Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе изложены основные шаги по получению стерильных эмбрионов рыб (GF) и поддержанию их от личинок до ювенильной стадии, включая отбор проб и определение их стерильного статуса. Использование моделей GF с инфекцией важно для понимания роли микробов в здоровье хозяина.

Аннотация

Рыбки данио служат ценными моделями для исследований роста, иммунитета и микробиоты кишечника из-за их геномного сходства с млекопитающими, прозрачных эмбрионов, развивающихся в относительно чистой среде хориона, и чрезвычайно быстрого развития личинок по сравнению с моделями грызунов. Стерильные (GF) данио-рерио (Danio rerio) имеют решающее значение для оценки токсичности загрязняющих веществ и создания моделей заболеваний, подобных человеческим, связанных с микробными функциями. По сравнению с моделями, выращенными традиционным способом (CR) (рыбы в общем хозяйстве), рыбки данио-рерио GF позволяют более точно манипулировать микробиотой хозяина, помогая определить причинно-следственную связь между микроорганизмами и хозяевами. Следовательно, они играют решающую роль в продвижении нашего понимания этих отношений. Тем не менее, модели рыбок данио-рерио GF обычно создаются и исследуются на ранних стадиях жизни (от эмбрионов до личинок) из-за ограничений иммунной функции и усвоения питательных веществ. Это исследование оптимизирует создание, поддержание и идентификацию ранних моделей рыбок данио рерио без кормления и с длительным кормлением с использованием корма GF (например, Artemia sp., артемия, артемия). На протяжении всего процесса выполнялся ежедневный отбор проб и бактериологическое исследование, которые были идентифицированы с помощью нескольких обнаружений, включая секвенирование планшетов и 16S рРНК. Для обеспечения качества и количества сгенерированных моделей были зарегистрированы показатели асептической скорости, выживаемости и развития рыбок данио-рерио. Важно отметить, что это исследование предоставляет подробную информацию о бактериальной изоляции и методах заражения рыб GF, что позволяет эффективно создавать модели рыб GF от личинок до молодых стадий с пищевой поддержкой GF. Применяя эти процедуры в биомедицинских исследованиях, ученые могут лучше понять взаимосвязь между бактериальными функциями кишечника и здоровьем хозяина.

Введение

Микробиота (т. е. археи, бактерии, эукария и вирусы) играет решающую роль в поддержании здоровья хозяина и способствует развитию различных заболеваний, влияя на физиологические и патологические процессы посредством симбиотических взаимодействий в кишечном барьере, эпителиальной поверхности и функциях муцина у людей 1,2,3. Состав микробиоты на разных этапах жизни, от младенчества до юности, взрослого возраста и старения, а также ее присутствие в различных местах, таких как ноздри, полость рта, кожа и кишечник, динамически формируется различными среда....

протокол

Эксперименты с рыбами проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и их использованию г. Чунцин и Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Чунцинского медицинского университета, Китай, а также стандартами для экспериментальных животных, выпущенными Государственным бюро качества и технического надзора (идентификационный номер одобрения: GB14922-2001 г. - GBT14927-2001 г.). Данио-рерио (Danio rerio, дикий тип, штамм AB) были получены из Института гидробиологии Китайской академии наук и содержались в лаборатории в соответствии с ранее описанными процедурами36.

Результаты

Модели GF данио рерио могут быть эффективно получены за счет использования обильной икры, отнерестящейся парами рыбок данио, с протоколом, оптимизированным на основе предыдущих моделей рыб GF35. Один 6-луночный планшет может культивировать примерно 30-48 эмбрионов/личинок, что .......

Обсуждение

Важнейшие этапы в рамках протоколов приготовления рыбы и пищи для ГФ
Во время создания моделей рыб GF было задействовано несколько важных этапов, включая подготовку стерильных материалов, стерилизацию эмбрионов, ежедневное обновление GZM, сбор различных образцов и стерильное.......

Раскрытие информации

Протокол GF Artemia был выдан в качестве патента Национальным управлением интеллектуальной собственности Китая, которое освободит от ограничения использования метода после получения разрешения авторов. Авторы заявляют, что у них нет других конкурирующих или финансовых интересов.

Благодарности

Мы искренне благодарим за поддержку Проект талантов Чунцинского медицинского университета (No R4014 для DSP и R4020 для PPJ), Национальный фонд естественных наук Китая (NSFC, No 32200386 для PPJ), Студию наставников по инновациям в постдокторантуре Чунцина (X7928 DSP) и Программу Китайско-Шри-Ланкийского совместного центра исследований и демонстрации водных технологий Китайской академии наук (CAS) / Китайско-шри-ланкийского совместного центра образования и исследований CAS.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AB-GZMAmphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.Amphotericin:CAS:1397-89-3;
kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubesbiosharpBS-15-MTo collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well platesLABSELECT 11112To culture fish
AeronomasNCBI databaseNo.MK1784992019-JPP-ESN
Anaerobic TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work stationGENE SCIENCEE200GBacterial isolation, sterile testing
AnalysisGraphPad Prism 5v6.07To analysis the data
API 20 E kits BioMerieux SA, FranceNo.1005915090Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)Shangjia Aquarium Co., Ltd.Aquamaster brandArtemia cysts, and brine shrimp eggs 
Auto cycle system for fish cultureNingbo Hairui Technology Co., LtdNo CatMaintain the fish
AutoclaveZeal WayG154DWSPrepare the materials
BHI AerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI AnaerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubatorLongYue Co., LtdSPXFor fish and plates
Biosafety cabinetHaierHR40-IIA2Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood platessheep blood:SolarbioCat. NO. TX0030Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flaskCorning430639To culture fish
CM-Dil dyesMolecular ProbesCat#C7000  To label the bacteria
Constant temperature shaking incubatorPeiving Co., LtdHZQ-X100Bacterial culture
DatabaseNCBIBacteria and Archaea databaseLink: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipettebiosharpbs-xh-03lUsed to change water, and transfer eggs
Disposable petri dishbiosharpBS-90-DTo culture fish
DNA kitsSolaribioCat#D1600Bacterial genomic DNA extraction kits 
Electric pipetteSCILOGEXLevo meChange water
ExiguobacteriumNCBI databaseNo.MK1785042019-JPP-ESN
GZMSea salt:LANDEBAO Co., Ltd.No CatComposed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water systemHitech Co., LtdPrima-S15Prepare the agents
MicroscopeNikonSMZ18With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kitsTIANGENCat#ET101Taq DNA Polymerase kit
PipetteLABSELECT sp-013-10Change water
Povidone iodine (PVP-I)AladdinLot#H1217005Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converterPinYi Co., LtdAL-06To regulate the light
TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbenchAirtechSW-CJ-2FDSterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish cultureMarine Biological Equipment companyNo CatProduce water for fish
VibrioNCBI databaseNo.MK1785012019-JPP-ESN

Ссылки

  1. Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
  2. Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host de....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE206GF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены