Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В этом протоколе изложены основные шаги по получению стерильных эмбрионов рыб (GF) и поддержанию их от личинок до ювенильной стадии, включая отбор проб и определение их стерильного статуса. Использование моделей GF с инфекцией важно для понимания роли микробов в здоровье хозяина.
Рыбки данио служат ценными моделями для исследований роста, иммунитета и микробиоты кишечника из-за их геномного сходства с млекопитающими, прозрачных эмбрионов, развивающихся в относительно чистой среде хориона, и чрезвычайно быстрого развития личинок по сравнению с моделями грызунов. Стерильные (GF) данио-рерио (Danio rerio) имеют решающее значение для оценки токсичности загрязняющих веществ и создания моделей заболеваний, подобных человеческим, связанных с микробными функциями. По сравнению с моделями, выращенными традиционным способом (CR) (рыбы в общем хозяйстве), рыбки данио-рерио GF позволяют более точно манипулировать микробиотой хозяина, помогая определить причинно-следственную связь между микроорганизмами и хозяевами. Следовательно, они играют решающую роль в продвижении нашего понимания этих отношений. Тем не менее, модели рыбок данио-рерио GF обычно создаются и исследуются на ранних стадиях жизни (от эмбрионов до личинок) из-за ограничений иммунной функции и усвоения питательных веществ. Это исследование оптимизирует создание, поддержание и идентификацию ранних моделей рыбок данио рерио без кормления и с длительным кормлением с использованием корма GF (например, Artemia sp., артемия, артемия). На протяжении всего процесса выполнялся ежедневный отбор проб и бактериологическое исследование, которые были идентифицированы с помощью нескольких обнаружений, включая секвенирование планшетов и 16S рРНК. Для обеспечения качества и количества сгенерированных моделей были зарегистрированы показатели асептической скорости, выживаемости и развития рыбок данио-рерио. Важно отметить, что это исследование предоставляет подробную информацию о бактериальной изоляции и методах заражения рыб GF, что позволяет эффективно создавать модели рыб GF от личинок до молодых стадий с пищевой поддержкой GF. Применяя эти процедуры в биомедицинских исследованиях, ученые могут лучше понять взаимосвязь между бактериальными функциями кишечника и здоровьем хозяина.
Микробиота (т. е. археи, бактерии, эукария и вирусы) играет решающую роль в поддержании здоровья хозяина и способствует развитию различных заболеваний, влияя на физиологические и патологические процессы посредством симбиотических взаимодействий в кишечном барьере, эпителиальной поверхности и функциях муцина у людей 1,2,3. Состав микробиоты на разных этапах жизни, от младенчества до юности, взрослого возраста и старения, а также ее присутствие в различных местах, таких как ноздри, полость рта, кожа и кишечник, динамически формируется различными среда....
Эксперименты с рыбами проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за животными и их использованию г. Чунцин и Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Чунцинского медицинского университета, Китай, а также стандартами для экспериментальных животных, выпущенными Государственным бюро качества и технического надзора (идентификационный номер одобрения: GB14922-2001 г. - GBT14927-2001 г.). Данио-рерио (Danio rerio, дикий тип, штамм AB) были получены из Института гидробиологии Китайской академии наук и содержались в лаборатории в соответствии с ранее описанными процедурами36.
Модели GF данио рерио могут быть эффективно получены за счет использования обильной икры, отнерестящейся парами рыбок данио, с протоколом, оптимизированным на основе предыдущих моделей рыб GF35. Один 6-луночный планшет может культивировать примерно 30-48 эмбрионов/личинок, что .......
Важнейшие этапы в рамках протоколов приготовления рыбы и пищи для ГФ
Во время создания моделей рыб GF было задействовано несколько важных этапов, включая подготовку стерильных материалов, стерилизацию эмбрионов, ежедневное обновление GZM, сбор различных образцов и стерильное.......
Протокол GF Artemia был выдан в качестве патента Национальным управлением интеллектуальной собственности Китая, которое освободит от ограничения использования метода после получения разрешения авторов. Авторы заявляют, что у них нет других конкурирующих или финансовых интересов.
Мы искренне благодарим за поддержку Проект талантов Чунцинского медицинского университета (No R4014 для DSP и R4020 для PPJ), Национальный фонд естественных наук Китая (NSFC, No 32200386 для PPJ), Студию наставников по инновациям в постдокторантуре Чунцина (X7928 DSP) и Программу Китайско-Шри-Ланкийского совместного центра исследований и демонстрации водных технологий Китайской академии наук (CAS) / Китайско-шри-ланкийского совместного центра образования и исследований CAS.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. | 49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. | The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. | TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; | TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; | tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; | TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены