移植小鼠肺的活体双光子显微镜检查

摘要

在这里，我们提出了一种使用双光子显微镜对移植的小鼠左肺进行活体内成像的方案。这是实时研究小鼠肺移植后细胞动力学和相互作用的宝贵工具。

摘要

肺移植后的并发症在很大程度上与宿主免疫系统对移植物的反应有关。这种免疫反应受供体细胞和受体细胞之间的串扰调节。更好地了解这些过程依赖于临床前动物模型的使用，并有助于实时研究移植物内免疫细胞运输的能力。活体双光子显微镜可用于对深度达几百微米的组织和器官进行成像，光损伤最小，与单光子共聚焦显微镜相比具有很大的优势。在活体双光子显微镜检查期间选择性使用具有启动子特异性荧光蛋白表达和/或荧光染料标记细胞过继转移的转基因小鼠，可以在其生理环境中对单个细胞进行动态研究。 我们小组开发了一种稳定小鼠肺的技术，这使我们能够对幼稚肺和原位移植肺移植物中的细胞动力学进行成像。该技术允许详细评估脉管系统和间质内的细胞行为，以及检查各种细胞群之间的相互作用。该程序很容易学习并适应研究肺移植后调节炎症和耐受性反应的免疫机制。它也可以扩展到其他致病性肺部疾病的研究。

引言

肺移植是许多患有终末期肺病的患者的最终选择;然而，与其他实体器官移植相比，肺移植后的长期生存率较差。5 年生存率仅为 ~60%-70%¹，而心脏² 和 肾脏分别为 80%-90% 和 85%-90%³。肺移植后的许多并发症，如原发性移植物功能障碍、抗体介导的排斥反应和慢性肺同种异体移植物功能障碍，都是由于宿主对同种异体移植物的免疫反应所致。例如，我们小组已经表明，在移植诱导的缺血再灌注损伤后，中性粒细胞被迅速募集到肺同种异体移植物中，并在血液单核细胞周围形成动态簇⁴。供体细胞和受体细胞之间的串扰是造成有害同种免疫反应的原因 ^5,6,7，^在活体动物模型中研究这些动态细胞相互作用的能力非常宝贵。

双光子显微镜可对高达几百微米的深度进行高分辨率活体成像，同时将组织的光漂白降至最低 ^8,9。它用于各种组织和解剖部位，包括新皮层^10,11、皮肤^12,13 和肾脏^14,15。最近，它已被适应非静态器官，例如肺和心脏 ^4,16,17。在该协议中，我们描述了一种在小鼠原位左肺移植后对肺移植物进行图像稳定、通气和灌注肺移植物的技术。移植模型的一个主要优点是能够分别对供体和受体进行基因操作。通过基因敲入荧光蛋白表达的转基因小鼠品系、荧光标记细胞的过继转移⁵ 或静脉注射荧光标记抗体以结合细胞特异性标志物 4,16,17,18，可以观察单个细胞群。

为了在成像过程中稳定肺部，该方案包括将肺粘在盖玻片上，而其他小组则描述了使用定制的可逆真空装置稳定抽吸¹⁹。我们的方案有几个优点，包括更大的成像面积和使用显微镜实验室中常用材料（包括盖玻片和胶水）相对容易设置。由于这种胶合技术限制了上表面的肺，因此预计会减少通气运动并允许更深入的成像。这种活体成像技术可以实时详细观察免疫细胞的行为和相互作用，这有助于研究肺移植后调节炎症反应与耐受性反应的免疫机制。

研究方案

所有动物处理程序均按照美国国立卫生保健和使用实验动物研究所的指导方针进行，并得到华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 麻醉和插管

注意：如前所述，进行原位小鼠左肺移植^20,21。将 20-25 g C57BL/6 （B6） 小鼠的肺移植到性别和年龄匹配的 B6 受体中。B6.LysM-GFP 报告小鼠用作选择实验的受体，以可视化中性粒细胞浸润到肺移植物中。受体小鼠可以在肺移植后立即成像。

1. 通过腹膜内施用氯胺酮 （80-100 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （8-10 mg/kg） 重新麻醉小鼠。皮下注射缓释丁丙诺啡 （0.5-1.0 mg/kg） 以进一步控制疼痛。通过捏爪子确认足够的麻醉深度。
   注意：如果肺移植和计划的活体成像之间的时间少于两小时，可以用初始剂量的 50% 的氯胺酮重新给药麻醉剂。
2. 用电动剪刀去除整个左胸部的毛发，然后擦拭胸部以去除多余的剪发。
3. 将非药物眼药膏涂抹在小鼠的眼睛上，以防止角膜干燥。
4. 如前所述，用 20 G 血管导管经口气管重新插管小鼠²¹。
5. 以 120 次呼吸/分钟的速度用室内空气通风，潮气量为 0.5 cc。
6. 在整个手术过程中通过气管内输送 1% 异氟烷。
7. 为了在成像过程中可视化血管，请在成像前至少 5 分钟在 50 μL 磷酸盐缓冲盐水中静脉注射 20 μL 655 nm 非靶向量子点 （q-dots）。

2. 左肺成像手术准备

1. 将鼠标置于右侧卧位（参见 图 1A）。
2. 用 0.75% 碘和 70% 乙醇的混合物消毒胸部皮肤 3 次。
3. 通过第三个肋间隙重新打开左开胸手术（来自小鼠肺移植）（见 图 1A）。
4. 去除左侧开胸部位的一部分皮肤和软组织，尺寸为 1.5 cm x 1.5 cm（见 图 1B）。
5. 在肋骨切除术之前，首先夹住肋骨 ~10 秒以形成任何微血管系统以实现止血（参见 图 1C、D）。
6. 切除^第 3 至第 5^肋骨的部分，以创建一个足够大的成像窗口以解救肺（颅尾 ~0.8 厘米和前后 ~1.0 厘米，图 1D，E）。
7. 用电烙术止住肋骨边缘的任何额外出血。
   注意：在肋骨的切割边缘实现止血以避免成像期间失血过多至关重要。
8. 在右胸部下方放置一个小凸起（4 cm x 4 cm 纱布纵向折叠 3 次）（见 图 1E）。
9. 使用棉签将肺移植物抬出胸部，并将肺的下部放在 1 厘米 x 3 厘米的盐水浸泡纱布条上（见 图 1F）。
   注意：这条浸有盐水的纱布条可防止肺部滑动，保持肺部湿润环境，保护肺部免受切除肋骨的锋利边缘的影响，并将肺部与心脏运动分开。一旦将圆周成像室应用于肺部（图 1G，H，在第 3 节中描述），在成像期间，开放胸腔的热量和液体损失应该最小。

3. 成像室准备

注意：成像室是定制的（参见 图 2A）。该成像室由一个底板和一个顶板组成，鼠标放置在底板之间，并通过两侧的弹簧螺栓固定到位（图 2B）。顶板包含一个直径为 ~2 cm 的圆形切口。将相应大小的黑色 O 形圈放入顶板前侧的这个开口中，以保护物镜（图 2C）。使用高真空润滑脂将 24 mm x 50 mm 的盖玻片粘附在顶板的背面，从而形成防水密封。该盖玻片将粘附在下面的肺上，并将成像介质（即水）保持在上方，从而用作成像窗口。确保没有真空润滑脂进入圆形成像窗口。每次新的成像实验都将更换盖玻片。使用热电偶温度探头将底板加热至 35-37 °C（图 2A）。

1. 将插管的鼠标放在成像室的底板上，打开的左胸朝上（参见图 1G，H）。用丝带将鼠标固定在面部、前爪和尾巴上（参见图 1H 和图 2A）。
2. 将胶水涂在连接到顶板的盖玻片的底部（ 图 2C 中的灰色圆圈，底部），在中心留下一个 0.8-1.0 cm 的无胶圆圈。
   注意：无胶圆的大小和运动伪影的数量之间存在权衡;因此，建议圆圈的直径不超过 1.0 厘米。
3. 降低顶板，直到盖玻片与肺接触，胶水接触肺表面（参见 图 1G）。
   注意：左肺将粘在盖玻片上，中间有一个干净、无胶的圆圈，这是将要成像的区域。
4. 将盖玻片靠在肺上，让肺充气 1-2 秒，使胶水区域粘附在周围组织上。通过堵塞从小鼠气管插管到呼吸机的流出管来完成肺充气。
   注意：不要让肺部充气超过 1-2 秒，因为这可能会导致过度的气压伤。
5. 稍微向后退顶板，以减少对肺组织的压力。确保成像窗口内的肺区域不随通气而移动。
6. 通过将拇指螺母固定在每个螺栓上来固定顶板的两端（参见 图 2B）。

4. 双光子成像

注意：活体显微镜应使用具有 20 倍或 25 倍 >1.0 数值孔径 （NA） 水浸物镜的固定载物台正置显微镜。以下是本研究中用于 B6 到 B6 的设置。LysM-GFP 左肺移植具有 655 nm q-dot 血管标记。应用此方案时，可以根据特定实验的需要和所使用的荧光报告基因来调整显微镜、激光器和二向色滤光片的设置。

1. 将整个成像室与插管的受体小鼠（B6 左肺移植到 B6 中。具有 655 nm q 点的 LysM-GFP）放到显微镜载物台上（参见 图 2A）。
2. 使用波长为 480 nm、560 nm 和 635 nm 的二向色滤光片，这将适当地将信号与胶原蛋白产生的 GFP 报告基因、q 点和二次谐波产生 （SHG） 信号 （445 nm） 分开。这些过滤器可以根据特定的实验进行调整。
   注：胶原蛋白产生的 SHG 信号划定了代表肺泡空隙的暗火山口状结构（参见 图 3 中的白色箭头）。
3. 将钛蓝宝石飞秒脉冲激光器设置为 890 nm（在近红外范围内）进行激发。使用尽可能低的激光功率来获得足够的信号。
   注意：应根据特定实验调整激光设置，以最大限度地提高信号分离度。
4. 加入 ~1 mL 水以完全覆盖顶板上的盖玻片，盖玻片的 O 形圈和盖玻片的真空油脂密封将盖玻片固定在顶板上（参见 图 1G 和 图 2C）。
5. 在显微镜上使用 20x >1.0 NA 水浸物镜。确保物镜根据具体实验进行调整。
   注意：较大的 NA 可实现更多的光收集、更高的对比度和更详细的图像。水浸物镜是首选，因为水或缓冲液与生物组织更相容。
6. 将显微镜的物镜降低到水中并聚焦在肺表面。
7. 激活底板加热器并将温度保持在 35-37 °C。
   注意：如果担心无法维持组织温度或无法对肺部进行足够的灌注，除了底板之外，还可以连接两个额外的阻力器来加热顶板（参见 补充图 1）。
8. 使用所选采集软件采集图像堆栈。
   注意：确保在采集期间房间完全黑暗，这可能涉及使用遮光窗帘/百叶窗和战略性地覆盖所有光源。

5. 视频采集

注意：以下参数可以根据具体实验进行调整。步骤 5.1-5.3 描述了用于 B6 到 B6 的特定参数。Lysm-GFP 小鼠左肺移植，可用作参考指南。

1. 使用视频速率双向扫描仪，将 x-y 扫描尺寸设置为 512 x 512 像素。
2. 使用 xyz 步进单元，获取 21 步 z 堆栈的延时记录，每步平均 10 帧。每个堆栈大约需要 20 秒来采集，其中包括帧平均所需的时间、步进电机移动和检查其位置以及 100 毫秒的延迟。
   注意：本研究中使用的显微镜上的双向扫描仪以 30 帧/秒的视频速率运行。这可能因特定的显微镜设置而异。
3. 获取 80 个连续的 z 堆栈以获得组织实质内白细胞迁移的延时成像。这大约需要 ~27 分钟，每次 20 秒/堆栈。
   注意：应尽量减少堆栈大小、帧平均、激光功率和延时记录的总长度，以防止激光过度暴露于组织。如果使用的荧光报告基因明亮（即 GFP）且激光功率低，则以 20 秒的间隔重复 21 帧平均、512 x 512 像素扫描的 21 步 z 堆栈 ~27 分钟是小鼠可以很好地容忍的。如果需要更长的成像时间，应增加每个堆栈的采集时间以保持总激光曝光相同（即，在 ~1.5 小时内每个堆栈 1 分钟）。这些设置需要根据所使用的荧光报告基因进行优化。
4. 在图像采集结束时对鼠标实施安乐死。为了安乐死，用氯胺酮 （80-100 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （8-10 mg/kg） 麻醉小鼠，然后进行宫颈脱位。典型的成像制剂将很容易保持小鼠活力长达 2 小时。
   注意：要延长此期限，可能需要补充额外的液体、异氟醚麻醉并注意温度调节。
5. 使用 Imaris 完成视频渲染。也可以使用其他成像软件（例如 ImageJ）。
   注意：采集后可以使用对比度增强、平滑和通道算法处理图像，以消除通道串扰。

结果

在 4 °C 下冷缺血储存 1 小时后，我们将 B6 小鼠的左肺原位移植到 B6 中。如上所述，LysM-GFP 小鼠⁴，然后进行活体双光子成像。我们在移植后的两个时间点进行了成像 - 2 小时（图 3A）和 24 小时（图 3B）。在成像前立即注射的 q 点将血管标记为红色。此外，我们可以可视化在 24 小时⁴ 时占据 q...

讨论

1931 年，Maria Göppert-Mayer 在她的博士论文中首次描述了双光子激发，她后来因描述核壳结构而获得诺贝尔物理学奖^22,23。传统的荧光显微镜依赖于单光子激发，其激发波长比发射波长短且能量更高。与单光子显微镜相比，双光子显微镜涉及两个光子同时激发，每个光子的波长都比发射的荧光信号的波长长 24,25,26。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control