Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصوير الرئة اليسرى للفأر المزروع باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. يمثل هذا أداة قيمة لدراسة الديناميات الخلوية والتفاعلات في الوقت الفعلي بعد زرع رئة الفئران.

Abstract

ترتبط المضاعفات بعد زراعة الرئة إلى حد كبير باستجابة الجهاز المناعي المضيف للطعم. يتم تنظيم هذه الاستجابات المناعية عن طريق الحديث المتبادل بين الخلايا المانحة والمتلقية. يعتمد الفهم الأفضل لهذه العمليات على استخدام النماذج الحيوانية قبل السريرية ويساعده القدرة على دراسة الاتجار بالخلايا المناعية داخل الكسب غير المشروع في الوقت الفعلي. يمكن استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم لتصوير الأنسجة والأعضاء لأعماق تصل إلى عدة مئات من الميكرونات مع الحد الأدنى من التلف الضوئي ، مما يوفر ميزة كبيرة على الفحص المجهري أحادي الفوتون. يسمح الاستخدام الانتقائي للفئران المعدلة وراثيا مع تعبير البروتين الفلوري الخاص بالمروج و / أو النقل بالتبني للخلايا الفلورية ذات العلامات الصبغية أثناء الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم بالدراسة الديناميكية للخلايا المفردة داخل بيئتها الفسيولوجية. طورت مجموعتنا تقنية لتثبيت رئتي الفأر ، مما مكننا من تصوير الديناميكيات الخلوية في الرئتين الساذجة والطعوم الرئوية المزروعة بشكل متعامد. تسمح هذه التقنية بإجراء تقييم مفصل للسلوك الخلوي داخل الأوعية الدموية وفي الخلالي ، وكذلك لفحص التفاعلات بين مجموعات الخلايا المختلفة. يمكن تعلم هذا الإجراء وتكييفه بسهولة لدراسة آليات المناعة التي تنظم الاستجابات الالتهابية والتحمل بعد زرع الرئة. ويمكن أيضا توسيعه لدراسة الحالات الرئوية المسببة للأمراض الأخرى.

Introduction

زرع الرئة هو الخيار النهائي للعديد من المرضى الذين يعانون من مرض رئوي في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل بعد زرع الرئة ضعيف مقارنة بعمليات زرع الأعضاء الصلبة الأخرى. البقاء على قيد الحياة في 5 سنوات هو فقط ~ 60٪ -70٪ 1 ، مقارنة ب 80٪ -90٪ في القلوب2 و 85٪ -90٪ في الكلى3. العديد من المضاعفات بعد زرع الرئة ، مثل خلل الكسب غير المشروع الأولي ، والرفض بوساطة الأجسام المضادة ، وخلل الطعم الخيفي الرئوي المزمن ، ترجع إلى الاستجابة المناعية للمضيف للطعم الخيفي. على سبيل المثال ، أظهرت مجموعتنا أن العدلات يتم تجنيدها بسرعة في الطعم الخيفي الرئوي بعد إصابة نقص التروية الناجم عن الزرع وتشكل مجموعات ديناميكية تحيط بوحيدات الدم4. الحديث المتبادل بين الخلايا المانحة والمتلقية مسؤول عن استجابات المناعة الخيفية الضارة5،6،7 ، والقدرة على دراسة هذه التفاعلات الخلوية الديناميكية في نموذج حيواني حي لا تقدر بثمن.

يسمح الفحص المجهري ثنائي الفوتون بالتصوير داخل الجسم عالي الدقة لأعماق تصل إلى عدة مئات من الميكرونات مع الحد الأدنى من التبييض الضوئي للأنسجة 8,9. يتم استخدامه في مجموعة متنوعة من الأنسجة والمواقع التشريحية ، بما في ذلك القشرة المخية الحديثة10،11 ، والجلد12،13 ، والكلى14،15. في الآونة الأخيرة ، تم تكييفه مع الأعضاء غير الثابتة مثل الرئة والقلب4،16،17. في هذا البروتوكول ، نصف تقنية لتصوير الطعوم الرئوية المستقرة والتهوية والمثقوبة بعد زرع الرئة اليسرى لتقويم الفئران. تتمثل إحدى الفوائد الرئيسية لنموذج الزرع في القدرة على التلاعب الوراثي بالمتبرع والمتلقي بشكل منفصل. يمكن تصور مجموعات الخلايا الفردية باستخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا مع تعبير البروتين الفلوري غير المباشر ، أو النقل بالتبني للخلايا ذات العلامات الفلورية5 ، أو الحقن الوريدي للأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية لربط العلامات الخاصة بالخلية4،16،17،18.

من أجل تثبيت الرئة أثناء التصوير ، يتضمن هذا البروتوكول لصق الرئة بغطاء زجاجي ، بينما وصفت مجموعات أخرى تثبيت الشفط باستخدام جهاز تفريغ قابل للانعكاس مصنوع خصيصا19. يتميز بروتوكولنا بالعديد من المزايا ، بما في ذلك مساحة أكبر من التصوير وسهولة الإعداد النسبية باستخدام المواد المتاحة بشكل شائع في مختبر الفحص المجهري (بما في ذلك غطاء الزجاج والغراء). نظرا لأن تقنية الإلتصاق هذه تقيد الرئة على السطح العلوي ، فمن المتوقع أن تقلل من حركة التهوية وتسمح بتصوير أعمق. تسمح تقنية التصوير داخل الجسم هذه بمراقبة مفصلة لسلوك الخلايا المناعية وتفاعلاتها في الوقت الفعلي ، مما يساهم في دراسة آليات المناعة التي تنظم الاستجابات الالتهابية مقابل الاستجابات المتسامحة بعد زرع الرئة.

Protocol

تم إجراء جميع إجراءات التعامل مع وفقا للمعاهد الوطنية للرعاية الصحية واستخدام إرشادات المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كلية الطب بجامعة واشنطن.

1. التخدير والتنبيب

ملاحظة: يتم إجراء عملية زرع الرئة اليسرى للفأر التقويمي ، كما هو موضح سابقا20,21. يتم زرع الرئتين من 20-25 جم C57BL / 6 (B6) الفئران في متلقي B6 المتطابقين مع الجنس والعمر. ب6. تستخدم الفئران المراسلة LysM-GFP كمتلقين لتجارب مختارة لتصور تسلل العدلات إلى ترقيع الرئة. يمكن تصوير الفئران المتلقية مباشرة بعد عملية زرع الرئة.

  1. إعادة تخدير الفئران مع إعطاء الكيتامين داخل الصفاق (80-100 ملغم / كغم) والزيلازين (8-10 ملغم / كغم). يتم تطبيق البوبرينورفين المستدام الإطلاق (0.5-1.0 ملغ/كغ) تحت الجلد لمزيد من السيطرة على الألم. تأكيد عمق التخدير الكافي مع قرصة مخلب.
    ملاحظة: إذا كان الوقت بين زرع الرئة والتصوير داخل الجسم المخطط له أقل من ساعتين ، يمكن إعادة جرعة التخدير مع 50 ٪ من الجرعة الأولية من الكيتامين.
  2. قم بإزالة الشعر من الصدر الأيسر بالكامل باستخدام ماكينة قص كهربائية وامسح الصدر لإزالة الشعر الزائد المقصوص.
  3. ضع مرهم العيون غير الطبي على عيون الفأر لمنع جفاف القرنية.
  4. إعادة تنبيب الفأر عن طريق الفم والقصبة الهوائية مع قسطرة وعائية 20 G ، كما هو موضح سابقا21.
  5. تهوية مع هواء الغرفة بمعدل 120 نفسا / دقيقة وحجم المد والجزر من 0.5 سم مكعب.
  6. تسليم 1 ٪ إيزوفلوران القصبة الهوائية خلال الإجراء بأكمله.
  7. لتصور الأوعية الدموية أثناء التصوير ، قم بحقن 20 ميكرولتر من 655 نانومتر من النقاط الكمومية غير المستهدفة (q-dots) في 50 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات عن طريق الوريد قبل 5 دقائق على الأقل من التصوير.

2. التحضير الجراحي للرئة اليسرى للتصوير

  1. ضع الماوس في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن (انظر الشكل 1 أ).
  2. تطهير جلد الصدر بمزيج من 0.75 ٪ من اليود و 70 ٪ من الإيثانول ، ثلاث مرات.
  3. أعد فتح بضع الصدر الأيسر (من زرع رئة الفأر) من خلال الفضاء الوربي الثالث (انظر الشكل 1 أ).
  4. قم بإزالة جزء من الجلد والأنسجة الرخوة فوق موقع بضع الصدر الأيسر ، بقياس 1.5 سم × 1.5 سم (انظر الشكل 1 ب).
  5. قبل استئصال الضلع ، قم أولا بتثبيت الأضلاع لمدة ~ 10 ثوان لتخثر أي الأوعية الدموية الدقيقة لتحقيق الإرقاء (انظر الشكل 1C ، D).
  6. استئصال أجزاء منالأضلاع من3 إلى 5 لإنشاء نافذة تصوير كبيرة بما يكفي لتخليص الرئة (~ 0.8 سم من الناحية القحفية و ~ 1.0 سم من الأمام الخلفي ، الشكل 1D ، E).
  7. وقف أي نزيف إضافي من حواف الضلع مع الكي الكهربائي.
    ملاحظة: من الأهمية بمكان تحقيق الإرقاء في الحافة المقطوعة للأضلاع لتجنب فقدان الدم المفرط خلال فترة التصوير.
  8. ضع نتوءا صغيرا (شاش 4 سم × 4 سم مطوي طوليا 3 مرات) أسفل الصدر الأيمن (انظر الشكل 1E).
  9. باستخدام مسحات القطن ، ارفع طعم الرئة من الصدر وضع الجانب السفلي من الرئة على شريط 1 سم × 3 سم من الشاش المنقوع بالمحلول الملحي (انظر الشكل 1F).
    ملاحظة: يمنع هذا الشريط من الشاش المنقوع بالمحلول الملحي انزلاق الرئة ، ويحافظ على بيئة رطبة للرئة ، ويحمي الرئة من الحواف الحادة للأضلاع المقطوعة ، ويفصل الرئة عن حركة القلب. بمجرد تطبيق غرفة التصوير المحيطي على الرئة (الشكل 1G ، H ، الموصوف في القسم 3) ، يجب أن يكون هناك حد أدنى من الحرارة وفقدان السوائل من التجويف الصدري المفتوح خلال فترة التصوير.

3. إعداد غرفة التصوير

ملاحظة: غرفة التصوير مصممة خصيصا (انظر الشكل 2 أ). تتكون غرفة التصوير هذه من لوحة قاعدة ولوحة علوية يتم وضع الماوس بينهما وتثبيته في مكانه بمسامير محملة بنابض على كلا الجانبين (الشكل 2 ب). تحتوي اللوحة العلوية على فتحة دائرية قطرها ~ 2 سم. يتم وضع حلقة O سوداء الحجم في هذه الفتحة على الجانب الأمامي من اللوحة العلوية ، والتي ستحمي العدسة الموضوعية (الشكل 2C). يتم لصق غطاء زجاجي مقاس 24 مم × 50 مم على الجزء الخلفي من اللوحة العلوية باستخدام شحم فراغ عالي ، مما يخلق ختما مانعا للماء. سيكون غطاء الغطاء هذا بمثابة نافذة التصوير من خلال الالتصاق بالرئة أدناه وتثبيت وسائط التصوير (أي الماء) أعلاه. تأكد من عدم وجود شحم فراغ داخل نافذة التصوير الدائرية. سيتم استبدال غطاء الغطاء لكل تجربة تصوير جديدة. يتم تسخين لوحة القاعدة إلى 35-37 درجة مئوية باستخدام مسبار درجة حرارة مزدوج حراري (الشكل 2 أ).

  1. ضع الماوس الأنبوبي على اللوحة الأساسية لغرفة التصوير بحيث يكون الصدر الأيسر المفتوح متجها لأعلى (انظر الشكل 1G ، H). قم بتأمين الماوس بشريط حريري على الوجه والكفوف الأمامية والذيل (انظر الشكل 1H والشكل 2A).
  2. ضع الغراء على الجانب السفلي من زجاج الغطاء المتصل باللوحة العلوية (دائرة رمادية في الشكل 2C ، أسفل) ، تاركا دائرة خالية من الغراء 0.8-1.0 سم في المنتصف.
    ملاحظة: هناك مقايضة بين حجم الدائرة الخالية من الغراء وكمية قطعة أثرية الحركة ؛ وبالتالي ، يوصى بألا يتجاوز قطر الدائرة 1.0 سم.
  3. اخفض اللوحة العلوية حتى يتلامس الغطاء الزجاجي مع الرئة ، مع ملامسة الغراء لسطح الرئة (انظر الشكل 1G).
    ملاحظة: سيتم لصق الرئة اليسرى على غطاء الزجاج مع دائرة نظيفة وخالية من الغراء في المنتصف ، وهي المنطقة التي سيتم تصويرها.
  4. امسك غطاء الغطاء على الرئة وقم بتضخيم الرئة لمدة 1-2 ثانية حتى تلتصق منطقة الغراء بالأنسجة المحيطة. حقق تضخم الرئة عن طريق سد أنبوب التدفق الخارجي من أنبوب القصبة الهوائية للفأر إلى جهاز التنفس الصناعي.
    ملاحظة: لا تضخم الرئة لمدة تزيد عن 1-2 ثانية ، لأن هذا قد يسبب رضح ضغطي مفرط.
  5. تراجع عن اللوحة العلوية قليلا لتقليل الضغط على أنسجة الرئة. تأكد من أن منطقة الرئة داخل نافذة التصوير لا تتحرك مع التهوية.
  6. قم بتأمين طرفي اللوحة العلوية عن طريق تثبيت صامولة الإبهام فوق كل مسمار (انظر الشكل 2 ب).

4. التصوير ثنائي الفوتون

ملاحظة: يجب استخدام مجهر مستقيم ثابت المرحلة مع هدف غمر مائي بفتحة رقمية 20x أو 25x >1.0 (NA) للفحص المجهري داخل الجسم. فيما يلي الإعداد المستخدم في هذه الدراسة ل B6 إلى B6. زرع الرئة اليسرى LysM-GFP مع وضع علامات على الأوعية الدموية q-dot 655 نانومتر. عند تطبيق هذا البروتوكول ، يمكن تكييف إعداد المجهر والليزر والمرشحات ثنائية اللون بناء على احتياجات التجربة المحددة ومراسلي الفلورسنت المستخدمين.

  1. ضع غرفة التصوير بأكملها مع الماوس المتلقي للتنبيب (تم زرع الرئة اليسرى B6 في B6. LysM-GFP مع 655 نانومتر q-dots) على مرحلة المجهر (انظر الشكل 2 أ).
  2. استخدم مرشحات ثنائية اللون بأطوال موجية 480 نانومتر و 560 نانومتر و 635 نانومتر ، والتي ستفصل الإشارات بشكل مناسب عن مراسل GFP ، ونقاط q ، وإشارة الجيل التوافقي الثاني (SHG) (445 نانومتر) الناتجة عن الكولاجين. يمكن تكييف هذه المرشحات بناء على التجربة المحددة.
    ملاحظة: تحدد إشارة SHG الناتجة عن الكولاجين الهياكل الشبيهة بالحفرة المظلمة ، والتي تمثل المجالات الجوية السنخية (انظر الأسهم البيضاء في الشكل 3).
  3. اضبط الليزر النبضي الفيمتو ثانية من التيتانيوم والياقوت على 890 نانومتر (ضمن نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة) للإثارة. استخدم أقل طاقة ليزر ممكنة لتحقيق إشارة كافية.
    ملاحظة: يجب ضبط إعدادات الليزر للتجربة المحددة لزيادة فصل الإشارة إلى أقصى حد.
  4. ضع ~ 1 مل من الماء لتغطية الغطاء الزجاجي بالكامل على اللوحة العلوية ، والذي سيتم الاحتفاظ به في مكانه بواسطة الحلقة O وختم الشحوم الفراغية لزجاج الغطاء إلى اللوحة العلوية (انظر الشكل 1G والشكل 2C).
  5. استخدم هدف الغمر بالماء 20x >1.0 NA على المجهر. تأكد من تكييف العدسة الموضوعية بناء على التجربة المحددة.
    ملاحظة: يسمح NA الأكبر حجما بجمع المزيد من الضوء والتباين العالي والصور الأكثر تفصيلا. يفضل استخدام أهداف الغمر في الماء لأن الماء أو المخزن المؤقت أكثر توافقا مع الأنسجة البيولوجية.
  6. خفض هدف المجهر في الماء والتركيز على سطح الرئة.
  7. قم بتنشيط سخان لوحة القاعدة والحفاظ على درجة الحرارة عند 35-37 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا كانت هناك مخاوف بشأن عدم القدرة على الحفاظ على درجة حرارة الأنسجة أو التروية الكافية للرئة ، فيمكن توصيل مقاومتين إضافيتين لتدفئة اللوحة العلوية بالإضافة إلى لوحة القاعدة (انظر الشكل التكميلي 1).
  8. احصل على مكدسات الصور باستخدام برنامج الاستحواذ الذي تختاره.
    ملاحظة: تأكد من أن الغرفة مظلمة تماما أثناء الاستحواذ ، مما قد ينطوي على استخدام ستائر / ستائر معتمة وتغطية استراتيجية لجميع مصادر الضوء.

5. اقتناء الفيديو

ملاحظة: يمكن تكييف المعلمات التالية بناء على التجربة المحددة. تصف الخطوات 5.1-5.3 المعلمات المحددة المستخدمة ل B6 إلى B6. زرع الرئة اليسرى Lysm-GFP الفئران ، والتي يمكن استخدامها كدليل مرجعي.

  1. باستخدام ماسح ضوئي ثنائي الاتجاه بمعدل الفيديو، اضبط أبعاد المسح الضوئي x-y على 512 × 512 بكسل.
  2. باستخدام وحدة السائر xyz ، احصل على تسجيلات الفاصل الزمني لمكدس z المكون من 21 خطوة بمتوسط 10 إطارات لكل خطوة. يستغرق الحصول على كل مكدس حوالي 20 ثانية ، والذي يتضمن الوقت اللازم لمتوسط الإطار ، ومحرك السائر للتحرك والتحقق من موضعه ، وتأخير 100 مللي ثانية.
    ملاحظة: يعمل الماسح الضوئي ثنائي الاتجاه على المجهر المستخدم في هذه الدراسة بمعدل فيديو يبلغ 30 إطارا / ثانية. قد يختلف هذا اعتمادا على إعداد المجهر المحدد.
  3. الحصول على 80 مكدس z متتالي للحصول على تصوير بفاصل زمني لهجرة الكريات البيض داخل حمة الأنسجة. يستغرق هذا حوالي ~ 27 دقيقة عند 20 ثانية / كومة.
    ملاحظة: يجب تقليل حجم المكدس ومتوسط الإطار وطاقة الليزر والطول الإجمالي لتسجيل الفاصل الزمني لمنع التعرض المفرط لليزر للأنسجة. إذا كان مراسلو الفلورسنت المستخدمون ساطعين (أي GFP) وكانت طاقة الليزر منخفضة ، فإن تكرار مكدس z المكون من 21 خطوة بمتوسط 10 إطارات ، مسح ضوئي 512 × 512 بكسل ، على فترات 20 ثانية ل ~ 27 دقيقة يتحمله الماوس جيدا. إذا كانت هناك حاجة إلى فترات أطول من التصوير ، فيجب زيادة وقت الاستحواذ لكل مكدس للحفاظ على إجمالي التعرض لليزر كما هو (أي دقيقة واحدة لكل مكدس يزيد عن ~ 1.5 ساعة). ستحتاج هذه الإعدادات إلى التحسين بناء على مراسلات الفلورسنت المستخدمة.
  4. القتل الرحيم للماوس في نهاية الحصول على الصورة. للقتل الرحيم ، قم بتخدير الفأر بالكيتامين (80-100 مجم / كجم) والزيلازين (8-10 مجم / كجم) ، متبوعا بخلع عنق الرحم اللاحق. ستحافظ مستحضرات التصوير النموذجية بسهولة على صلاحية الماوس لمدة تصل إلى 2 ساعة.
    ملاحظة: لتمديد هذه الفترة ، قد تكون هناك حاجة إلى مكملات السوائل الإضافية ، والتخدير مع الأيزوفلوران ، والاهتمام بتنظيم درجة الحرارة.
  5. عرض فيديو كامل باستخدام Imaris. يمكن أيضا استخدام برامج التصوير الأخرى (مثل ImageJ).
    ملاحظة: قد تتم معالجة الصور بعد الحصول عليها باستخدام تحسين التباين والتنعيم وحسابات القناة لإزالة التشويش المتبادل للقناة.

النتائج

بعد 1 ساعة من التخزين الإقفاري البارد عند 4 درجات مئوية ، قمنا بزرع الرئة اليسرى بشكل متعامد من فأر B6 إلى B6. ماوس LysM-GFP4 ، ثم تم إجراء تصوير ثنائي الفوتون داخل الجسم ، كما هو موضح أعلاه. أجرينا التصوير في نقطتين زمنيتين بعد الزرع - 2 ساعة (الشكل 3 أ) ...

Discussion

تم وصف إثارة الفوتون لأول مرة في أطروحة الدكتوراه الخاصة بها من قبل ماريا جوبرت ماير في عام 1931 ، والتي فازت لاحقا بجائزة نوبل في الفيزياء لوصفها بنية القشرة النووية22,23. يعتمد الفحص المجهري الفلوري التقليدي على إثارة الفوتون الواحد ، مع أط?...

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي إفصاحات ذات صلة.

Acknowledgements

يتم دعم هذا العمل بمنح من NIH 1P01AI11650 ومؤسسة مستشفى بارنز اليهودي. نشكر مركز التصوير في الجسم الحي في كلية الطب بجامعة واشنطن.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.75% povidone-iodineAplicareNDC 52380-0126-2For disinfectant
1-inch 20G IV catheterTerumoSROX2025CAFor endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tapeDurapore3M ID 7100057168To secure mouse in position
20x water immersion long objective lensOlympusN20X-PFH
3M Vetbond glueMedi-Vet.com10872To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dotsThermoFisherQ21021MPFor labeling of blood vessels
70% ethanolSigma AldrichEX0281For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Black O ring (2 cm)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Bolt (2)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laserCoherentN/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)Fine Science Tools13009-12
Dual channel heater controllerWarner InstrumentsTC-344B
Fine scissors (1)Fine Science Tools15040-11
Fixed-stage upright microscopeOlympusBX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)McKesson476709To place under left lung
High vacuum greaseDow CorningN/ATo adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%Sigma Aldrich26675-46-7For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicatorsSolon56225To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipperOster078400-020-001
Puralube Vet eye ointmentMedi-Vet.com11897To prevent eye dessiccation
Small animal ventilatorHarvard Apparatus55-0000
Straight forceps (1)Fine Science Tools91113-10
Three channel shutter driverUniblitzVMM-D3Resonant scanner
x.y.z optical stepper motorPrior ScientificOptiScan II
Xylazine 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20For pain control

References

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282 (2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119 (2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36 (2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636 (2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120 (2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700 (2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved