移植小鼠肺的活体双光子显微镜检查

摘要

在这里，我们提出了一种使用双光子显微镜对移植的小鼠左肺进行活体内成像的方案。这是实时研究小鼠肺移植后细胞动力学和相互作用的宝贵工具。

摘要

肺移植后的并发症在很大程度上与宿主免疫系统对移植物的反应有关。这种免疫反应受供体细胞和受体细胞之间的串扰调节。更好地了解这些过程依赖于临床前动物模型的使用，并有助于实时研究移植物内免疫细胞运输的能力。活体双光子显微镜可用于对深度达几百微米的组织和器官进行成像，光损伤最小，与单光子共聚焦显微镜相比具有很大的优势。在活体双光子显微镜检查期间选择性使用具有启动子特异性荧光蛋白表达和/或荧光染料标记细胞过继转移的转基因小鼠，可以在其生理环境中对单个细胞进行动态研究。 我们小组开发了一种稳定小鼠肺的技术，这使我们能够对幼稚肺和原位移植肺移植物中的细胞动力学进行成像。该技术允许详细评估脉管系统和间质内的细胞行为，以及检查各种细胞群之间的相互作用。该程序很容易学习并适应研究肺移植后调节炎症和耐受性反应的免疫机制。它也可以扩展到其他致病性肺部疾病的研究。

引言

肺移植是许多患有终末期肺病的患者的最终选择;然而，与其他实体器官移植相比，肺移植后的长期生存率较差。5 年生存率仅为 ~60%-70%¹，而心脏² 和 肾脏分别为 80%-90% 和 85%-90%³。肺移植后的许多并发症，如原发性移植物功能障碍、抗体介导的排斥反应和慢性肺同种异体移植物功能障碍，都是由于宿主对同种异体移植物的免疫反应所致。例如，我们小组已经表明，在移植诱导的缺血再灌注损伤后，中性粒细胞被迅速募集到肺同种异体移植物中，并在血液单核细胞周围形成动态簇⁴。供体细胞和受体细胞之间的串扰是造成有害同种免疫反应的原因 ^5,6,7，^在活体动物模型中研究这些动态细胞相互作用的能力非常宝贵。

双光子显微镜可对高达几百微米的深度进行高分辨率活体成像，同时将组织的光漂白降至最低 ^8,9。它用于各种组织和解剖部位，包括新皮层<....

研究方案

所有动物处理程序均按照美国国立卫生保健和使用实验动物研究所的指导方针进行，并得到华盛顿大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 麻醉和插管

注意：如前所述，进行原位小鼠左肺移植^20,21。将 20-25 g C57BL/6 （B6） 小鼠的肺移植到性别和年龄匹配的 B6 受体中。B6.LysM-GFP 报告小鼠用作选择实验的受体，以可视化中性粒细胞浸润到肺移植物中。受体小鼠可以在肺移植后立即成像。

1. 通过腹膜内施用氯胺酮 （80-100 mg/kg） 和甲苯噻嗪 （8-10 mg/kg） 重新麻醉小鼠。皮下注射缓释丁丙诺啡 （0.5-1.0 mg/kg） 以进一步控制疼痛。通过捏爪子确认足够的麻醉深度。
   注意：如果肺移植和计划的活体成像之间的时间少于两小时，可以用初始剂量的 50% 的氯胺酮重新给药麻醉剂。
2. 用电动剪刀去除整个左胸部的毛发，然后擦拭胸部以去除多余的剪发。
3. 将非药物眼药膏涂抹在小鼠的眼睛上，以防止角膜干燥。
4. 如前所述，用 20 G 血管导管经口气管重新插管小鼠^21<....

讨论

1931 年，Maria Göppert-Mayer 在她的博士论文中首次描述了双光子激发，她后来因描述核壳结构而获得诺贝尔物理学奖^22,23。传统的荧光显微镜依赖于单光子激发，其激发波长比发射波长短且能量更高。与单光子显微镜相比，双光子显微镜涉及两个光子同时激发，每个光子的波长都比发射的荧光信号的波长长 24,25,26。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control