이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

요약

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

초록

폐 이식 후 합병증은 주로 이식편에 반응하는 숙주 면역 체계와 관련이 있습니다. 이러한 면역 반응은 공여자와 수혜 세포 사이의 누화에 의해 조절됩니다. 이러한 과정을 더 잘 이해하려면 전임상 동물 모델을 사용해야 하며, 이식편 내 면역 세포 이동을 실시간으로 연구할 수 있는 능력의 도움을 받습니다. Intravital 이광자 현미경은 광손상을 최소화하면서 최대 수백 미크론 깊이의 조직과 장기를 이미징하는 데 사용할 수 있으며, 이는 단일 광자 컨포칼 현미경에 비해 큰 이점을 제공합니다. 프로모터 특이적 형광 단백질 발현 및/또는 생체 내 이광자 현미경 검사 중 형광 염료 표지 세포의 입양 전달과 함께 형질전환 마우스의 선택적 사용을 통해 생리학적 환경 내에서 단일 세포를 동적으로 연구할 수 있습니다. 우리 그룹은 쥐의 폐를 안정화하는 기술을 개발했으며, 이를 통해 미성숙한 폐와 정형외과적으로 이식된 폐 이식편에서 세포 역학을 이미지화할 수 있었습니다. 이 기술을 사용하면 혈관 조직 및 간질에서의 세포 거동을 자세히 평가할 수 있을 뿐만 아니라 다양한 세포 집단 간의 상호 작용을 검사할 수 있습니다. 이 절차는 폐 이식 후 염증 및 내성 반응을 조절하는 면역 메커니즘을 연구하기 위해 쉽게 배우고 적용할 수 있습니다. 또한 다른 병원성 폐 질환에 대한 연구로 확장될 수 있습니다.

서문

폐 이식은 말기 폐 질환을 앓고 있는 많은 환자에게 마지막 선택입니다. 그러나 폐 이식 후 장기 생존율은 다른 고형 장기 이식에 비해 낮습니다. 5년 생존율은 ~60%-70%¹에 불과하며, 심장²의 경우 80%-90%, 신장³의 경우 85%-90%입니다. 원발성 이식편 기능 장애, 항체 매개 거부 반응 및 만성 폐 동종 이식편 기능 장애와 같은 폐 이식 후 많은 합병증은 동종 이식편에 대한 숙주 면역 반응에 기인합니다. 예를 들어, 우리 그룹은 호중구가 이식에 의한 허혈-재관류 손상 후 폐 동종 이식편으로 빠르게 모집되고 혈액 단핵구를 둘러싼 동적 클러스터를 형성한다는 것을 보여주었습니다⁴. 기증자 세포와 수용 세포 간의 누화는 해로운 동종 면역 반응 ^5,6,7을 담당하며, 살아있는 동물 모델에서 이러한 동적 세포 상호 작용을 연구할 수 있는 능력은 매우 중요합니다.

프로토콜

모든 동물 취급 절차는 미국 국립보건원(National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals) 지침에 따라 수행되었으며 워싱턴 대학교 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 마취 및 삽관

참고: 앞서 설명한 바와 같이 Orthotopic 마우스 좌측 폐 이식이 수행됩니다^20,21. 20-25g C57BL/6 (B6) 마우스의 폐를 성별 및 연령이 일치하는 B6 수혜자에게 이식합니다. 나6. LysM-GFP 리포터 마우스는 폐 이식편으로의 호중구 침윤을 시각화하기 위해 선별된 실험의 수혜자로 사용됩니다. 수혜자 마우스는 폐 이식 직후 이미지화할 수 있습니다.

1. 케타민(80-100 mg/kg)과 자일라진(8-10 mg/kg)의 복강내 투여로 마우스를 재마취합니다. 추가적인 통증 조절을 위해 서방형 부프레노르핀(0.5-....

토론

이광자 여기(two-photon excitation)는 1931년 마리아 괴페르트-마이어(Maria Göppert-Mayer)의 박사 학위 논문에서 처음 설명되었으며, 나중에 핵 껍질 구조를 설명하여 노벨 물리학상을 수상했습니다^22,23. 기존의 형광 현미경 검사는 방출 파장보다 더 짧고 에너지가 높은 여기 파장을 가진 단일 광자 여기(single-photon excitation)에 의존합니다........

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control