшетах и среде в период от 24 ч до 3 дней и 7 дней, в течение которых отсутствие колоний на планшетах и помутнение в жидкости указывают на успешное построение моделей GF. Наблюдайте и записывайте табличку и медиум в 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 120 ч, 144 ч и 168 ч.

6. Идентификация образцов артемии перед кормлением рыбами

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обнаружить образцы GF Artemia , которые незаменимы в качестве живого корма перед кормлением рыбами GF (Рисунок 4), выполните следующие действия.

  1. Соберите образцы моделей GF Artemia .
    1. Нелеченные кисты артемии .
    2. Лечил кисты артемии GF.
    3. Вылупившаяся GF Artemia nauplii.
    4. Стерилизованная сверхчистая вода в качестве контроля.
  2. Выявить ГФ артемию можно следующими методами.
    1. Используйте метод распростертых пластин для обнаружения образцов путем нанесения их на планшеты TSA и планшеты TSA для крови в аэробных и анаэробных условиях. Инкубируют их при 30 °C.
    2. Используйте жидкую среду для обнаружения образцов в аэробных и анаэробных пробирках TSB и BHI. Культивирование в шейке при 150-180 об/мин, 30 °C.
    3. Используйте ПЦР-анализ для выявления присутствия бактерий в образцах, собранных с использованием праймеров-мишеней 16s рибосомной РНК генов 27F и 1492R, 63F и 1387R (табл. 1). Объем и программа показаны в таблицах 2 и 3.
  3. Запишите результаты: Определите продукт ПЦР с помощью 1% электрофореза в агарозном геле40 для целевых полос размером 1465.о. (с использованием праймеров 27F и 1492R) или 1324.о. (с использованием праймеров 63F и 1387R). Результаты планшетов и жидкой среды могут обеспечить стерильный статус GF Artemia перед использованием в качестве корма для рыб.

7. Выделение и идентификация штаммов кишечных бактерий у рыбок данио

ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения функций кишечника in vitro и in vivo необходимо выделить штаммы бактерий из рыбок данио, которые также являются видовым источником потенциальных пробиотиков, проверенных на инфекцию с использованием животных GF (Рисунок 5). В этом протоколе мы описываем традиционный метод вскрытия для получения содержимого кишечника, в то время как образцы также могут быть собраны непосредственно у живых рыб, находящихся под наркозом (данные не показаны).

  1. Выберите здоровых взрослых рыбок данио и промойте их стерильной водой. Выполните следующие действия на чистом стенде.
  2. Обезболивают рыбу 100 мг/л MS-222 в течение 5-10 мин.
  3. Используйте 75% спирт для обработки поверхности тела рыбы.
  4. Вскрыть кишечник рыбы и выдавить содержимое кишечника средой TSB или BHI.
  5. Инкубируйте кишечную надосадочную жидкость путем применения TSA, кровяной пластины, TSB и среды BHI в аэробных и анаэробных условиях.
  6. Транслируйте бактерии, чтобы получить сигнальный штамм и записать характеристики различных колоний.
  7. Храните бактерии в пределах 30% глицерина при -80 °C.
  8. Затем определите кишечные бактерии с помощью экстракции геномной ДНК и секвенирования ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Основные этапы экстракции бактериальной геномной ДНК включают центрифугирование жидкости, диссоциацию РНКазы А и протеазы К, экстракцию этилового спирта, промывку и растворение с использованием коммерчески доступных наборов в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
  9. Проанализируйте последовательности 16S с помощью Национального центра биотехнологической информации (NCBI) и Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) с базой данных Bacteria and Archaea40,41 (см. Таблицу материалов).
  10. Выберите наиболее подходящие бактерии и признаки, чтобы идентифицировать выделенные кишечные штаммы на уровне рода.
  11. Определите метаболические функции бактериальных штаммов с помощью коммерчески доступных наборов (см. Таблицу материалов).

8. Маркировка гриппом, инфекция и колонизация бактерий в кишечнике данио-рерио

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед заражением GF данио-рерио выделенные бактерии были модифицированы красителями и подсчитаны, что сделало микробную колонизацию и миграцию видимыми непрерывно и in vivo (Рисунок 6).

  1. Выберите потенциально полезные бактерии или доминирующие штаммы с высокой численностью в организме хозяина, чтобы заразить модели рыб GF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались бактерии Aeromonas sp. и Vibrio sp. (см. Таблицу материалов), отобранные из 8 родов, которые были выделены и идентифицированы у взрослых рыбок данио дикого типа в лаборатории42.
  2. Пометьте свежие бактерии красителями CM-Dil (см. Таблицу материалов) и подвергните их воздействию GF данио-рерио при концентрации 5 dpf с концентрацией 106-10 8 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл.
  3. Наблюдайте за флуоресценцией под флуоресцентным микроскопом с увеличением 3×, чтобы показать колонизацию и распространение бактерий в кишечнике личинок данио-рерио от 6 dpf до 14 dpf.
  4. Вручную подсчитайте количество бактерий в рыбе GF по культуре тарелки в каждый момент времени.
  5. Обнаружение колоний и последовательностей, чтобы убедиться, что инфекция была успешной с целевыми бактериальными штаммами.
  6. Собрать образцы рыб с бактериальной инфекцией для последующих анализов, включая нейроповедение, индексы развития, гистопатологический анализ, гормональные измерения и т. д. 43,44,45.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бактерии, используемые в эксперименте с инфекцией, должны быть заново извлечены и свежекультивированы в жидкой среде.

Результаты

Модели GF данио рерио могут быть эффективно получены за счет использования обильной икры, отнерестящейся парами рыбок данио, с протоколом, оптимизированным на основе предыдущих моделей рыб GF35. Один 6-луночный планшет может культивировать примерно 30-48 эмбрионов/личинок, что ...

Обсуждение

Важнейшие этапы в рамках протоколов приготовления рыбы и пищи для ГФ
Во время создания моделей рыб GF было задействовано несколько важных этапов, включая подготовку стерильных материалов, стерилизацию эмбрионов, ежедневное обновление GZM, сбор различных образцов и стерильное...

Раскрытие информации

Протокол GF Artemia был выдан в качестве патента Национальным управлением интеллектуальной собственности Китая, которое освободит от ограничения использования метода после получения разрешения авторов. Авторы заявляют, что у них нет других конкурирующих или финансовых интересов.

Благодарности

Мы искренне благодарим за поддержку Проект талантов Чунцинского медицинского университета (No R4014 для DSP и R4020 для PPJ), Национальный фонд естественных наук Китая (NSFC, No 32200386 для PPJ), Студию наставников по инновациям в постдокторантуре Чунцина (X7928 DSP) и Программу Китайско-Шри-Ланкийского совместного центра исследований и демонстрации водных технологий Китайской академии наук (CAS) / Китайско-шри-ланкийского совместного центра образования и исследований CAS.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AB-GZMAmphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.Amphotericin:CAS:1397-89-3;
kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.		49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubesbiosharpBS-15-MTo collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well platesLABSELECT 11112To culture fish
AeronomasNCBI databaseNo.MK1784992019-JPP-ESN
Anaerobic TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work stationGENE SCIENCEE200GBacterial isolation, sterile testing
AnalysisGraphPad Prism 5v6.07To analysis the data
API 20 E kits BioMerieux SA, FranceNo.1005915090Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)Shangjia Aquarium Co., Ltd.Aquamaster brandArtemia cysts, and brine shrimp eggs 
Auto cycle system for fish cultureNingbo Hairui Technology Co., LtdNo CatMaintain the fish
AutoclaveZeal WayG154DWSPrepare the materials
BHI AerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI AnaerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubatorLongYue Co., LtdSPXFor fish and plates
Biosafety cabinetHaierHR40-IIA2Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood platessheep blood:SolarbioCat. NO. TX0030Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flaskCorning430639To culture fish
CM-Dil dyesMolecular ProbesCat#C7000  To label the bacteria
Constant temperature shaking incubatorPeiving Co., LtdHZQ-X100Bacterial culture
DatabaseNCBIBacteria and Archaea databaseLink: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipettebiosharpbs-xh-03lUsed to change water, and transfer eggs
Disposable petri dishbiosharpBS-90-DTo culture fish
DNA kitsSolaribioCat#D1600Bacterial genomic DNA extraction kits 
Electric pipetteSCILOGEXLevo meChange water
ExiguobacteriumNCBI databaseNo.MK1785042019-JPP-ESN
GZMSea salt:LANDEBAO Co., Ltd.No CatComposed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water systemHitech Co., LtdPrima-S15Prepare the agents
MicroscopeNikonSMZ18With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kitsTIANGENCat#ET101Taq DNA Polymerase kit
PipetteLABSELECT sp-013-10Change water
Povidone iodine (PVP-I)AladdinLot#H1217005Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converterPinYi Co., LtdAL-06To regulate the light
TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbenchAirtechSW-CJ-2FDSterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish cultureMarine Biological Equipment companyNo CatProduce water for fish
VibrioNCBI databaseNo.MK1785012019-JPP-ESN

Ссылки

  1. Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
  2. Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol. 11 (4), 227-238 (2013).
  3. Kim, S., Jazwinski, S. M. The gut microbiota and healthy aging: A mini-review. Gerontology. 64 (6), 513-520 (2018).
  4. Milani, C., et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol Mol Biol Rev. 81 (4), e00036 (2017).
  5. De Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: Mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  6. Shi, N., Li, N., Duan, X., Niu, H. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system. Mil Med Res. 4 (1), 14 (2017).
  7. Liu, B. N., Liu, X. T., Liang, Z. H., Wang, J. H. Gut microbiota in obesity. World J Gastroenterol. 27 (25), 3837-3850 (2021).
  8. Aron-Wisnewsky, J., Warmbrunn, M. V., Nieuwdorp, M., Clément, K. Metabolism and metabolic disorders and the microbiome: The intestinal microbiota associated with obesity, lipid metabolism, and metabolic health-pathophysiology and therapeutic strategies. Gastroenterology. 160 (2), 573-599 (2021).
  9. Chen, Y. W., Zhou, J. H., Wang, L. Role and mechanism of gut microbiota in human disease. Front Cell Infect Microbiol. 11, 625913 (2021).
  10. Hao, W. Z., Li, X. J., Zhang, P. W., Chen, J. X. A review of antibiotics, depression, and the gut microbiome. Psychiatry Res. 284, 112691 (2020).
  11. Nadal, A. L., et al. gut immunity: Using the zebrafish model to understand fish health. Front Immunol. 11, 114 (2020).
  12. Asadi, A., et al. Obesity and gut-microbiota-brain axis: A narrative review. J Clin Lab Anal. 36 (5), e24420 (2022).
  13. Mlynarska, E., et al. The role of the microbiome-brain-gut axis in the pathogenesis of depressive disorder. Nutrients. 14 (9), 1921 (2022).
  14. Yu, Y. J., Raka, F., Adeli, K. The role of the gut microbiota in lipid and lipoprotein metabolism. J Clin Med. 8 (12), 2227 (2019).
  15. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. J Microbiol Biotechnol. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  16. Melancon, E., et al. Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol. 138, 61-100 (2017).
  17. Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods Mol Biol. 1438, 123-135 (2016).
  18. Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
  19. Jia, P. P., et al. Role of germ-free animal models in understanding interactions of gut microbiota to host and environmental health: A special reference to zebrafish. Environ Pollut. 279, 116925 (2021).
  20. Gootenberg, D. B., Turnbaugh, P. J. Companion animals symposium: Humanized animal models of the microbiome. J Anim Sci. 89 (5), 1531-1537 (2011).
  21. Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
  22. Kamareddine, L., Najjar, H., Sohail, M. U., Abdulkader, H., Al-Asmakh, M. The microbiota and gut-related disorders: Insights from animal models. Cells. 9 (11), 2401 (2020).
  23. Rogala, A. R., Oka, A., Sartor, R. B. Strategies to dissect host-microbial immune interactions that determine mucosal homeostasis vs. Intestinal inflammation in gnotobiotic mice. Front Immunol. 11, 214 (2020).
  24. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4596-4601 (2004).
  25. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev Biol. 297 (2), 374-386 (2006).
  26. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  27. Xia, H., et al. Zebrafish: An efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota. Mol Med. 28 (1), 161 (2022).
  28. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat Protoc. 3 (12), 1862-1875 (2008).
  30. Shan, Y., et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes. Front Microbiol. 6, 373 (2015).
  31. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. A. Zebrafish axenic larvae colonization with human intestinal microbiota. Zebrafish. 15 (2), 96-106 (2018).
  32. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  33. Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
  34. Nascimento, M. D., Schorer, M., Dos Santos, J. C. E., Rocha, M. S. A., Pedreira, M. M. Live and frozen Artemia nauplii for catfish (steindachner, 1876) larvae in different salinities. Trop Anim Health Prod. 52 (2), 653-659 (2020).
  35. Jia, P. P., et al. Breaking the mold: The first report on germ-free adult marine medaka (oryzias melastigma) models. bioRxiv. , (2023).
  36. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. JoVE. (69), e4196 (2012).
  37. Wilson, C. Aspects of larval rearing. ILAR J. 53 (2), 169-178 (2012).
  38. Aleström, P. a. -. O., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  39. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. , (2002).
  40. Nursyirwani, N., et al. Phenotype and genotype of lactic acid bacteria (lab) isolated from the tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus alimentary tract. F1000Res. 6, 1984 (2017).
  41. Karolenko, C., Desilva, U., Muriana, P. M. Microbial profiling of biltong processing using culture-dependent and culture-independent microbiome analysis. Foods. 12 (4), 844 (2023).
  42. Jia, P. P., et al. Chronic exposure to graphene oxide (go) induced inflammation and differentially disturbed the intestinal microbiota in zebrafish. Environ Sci Nano. 6 (8), 2452-2469 (2019).
  43. Sun, B. L., et al. Probiotic supplementation mitigates the developmental toxicity of perfluorobutanesulfonate in zebrafish larvae. Sci Total Environ. 799, 149458 (2021).
  44. Qian, H. F., Liu, G. F., Lu, T., Sun, L. W. Developmental neurotoxicity of microcystis aeruginosa in the early life stages of zebrafish. Ecotoxicol Environ Saf. 151, 35-41 (2018).
  45. Bertotto, L. B., Catron, T. R., Tal, T. Exploring interactions between xenobiotics, microbiota, and neurotoxicity in zebrafish. Neurotoxicology. 76, 235-244 (2020).
  46. Jia, P. P., et al. Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (7-8), 2039-2059 (2023).
  47. Xin, G. Y., et al. Gut bacteria vibrio sp. And aeromonas sp. Trigger the expression levels of proinflammatory cytokine: First evidence from the germ-free zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 106, 518-525 (2020).
  48. Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109 (2023).
  49. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  50. Rolig, A. S., Parthasarathy, R., Burns, A. R., Bohannan, B. J. M., Guillemin, K. Individual members of the microbiota disproportionately modulate host innate immune responses. Cell Host Microbe. 18 (5), 613-620 (2015).
  51. Stressmann, F. A., et al. Mining zebrafish microbiota reveals key community-level resistance against fish pathogen infection. ISME J. 15 (3), 702-719 (2021).
  52. Guitton, E., et al. Production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies. JoVE. (160), e61148 (2020).
  53. Rea, V., Bell, I., Ball, T., Van Raay, T. Gut-derived metabolites influence neurodevelopmental gene expression and wnt signaling events in a germ-free zebrafish model. Microbiome. 10 (1), 132 (2022).
  54. Russo, P., et al. Zebrafish gut colonization by mcherry-labelled lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3479-3490 (2015).
  55. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Ley, R. E., Gordon, J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 127 (2), 423-433 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE206GF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены