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Resumo

Este protocolo descreve as etapas primárias para obter embriões de peixes livres de germes (GF) e mantê-los desde as larvas até o estágio juvenil, incluindo amostragem e detecção de seu status estéril. O uso de modelos de GF com infecção é importante para entender o papel dos micróbios na saúde do hospedeiro.

Resumo

O peixe-zebra serve como modelos valiosos para pesquisas sobre crescimento, imunidade e microbiota intestinal devido às suas semelhanças genômicas com mamíferos, embriões transparentes desenvolvidos em um ambiente córion relativamente limpo e desenvolvimento extremamente rápido de larvas em comparação com modelos de roedores. O peixe-zebra livre de germes (GF) (Danio rerio) é crucial para avaliar a toxicidade de poluentes e estabelecer modelos de doenças semelhantes às humanas relacionadas às funções microbianas. Em comparação com os modelos criados convencionalmente (CR) (peixes em criação comum), o peixe-zebra GF permite uma manipulação mais precisa da microbiota do hospedeiro, auxiliando na determinação da relação causal entre microrganismos e hospedeiros. Consequentemente, eles desempenham um papel crítico no avanço de nossa compreensão dessas relações. No entanto, os modelos de peixe-zebra GF são normalmente gerados e pesquisados durante os estágios iniciais da vida (de embriões a larvas) devido a limitações na função imunológica e absorção de nutrientes. Este estudo otimiza a geração, manutenção e identificação de modelos iniciais de peixe-zebra GF sem alimentação e com alimentação de longo prazo usando alimentos GF (como Artemia sp., artêmia). Ao longo do processo, amostragem e cultura diárias foram realizadas e identificadas por meio de múltiplas detecções, incluindo placas e sequenciamento de rRNA 16S. A taxa asséptica, a sobrevivência e os índices de desenvolvimento do peixe-zebra GF foram registrados para garantir a qualidade e a quantidade dos modelos gerados. É importante ressaltar que este estudo fornece detalhes sobre técnicas de isolamento bacteriano e infecção para peixes GF, permitindo a criação eficiente de modelos de peixes GF desde larvas até estágios juvenis com suporte alimentar GF. Ao aplicar esses procedimentos em pesquisas biomédicas, os cientistas podem entender melhor as relações entre as funções bacterianas intestinais e a saúde do hospedeiro.

Introdução

A microbiota (ou seja, Archaea, Bacteria, Eukarya e vírus) desempenha papéis cruciais na manutenção da saúde do hospedeiro e contribui para o desenvolvimento de várias doenças, influenciando processos fisiológicos e patológicos por meio de interações simbióticas dentro da barreira intestinal, superfície epitelial e funções de mucina em indivíduos 1,2,3. A composição da microbiota em diferentes fases da vida, desde a infância até a juventude, idade adulta e envelhecimento, bem como sua presença em vários locais, como narinas, locais orais, cutâneos e....

Protocolo

Os experimentos com peixes foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais de Chongqing e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Chongqing, China, bem como os padrões para animais experimentais emitidos pelo Departamento Estadual de Qualidade e Supervisão Técnica (ID de aprovação: GB14922-2001 a GBT14927-2001). O peixe-zebra (Danio rerio, tipo selvagem, cepa AB) foi obtido no Instituto de Hidrobiologia da Academia Chinesa de Ciências e mantido em laboratório seguindo procedimentos relatados anteriormente36.

1. Manutenção do pei....

Resultados Representativos

Os modelos de peixe-zebra GF podem ser produzidos de forma eficiente utilizando os ovos abundantes gerados por pares de peixes-zebra, com o protocolo otimizado com base em modelos anteriores de peixes GF35. Uma única placa de 6 poços pode cultivar aproximadamente 30-48 embriões/larvas, permitindo ampla coleta de dados e análise estatística. Após o tratamento estéril, os embriões GF são cultivados em uma incubadora limpa até a eclosão das larvas em 48-72 h, e trocados GZM diariamente com.......

Discussão

Etapas críticas dentro dos protocolos de preparação de peixes e alimentos GF
Durante a geração de modelos de peixes GF, várias etapas críticas foram envolvidas, incluindo a preparação de materiais estéreis, esterilização de embriões, renovação diária de GZM, coleta de várias amostras e o exame estéril de cada amostra usando vários métodos. Dentre essas etapas, o tratamento inicial dos embriões é fundamental e decisivo para o sucesso dos modelos GF. Os agentes de controle, suas co.......

Divulgações

O protocolo da GF Artemia foi concedido como patente pela Administração Nacional de Propriedade Intelectual da China, o que aliviará o uso restrito do método após obter a permissão dos autores. Os autores declaram que não têm outros interesses concorrentes ou financeiros.

Agradecimentos

Agradecemos sinceramente o apoio do Projeto de Talentos da Universidade Médica de Chongqing (nº R4014 para DSP e R4020 para PPJ), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC, nº 32200386 para PPJ), Estúdio de Mentores de Inovação de Pós-Doutorado de Chongqing (X7928 DSP) e Programa do Centro Conjunto China-Sri Lanka para Pesquisa e Demonstração de Tecnologia da Água pela Academia Chinesa de Ciências (CAS)/Centro Conjunto China-Sri Lanka para Educação e Pesquisa pelo CAS.

....

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AB-GZMAmphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.Amphotericin:CAS:1397-89-3;
kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubesbiosharpBS-15-MTo collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well platesLABSELECT 11112To culture fish
AeronomasNCBI databaseNo.MK1784992019-JPP-ESN
Anaerobic TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work stationGENE SCIENCEE200GBacterial isolation, sterile testing
AnalysisGraphPad Prism 5v6.07To analysis the data
API 20 E kits BioMerieux SA, FranceNo.1005915090Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp)Shangjia Aquarium Co., Ltd.Aquamaster brandArtemia cysts, and brine shrimp eggs 
Auto cycle system for fish cultureNingbo Hairui Technology Co., LtdNo CatMaintain the fish
AutoclaveZeal WayG154DWSPrepare the materials
BHI AerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI AnaerobicCoolaberCat#PM0640BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubatorLongYue Co., LtdSPXFor fish and plates
Biosafety cabinetHaierHR40-IIA2Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClOXILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.CAS: 7681-52-9Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood platessheep blood:SolarbioCat. NO. TX0030Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flaskCorning430639To culture fish
CM-Dil dyesMolecular ProbesCat#C7000  To label the bacteria
Constant temperature shaking incubatorPeiving Co., LtdHZQ-X100Bacterial culture
DatabaseNCBIBacteria and Archaea databaseLink: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipettebiosharpbs-xh-03lUsed to change water, and transfer eggs
Disposable petri dishbiosharpBS-90-DTo culture fish
DNA kitsSolaribioCat#D1600Bacterial genomic DNA extraction kits 
Electric pipetteSCILOGEXLevo meChange water
ExiguobacteriumNCBI databaseNo.MK1785042019-JPP-ESN
GZMSea salt:LANDEBAO Co., Ltd.No CatComposed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water systemHitech Co., LtdPrima-S15Prepare the agents
MicroscopeNikonSMZ18With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kitsTIANGENCat#ET101Taq DNA Polymerase kit
PipetteLABSELECT sp-013-10Change water
Povidone iodine (PVP-I)AladdinLot#H1217005Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converterPinYi Co., LtdAL-06To regulate the light
TSA platestryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobictryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbenchAirtechSW-CJ-2FDSterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish cultureMarine Biological Equipment companyNo CatProduce water for fish
VibrioNCBI databaseNo.MK1785012019-JPP-ESN

Referências

  1. Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
  2. Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host de....

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