الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم لرئة الفأر المزروعة

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لتصوير الرئة اليسرى للفأر المزروع باستخدام المجهر ثنائي الفوتون. يمثل هذا أداة قيمة لدراسة الديناميات الخلوية والتفاعلات في الوقت الفعلي بعد زرع رئة الفئران.

Abstract

ترتبط المضاعفات بعد زراعة الرئة إلى حد كبير باستجابة الجهاز المناعي المضيف للطعم. يتم تنظيم هذه الاستجابات المناعية عن طريق الحديث المتبادل بين الخلايا المانحة والمتلقية. يعتمد الفهم الأفضل لهذه العمليات على استخدام النماذج الحيوانية قبل السريرية ويساعده القدرة على دراسة الاتجار بالخلايا المناعية داخل الكسب غير المشروع في الوقت الفعلي. يمكن استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم لتصوير الأنسجة والأعضاء لأعماق تصل إلى عدة مئات من الميكرونات مع الحد الأدنى من التلف الضوئي ، مما يوفر ميزة كبيرة على الفحص المجهري أحادي الفوتون. يسمح الاستخدام الانتقائي للفئران المعدلة وراثيا مع تعبير البروتين الفلوري الخاص بالمروج و / أو النقل بالتبني للخلايا الفلورية ذات العلامات الصبغية أثناء الفحص المجهري ثنائي الفوتون داخل الجسم بالدراسة الديناميكية للخلايا المفردة داخل بيئتها الفسيولوجية. طورت مجموعتنا تقنية لتثبيت رئتي الفأر ، مما مكننا من تصوير الديناميكيات الخلوية في الرئتين الساذجة والطعوم الرئوية المزروعة بشكل متعامد. تسمح هذه التقنية بإجراء تقييم مفصل للسلوك الخلوي داخل الأوعية الدموية وفي الخلالي ، وكذلك لفحص التفاعلات بين مجموعات الخلايا المختلفة. يمكن تعلم هذا الإجراء وتكييفه بسهولة لدراسة آليات المناعة التي تنظم الاستجابات الالتهابية والتحمل بعد زرع الرئة. ويمكن أيضا توسيعه لدراسة الحالات الرئوية المسببة للأمراض الأخرى.

Introduction

زرع الرئة هو الخيار النهائي للعديد من المرضى الذين يعانون من مرض رئوي في المرحلة النهائية. ومع ذلك ، فإن البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل بعد زرع الرئة ضعيف مقارنة بعمليات زرع الأعضاء الصلبة الأخرى. البقاء على قيد الحياة في 5 سنوات هو فقط ~ 60٪ -70٪ ¹ ، مقارنة ب 80٪ -90٪ في القلوب² و 85٪ -90٪ في الكلى³. العديد من المضاعفات بعد زرع الرئة ، مثل خلل الكسب غير المشروع الأولي ، والرفض بوساطة الأجسام المضادة ، وخلل الطعم الخيفي الرئوي المزمن ، ترجع إلى الاستجابة المناعية للمضيف للطعم الخيفي. على سبيل المثال ، أظهرت مجموعتنا أن العدلات يتم تجنيدها بسرعة في الطعم ال....

Protocol

تم إجراء جميع إجراءات التعامل مع وفقا للمعاهد الوطنية للرعاية الصحية واستخدام إرشادات المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في كلية الطب بجامعة واشنطن.

1. التخدير والتنبيب

ملاحظة: يتم إجراء عملية زرع الرئة اليسرى للفأر التقويمي ، كما هو موضح سابقا^20,21. يتم زرع الرئتين من 20-25 جم C57BL / 6 (B6) الفئران في متلقي B6 المتطابقين مع الجنس والعمر. ب6. تستخدم الفئران المراسلة LysM-GFP كمتلقين لتجارب مختارة لتصور تسلل العدلات إلى ترقيع الرئة. يمكن تصوير الفئران المتلقية مباشرة بعد عملية ز....

النتائج

بعد 1 ساعة من التخزين الإقفاري البارد عند 4 درجات مئوية ، قمنا بزرع الرئة اليسرى بشكل متعامد من فأر B6 إلى B6. ماوس LysM-GFP⁴ ، ثم تم إجراء تصوير ثنائي الفوتون داخل الجسم ، كما هو موضح أعلاه. أجرينا التصوير في نقطتين زمنيتين بعد الزرع - 2 ساعة (الشكل 3 أ) .......

Discussion

تم وصف إثارة الفوتون لأول مرة في أطروحة الدكتوراه الخاصة بها من قبل ماريا جوبرت ماير في عام 1931 ، والتي فازت لاحقا بجائزة نوبل في الفيزياء لوصفها بنية القشرة النووية^22,23. يعتمد الفحص المجهري الفلوري التقليدي على إثارة الفوتون الواحد ، مع أط?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control