이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

요약

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

초록

폐 이식 후 합병증은 주로 이식편에 반응하는 숙주 면역 체계와 관련이 있습니다. 이러한 면역 반응은 공여자와 수혜 세포 사이의 누화에 의해 조절됩니다. 이러한 과정을 더 잘 이해하려면 전임상 동물 모델을 사용해야 하며, 이식편 내 면역 세포 이동을 실시간으로 연구할 수 있는 능력의 도움을 받습니다. Intravital 이광자 현미경은 광손상을 최소화하면서 최대 수백 미크론 깊이의 조직과 장기를 이미징하는 데 사용할 수 있으며, 이는 단일 광자 컨포칼 현미경에 비해 큰 이점을 제공합니다. 프로모터 특이적 형광 단백질 발현 및/또는 생체 내 이광자 현미경 검사 중 형광 염료 표지 세포의 입양 전달과 함께 형질전환 마우스의 선택적 사용을 통해 생리학적 환경 내에서 단일 세포를 동적으로 연구할 수 있습니다. 우리 그룹은 쥐의 폐를 안정화하는 기술을 개발했으며, 이를 통해 미성숙한 폐와 정형외과적으로 이식된 폐 이식편에서 세포 역학을 이미지화할 수 있었습니다. 이 기술을 사용하면 혈관 조직 및 간질에서의 세포 거동을 자세히 평가할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 세포 집단 간의 상호 작용을 검사할 수 있습니다. 이 절차는 폐 이식 후 염증 및 내성 반응을 조절하는 면역 메커니즘을 연구하기 위해 쉽게 배우고 적용할 수 있습니다. 또한 다른 병원성 폐 질환에 대한 연구로 확장될 수 있습니다.

서문

폐 이식은 말기 폐 질환을 앓고 있는 많은 환자에게 마지막 선택입니다. 그러나 폐 이식 후 장기 생존율은 다른 고형 장기 이식에 비해 낮습니다. 5년 생존율은 ~60%-70%¹에 불과하며, 심장²의 경우 80%-90%, 신장³의 경우 85%-90%입니다. 원발성 이식편 기능 장애, 항체 매개 거부 반응 및 만성 폐 동종 이식편 기능 장애와 같은 폐 이식 후 많은 합병증은 동종 이식편에 대한 숙주 면역 반응에 기인합니다. 예를 들어, 우리 그룹은 호중구가 이식에 의한 허혈-재관류 손상 후 폐 동종 이식편으로 빠르게 모집되고 혈액 단핵구를 둘러싼 동적 클러스터를 형성한다는 것을 보여주었습니다⁴. 기증자 세포와 수용 세포 간의 누화는 해로운 동종 면역 반응 ^5,6,7을 담당하며, 살아있는 동물 모델에서 이러한 동적 세포 상호 작용을 연구할 수 있는 능력은 매우 중요합니다.

이광자 현미경은 조직의 광표백을 최소화하면서 최대 수백 미크론의 깊이에 대한 고해상도 생체 내 이미징을 가능하게 합니다 ^8,9. 그것은 신피질^(10,11), 피부^(12,13) 및 신장^(14,15)을 포함한 다양한 조직 및 해부학 부위에 사용됩니다. 보다 최근에는 폐 및 심장 ^4,16,17과 같은 비 정적 기관에 적용되었습니다. 이 프로토콜에서는 쥐 기형외과 좌측 폐 이식 후 이미지 안정화, 환기 및 관류 폐 이식편을 시행하는 기술을 설명합니다. 이식 모델의 주요 이점은 기증자와 수혜자를 개별적으로 유전적으로 조작할 수 있다는 것입니다. 개별 세포 집단은 knock-in 형광 단백질 발현, 형광^{표지 세포5}의 입양 전달 또는 형광 표지 항체의 정맥 주사를 통해 세포 특이적 마커 ^4,16,17,18에 결합하는 형질전환 마우스 균주를 시각화할 수 있습니다.

이미징 중에 폐를 안정화하기 위해 이 프로토콜은 폐를 커버글라스에 접착하는 것을 포함하며, 다른 그룹에서는 맞춤형 가역 진공 장치⁽¹⁹)를 사용한 흡입 안정화를 설명했습니다. 당사의 프로토콜은 이미징 영역이 더 넓고 현미경 실험실에서 일반적으로 구할 수 있는 재료(커버글라스 및 접착제 포함)를 사용하여 설정하는 것이 상대적으로 용이하다는 등 여러 가지 장점이 있습니다. 이 접착 기술은 상부 표면에서 폐를 제한하기 때문에 인공호흡 움직임을 줄이고 더 깊은 이미징을 가능하게 할 것으로 예상됩니다. 이 생체 내 이미징 기술을 통해 면역 세포의 행동과 상호 작용을 실시간으로 자세히 관찰할 수 있으며, 이는 폐 이식 후 염증 반응과 내성 반응을 조절하는 면역 메커니즘 연구에 기여합니다.

프로토콜

모든 동물 취급 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals) 지침에 따라 수행되었으며 워싱턴 대학교 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 마취 및 삽관

참고: 앞서 설명한 바와 같이 Orthotopic 마우스 좌측 폐 이식이 수행됩니다^20,21. 20-25g C57BL/6 (B6) 마우스의 폐를 성별 및 연령이 일치하는 B6 수혜자에게 이식합니다. 나6. LysM-GFP 리포터 마우스는 폐 이식편으로의 호중구 침윤을 시각화하기 위해 선별된 실험의 수혜자로 사용됩니다. 수혜자 마우스는 폐 이식 직후 이미지화할 수 있습니다.

1. 케타민(80-100 mg/kg)과 자일라진(8-10 mg/kg)의 복강내 투여로 마우스를 재마취합니다. 추가적인 통증 조절을 위해 서방형 부프레노르핀(0.5-1.0mg/kg)을 피하로 투여합니다. 발 꼬집기로 적절한 마취 깊이를 확인합니다.
   참고: 폐 이식과 계획된 생체 내 영상 촬영 사이의 시간이 2시간 미만인 경우 초기 케타민 용량의 50%로 마취제를 재투여할 수 있습니다.
2. 전기 클리퍼를 사용하여 왼쪽 가슴 전체의 머리카락을 제거하고 가슴을 닦아 과도하게 자른 머리카락을 제거합니다.
3. 각막 건조를 방지하기 위해 약물이 아닌 안과 연고를 쥐의 눈에 바릅니다.
4. 앞서 설명한 대로 20G 혈관카테터로 마우스를 구강삽관합니다²¹.
5. 분당 120회의 호흡과 0.5cc의 일회 호흡량으로 실내 공기를 환기시킵니다.
6. 전체 절차 동안 1% 이소플루오란을 기관내로 전달합니다.
7. 이미징 중 혈관을 시각화하려면 이미징 최소 5분 전에 50μL의 인산염 완충 식염수에 20μL의 655nm 비표적 양자점(q-dots)을 정맥 주사합니다.

2. 영상촬영을 위한 좌측 폐의 수술 준비

1. 마우스를 오른쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다( 그림 1A 참조).
2. 0.75% 요오드와 70% 에탄올의 혼합물로 흉부 피부를 3회 소독합니다.
3. 세 번째 늑간 공간을 통해 왼쪽 흉곽 절개술(마우스 폐 이식에서)을 다시 엽니다( 그림 1A 참조).
4. 1.5cm x 1.5cm 크기의 왼쪽 흉곽 절개 부위의 피부와 연조직을 제거합니다( 그림 1B 참조).
5. 갈비뼈를 절제하기 전에 먼저 지혈을 달성하기 위해 미세혈관을 혈전화시키기 위해 갈비뼈를 ~10초 동안 고정합니다( 그림 1C, D 참조).
6. 3^{번째에서 5번째} 갈비뼈의 일부를 절제하여 폐를 절제할 수 있을 만큼 충분히 큰 이미징 창을 만듭니다(두개골 쪽으로 ~0.8cm, 전후방으로 ~1.0cm, 그림 1D, E).
7. 전기 소작으로 갈비뼈 가장자리에서 추가 출혈을 막습니다.
   참고: 이미징 기간 동안 과도한 출혈을 피하기 위해 갈비뼈의 절단 가장자리에서 지혈을 달성하는 것이 중요합니다.
8. 오른쪽 가슴 아래에 작은 돌기(세로로 4번 접은 4cm x 4cm 거즈)를 놓습니다( 그림 1E 참조).
9. 면봉을 사용하여 폐 이식편을 가슴에서 들어 올리고 폐의 아래쪽을 식염수에 적신 거즈 1cm x 3cm 스트립에 놓습니다( 그림 1F 참조).
   알림: 이 식염수 적신 거즈 스트립은 폐가 미끄러지는 것을 방지하고, 폐의 습한 환경을 유지하고, 절제된 갈비뼈의 날카로운 모서리로부터 폐를 보호하고, 폐를 심장 운동과 분리합니다. 원주 이미징 챔버가 폐에 적용되면(섹션 3에 설명된 그림 1G, H) 이미징 기간 동안 열린 흉강에서 발생하는 열 및 체액 손실이 최소화되어야 합니다.

3. 이미징 챔버 준비

참고: 이미징 챔버는 맞춤형으로 제작됩니다( 그림 2A 참조). 이 이미징 챔버는 베이스 플레이트와 상단 플레이트로 구성되며, 그 사이에 마우스가 배치되고 양쪽에 스프링이 장착된 볼트로 제자리에 고정됩니다(그림 2B). 상판에는 직경이 ~2cm 인 원형 컷아웃이 있습니다. 상반구 전면에 있는 이 구멍에 해당하는 크기의 검은색 O 링이 배치되어 대물 렌즈를 보호합니다(그림 2C). 24mm x 50mm 커버글라스를 고진공 그리스를 사용하여 상판 뒷면에 부착하여 방수 밀봉을 생성합니다. 이 커버글라스는 아래의 폐에 부착되고 위의 이미징 매체(즉, 물)를 유지하여 이미징 창 역할을 합니다. 원형 이미징 창 내에 진공 그리스가 들어가지 않도록 합니다. 커버글라스는 새로운 이미징 실험이 있을 때마다 교체됩니다. 베이스 플레이트는 열전대 온도 프로브를 사용하여 35-37 °C로 가열됩니다(그림 2A).

1. 삽관된 마우스를 열린 왼쪽 가슴이 위를 향하도록 하여 이미징 챔버의 베이스 플레이트에 놓습니다( 그림 1G, H 참조). 실크 테이프로 마우스를 얼굴, 앞발, 꼬리에 고정합니다( 그림 1H 및 그림 2A 참조).
2. 상판에 부착된 커버 유리의 바닥면( 그림 2C, 하단의 회색 원)에 접착제를 바르고 중앙에 0.8-1.0cm의 접착제가 없는 원을 남깁니다.
   참고: glue-free circle의 크기와 motion artifact의 양 사이에는 장단점이 있습니다. 따라서 원의 지름이 1.0cm를 초과하지 않는 것이 좋습니다.
3. 커버글라스가 폐에 닿을 때까지 상판을 내리고 접착제가 폐 표면에 닿을 때까지 내립니다( 그림 1G 참조).
   알림: 왼쪽 폐는 이미징될 영역인 중앙에 깨끗하고 접착제가 없는 원이 있는 커버글라스에 접착됩니다.
4. 커버글라스를 폐에 대고 1-2초 동안 폐를 팽창시켜 접착제 영역이 주변 조직에 부착되도록 합니다. 쥐의 기관내관에서 인공호흡기로 가는 유출 튜브를 폐색하여 폐 팽창을 달성합니다.
   알림: 과도한 압력 외상을 유발할 수 있으므로 폐를 1-2초 이상 팽창시키지 마십시오.
5. 폐 조직에 가해지는 압력을 줄이기 위해 상판에서 약간 뒤로 물러납니다. 이미징 창 내의 폐 영역이 환기와 함께 움직이지 않도록 하십시오.
6. 각 볼트 위에 나비 너트를 고정하여 상판의 양쪽 끝을 고정합니다( 그림 2B 참조).

4. 이광자 이미징

참고: 20x 또는 25x >1.0 NA(numerical aperture) 수침 대물렌즈가 있는 고정 스테이지, 정립 현미경을 생체 내 현미경 검사에 사용해야 합니다. 아래는 이 연구에서 B6에서 B6에 대해 사용된 설정입니다. LysM-GFP 655nm q-dot 혈관 라벨링을 사용한 좌측 폐 이식. 이 프로토콜을 적용할 때 현미경, 레이저 및 dichroic filter의 설정은 특정 실험의 요구 사항과 사용된 형광 리포터에 따라 조정할 수 있습니다.

1. 전체 이미징 챔버를 삽관된 수용 마우스(B6, 왼쪽 폐가 B6에 이식됨)와 함께 놓습니다. 655nm q-dots가 있는 LysM-GFP)를 현미경 스테이지에 넣습니다( 그림 2A 참조).
2. 480nm, 560nm 및 635nm 파장의 이색성 필터를 사용하면 GFP 리포터, q-dots 및 콜라겐에 의해 생성된 2차 고조파 생성(SHG) 신호(445nm)에서 신호를 적절하게 분리할 수 있습니다. 이러한 필터는 특정 실험에 따라 조정할 수 있습니다.
   참고: 콜라겐에 의해 생성된 SHG 신호는 폐포 공역을 나타내는 어두운 분화구와 같은 구조를 구분합니다( 그림 3의 흰색 화살표 참조).
3. 티타늄-사파이어 펨토초 펄스 레이저를 890nm(근적외선 범위 내)로 설정하여 excitation합니다. 충분한 신호를 얻기 위해 가능한 가장 낮은 레이저 출력을 사용하십시오.
   알림: 신호 분리를 최대화하기 위해 특정 실험에 맞게 레이저 설정을 조정해야 합니다.
4. ~1mL의 물을 도포하여 상판의 커버글라스를 완전히 덮고, 이는 O-링과 커버 글라스의 진공 그리스 씰에 의해 상판에 제자리에 유지됩니다( 그림 1G 및 그림 2C 참조).
5. 현미경에 20x >1.0 NA Water Immersion Objective를 사용합니다. 대물렌즈가 특정 실험에 따라 조정되었는지 확인하십시오.
   참고: NA가 클수록 더 많은 빛을 수집하고 대비를 높이며 더 상세한 이미지를 얻을 수 있습니다. Water Immersion Objective는 물 또는 완충액이 생물학적 조직과 더 잘 호환되기 때문에 선호됩니다.
6. 현미경의 대물렌즈를 물 속으로 내리고 폐 표면에 초점을 맞춥니다.
7. 베이스 플레이트 히터를 활성화하고 온도를 35-37 °C로 유지합니다.
   알림: 조직 온도를 유지하거나 폐에 적절한 관류를 유지할 수 없는 우려가 있는 경우 베이스 플레이트 외에 상단 플레이트를 따뜻하게 하기 위해 두 개의 추가 저항기를 부착할 수 있습니다( 보충 그림 1 참조).
8. 선택한 수집 소프트웨어로 이미지 스택을 획득합니다.
   알림: 획득하는 동안 방이 완전히 어둡게 되어 있는지 확인하며, 여기에는 암막 커튼/블라인드를 사용하고 모든 광원을 전략적으로 덮는 것이 포함될 수 있습니다.

5. 비디오 획득

참고: 다음 매개변수는 특정 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 5.1-5.3 단계에서는 B6에서 B6에 사용되는 특정 매개 변수를 설명합니다. Lysm-GFP 쥐 좌측 폐 이식, 참조 가이드로 사용할 수 있습니다.

1. 비디오 속도 양방향 스캐너를 사용하여 x-y 스캔 크기를 512 x 512 픽셀로 설정합니다.
2. xyz 스테퍼 유닛을 사용하여 단계당 평균 10프레임으로 21단계 z 스택의 타임랩스 기록을 획득합니다. 각 스택을 획득하는 데 약 20초가 걸리며, 여기에는 프레임 평균화에 필요한 시간, 스테퍼 모터가 이동하고 위치를 확인하는 데 필요한 시간, 100ms 지연이 포함됩니다.
   참고: 이 연구에 사용된 현미경의 양방향 스캐너는 30프레임/초의 비디오 속도로 작동합니다. 이는 특정 현미경 설정에 따라 다를 수 있습니다.
3. 80개의 연속 z-stack을 획득하여 조직 실질 내 백혈구 이동에 대한 타임랩스 이미징을 얻습니다. 20초/스택에서 약 ~27분이 소요됩니다.
   알림: 스택 크기, 프레임 평균화, 레이저 출력 및 타임랩스 기록의 총 길이는 조직에 대한 과도한 레이저 노출을 방지하기 위해 최소화해야 합니다. 사용된 형광 리포터가 밝고(즉, GFP) 레이저 출력이 낮은 경우 ~27분 동안 20초 간격으로 10프레임 평균, 512 x 512픽셀 스캔으로 21단계 z-stack을 반복하는 것이 마우스에서 잘 견딜 수 있습니다. 더 긴 기간의 이미징이 필요한 경우 총 레이저 노출을 동일하게 유지하기 위해 스택당 획득 시간을 늘려야 합니다(즉, ~1.5시간 동안 스택당 1분). 이러한 설정은 사용된 형광 리포터에 따라 최적화해야 합니다.
4. 이미지 획득이 끝나면 마우스를 안락사시킵니다. 안락사시키려면 케타민(80−100mg/kg)과 자일라진(8−10mg/kg)으로 쥐를 마취한 후 자궁경부 탈구를 수행합니다. 일반적인 이미징 제제는 최대 2시간 동안 마우스의 생존력을 쉽게 유지할 수 있습니다.
   알림: 이 기간을 연장하려면 추가 수분 보충, 이소플루란으로 마취, 온도 조절에 주의가 필요할 수 있습니다.
5. Imaris로 완벽한 비디오 렌더링. 다른 이미징 소프트웨어(예: ImageJ)도 사용할 수 있습니다.
   참고: 이미지는 채널 누화를 제거하기 위해 대비 향상, 스무딩 및 채널 산술 연산을 사용하여 획득 후 처리될 수 있습니다.

결과

4 °C에서 1 시간의 저온 허혈성 보관 후 B6 마우스의 왼쪽 폐를 B6에 정형외과 이식했습니다. LysM-GFP 마우스⁴를 사용한 후, 위에서 설명한 바와 같이 생체 내 이광자 이미징을 수행하였다. 우리는 이식 후 2시간(그림 3A)과 24시간(그림 3B)의 두 시점에서 이미징을 수행했습니다. 혈관은 이미징 직전에 주입된 q-dots?...

토론

이광자 여기(two-photon excitation)는 1931년 마리아 괴페르트-마이어(Maria Göppert-Mayer)의 박사 학위 논문에서 처음 설명되었으며, 나중에 핵 껍질 구조를 설명하여 노벨 물리학상을 수상했습니다^22,23. 기존의 형광 현미경 검사는 방출 파장보다 더 짧고 에너지가 높은 여기 파장을 가진 단일 광자 여기(single-photon excitation)에 의존합니다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control