このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、移植したマウスの左肺を2光子顕微鏡で生体内イメージングするプロトコールを紹介します。これは、マウス肺移植後の細胞動態と相互作用をリアルタイムで研究するための貴重なツールです。

要約

肺移植後の合併症は、移植片に反応する宿主の免疫系に大きく関連しています。このような免疫応答は、ドナー細胞とレシピエント細胞の間のクロストークによって制御されます。これらのプロセスをより深く理解するには、前臨床動物モデルの使用に依存しており、移植片内の免疫細胞の輸送をリアルタイムで研究する能力によって支援されます。生体内2光子顕微鏡は、光損傷を最小限に抑えて数百ミクロンまでの深さの組織や臓器を画像化するために使用できるため、単一光子共焦点顕微鏡法よりも大きな利点があります。プロモーター特異的な蛍光タンパク質発現を有するトランスジェニックマウスの選択的使用および/または生体内二光子顕微鏡における蛍光色素標識細胞の養子移入により、生理学的環境内での単一細胞の動的研究が可能になります。 私たちのグループでは、マウスの肺を安定化させる技術を開発し、ナイーブ肺や同所移植された肺移植片の細胞動態を画像化することを可能にしました。この技術により、血管系内および間質内の細胞挙動を詳細に評価できるだけでなく、さまざまな細胞集団間の相互作用を調べることができます。この手順は、肺移植後の炎症反応と寛容性反応を調節する免疫メカニズムを研究するために容易に習得し、適応させることができます。また、他の病原性肺疾患の研究に拡大することもできます。

概要

肺移植は、末期肺疾患に苦しむ多くの患者にとって最終的な選択肢です。しかし、肺移植後の長期生存率は、他の固形臓器移植に比べて劣っています。5年での生存率はわずか60%~70%1ですが、心臓2では80%-90%、腎臓では85%-90%です3。原発性移植片機能障害、抗体媒介性拒絶反応、慢性肺同種移植片機能障害など、肺移植後の多くの合併症は、同種移植片に対する宿主の免疫応答によるものです。例えば、私たちのグループでは、移植による虚血再灌流障害の後、好中球が急速に肺同種移植片に動員され、血液単球を取り囲むダイナミックなクラスターを形成することを示しました4。ドナー細胞とレシピエント細胞との間のクロストークは、有害な同種免疫応答5,6,7の原因であり、生きた動物モデルでこれらの動的な細胞相互作用を研究する能力は非常に貴重です。

二光子顕微鏡は、組織の光退色を最小限に抑えながら、数百ミクロンまでの深さの高解像度の生体内イメージングを可能にする8,9。新皮質10,11、皮膚12,13、腎臓14,15など、さまざまな組織や解剖学的部位に使用されています。最近では、肺や心臓などの非静的臓器に適応しています4,16,17。このプロトコルでは、マウスの同所性左肺移植後の安定化、換気、および灌流された肺移植片を画像化する技術について説明します。移植モデルの主な利点は、ドナーとレシピエントを別々に遺伝子操作できることです。個々の細胞集団は、ノックイン蛍光タンパク質発現、蛍光標識細胞の養子導入5、または細胞特異的マーカー4,16,17,18に結合するための蛍光標識抗体の静脈内注射をしたトランスジェニックマウス株を用いて可視化することができる。

イメージング中に肺を安定させるために、このプロトコルは、肺をカバーガラスに接着することを含むが、他のグループは、カスタムメイドのリバーシブル真空装置19を用いた吸引安定化を記載している。当社のプロトコールには、イメージングの領域が広いことや、顕微鏡ラボで一般的に入手可能な材料(カバーガラスや接着剤など)を使用したセットアップが比較的容易であることなど、いくつかの利点があります。この接着技術は上面で肺を拘束するため、換気運動を減らし、より深いイメージングを可能にすることが期待されます。この生体内イメージング技術により、免疫細胞の挙動や相互作用をリアルタイムで詳細に観察することが可能となり、肺移植後の炎症反応と寛容性反応を調節する免疫機構の研究に貢献しています。

プロトコル

すべての動物取り扱い手順は、国立医療研究所および実験動物の使用ガイドラインに準拠して実施され、ワシントン大学医学部の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1.麻酔と挿管

注:同所性マウス左肺移植は、前述のように行われます20,21。20-25 gのC57BL/6(B6)マウスの肺を、性別および年齢が一致したB6レシピエントに移植します。B6です。LysM-GFPレポーターマウスは、肺移植片への好中球浸潤を視覚化するための特定の実験のレシピエントとして使用されます。レシピエントマウスは、肺移植の直後に画像化することができます。

  1. ケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(8-10 mg / kg)の腹腔内投与でマウスを再麻酔します。.徐放性ブプレノルフィン(0.5-1.0 mg / kg)を皮下投与して、追加の鎮痛剤を投与します。.足をつまんで適切な麻酔の深さを確認します。
    注: 肺移植と計画された生体内イメージングの間の時間が 2 時間未満の場合は、ケタミンの初期用量の 50% で麻酔薬を再投与できます。
  2. 電動バリカンで左胸全体の毛を取り除き、胸部を拭いて余分な刈り取られた毛を取り除きます。
  3. 角膜の乾燥を防ぐために、マウスの目に非薬用眼科軟膏を塗布します。.
  4. 前に説明したように、20G血管カテーテルを使用してマウスを口腔気管に再挿管します21。
  5. 室内の空気で120回/分、潮汐量0.5ccで換気します。
  6. 全手順で1%イソフルオランを気管内に送達します。.
  7. イメージング中に血管を可視化するには、イメージングの少なくとも5分前に、50 μLのリン酸緩衝生理食塩水に20 μLの655 nmノンターゲット量子ドット(qドット)を静脈内注入します。

2. 画像診断のための左肺の外科的準備

  1. マウスを右の横方向の褥瘡の位置に置きます( 図1Aを参照)。
  2. 0.75%のヨウ素と70%のエタノールの混合物で胸部の皮膚を3回消毒します。
  3. 左開胸術(マウス肺移植による)を3番目の肋間腔から再開します( 図1Aを参照)。
  4. 左開胸術部位の皮膚と軟部組織の一部(1.5 cm x 1.5 cm)を切除します( 図1Bを参照)。
  5. 肋骨切除の前に、まず肋骨を ~10 秒間クランプして、任意の微小血管系を血栓にして止血を達成します ( 図 1C、D を参照)。
  6. 3番目 から 5番目の 肋骨の一部を切除して、肺を脱出するのに十分な大きさのイメージング ウィンドウを作成します (頭蓋尾側 ~0.8 cm、前後 ~1.0 cm、 図 1D、E)。
  7. 電気焼灼でリブの端からの追加の出血を止めます。
    注:イメージング期間中の過度の失血を避けるために、肋骨の切断端で止血を達成することが重要です。
  8. 右胸の下に小さな隆起(縦に3回折りたたまれた4 cm x 4 cmのガーゼ)を置きます( 図1Eを参照)。
  9. 綿棒を使用して、肺移植片を胸から持ち上げ、肺の下部を生理食塩水を浸したガーゼの1 cm x 3 cmのストリップに置きます( 図1Fを参照)。
    注:この生理食塩水に浸したガーゼのストリップは、肺の滑りを防ぎ、肺の湿った環境を維持し、切除された肋骨の鋭いエッジから肺を保護し、肺を心臓の動きから分離します。円周イメージングチャンバーを肺に適用すると(図1G、H、セクション3で説明)、イメージング期間中の開いた胸腔からの熱と体液の損失は最小限に抑えられるはずです。

3. イメージングチャンバーの準備

注:イメージングチャンバーはカスタムビルドです( 図2Aを参照)。このイメージングチャンバーは、ベースプレートとトッププレートで構成されており、その間にマウスが配置され、両側にバネ仕掛けのボルトで固定されています(図2B)。天板には直径~2cmの円形の切り欠きがあります。対応するサイズの黒いOリングがトッププレートの前面にあるこの開口部に配置され、対物レンズを保護します(図2C)。天板の裏面には24mm×50mmのカバーガラスを高真空グリースで接着し、防水シールを実現。このカバーガラスは、下の肺に付着し、上にイメージング媒体(すなわち、水)を保持することにより、イメージングウィンドウとして機能します。真空グリースが円形のイメージングウィンドウ内に入らないようにしてください。カバーガラスは、新しいイメージング実験ごとに交換されます。ベースプレートは、熱電対温度プローブを使用して35〜37°Cに加熱されます(図2A)。

  1. 挿管したマウスを、開いた左胸部を上に向けてイメージングチャンバーのベースプレートに置きます( 図1G、Hを参照)。マウスをシルクテープで顔、前足、尻尾に固定します( 図1H および 図2Aを参照)。
  2. トッププレートに取り付けられたカバーガラスの下面( 図2C、下部の灰色の円)に接着剤を塗布し、中央に0.8〜1.0cmの接着剤のない円を残します。
    注:接着剤のない円のサイズとモーションアーティファクトの量との間にはトレードオフがあります。したがって、円の直径は1.0cmを超えないようにすることをお勧めします。
  3. カバーガラスが肺に接触するまでトッププレートを下げ、接着剤が肺の表面に触れます( 図1Gを参照)。
    注:左肺はカバーガラスに接着され、中央にきれいな接着剤のない円が描かれます。
  4. カバーガラスを肺に当て、肺を1〜2秒間膨らませて、接着剤の領域が周囲の組織に付着するようにします。マウスの気管内チューブから人工呼吸器への流出チューブを閉塞することにより、肺の膨張を達成します。
    注:過度の圧外傷を引き起こす可能性があるため、肺を1〜2秒以上膨らませないでください。
  5. 肺組織への圧力を減らすために、トッププレートを少し離します。イメージングウィンドウ内の肺の領域が換気によって動かないようにしてください。
  6. つまみナットを各ボルトに固定して、トッププレートの両端を固定します( 図2Bを参照)。

4. 2光子イメージング

注:生体内顕微鏡検査には、20倍または25倍>1.0NAの水浸対物レンズを備えた固定ステージの正立顕微鏡を使用する必要があります。以下は、この調査で B6 から B6 のセットアップに使用したものです。655 nm q-dot血管標識によるLysM-GFP左肺移植。このプロトコルを適用すると、顕微鏡、レーザー、ダイクロイックフィルターのセットアップを、特定の実験や使用する蛍光レポーターのニーズに基づいて適合させることができます。

  1. 挿管されたレシピエントマウス(B6左肺をB6に移植した状態でイメージングチャンバー全体を配置します。LysM-GFP with 655-nm q-dots)を顕微鏡ステージに装着します( 図2Aを参照)。
  2. 480 nm、560 nm、635 nmの波長のダイクロイックフィルターを使用すると、GFPレポーター、qドット、およびコラーゲンによって生成された第2高調波発生(SHG)信号(445 nm)からの信号を適切に分離できます。これらのフィルターは、特定の実験に基づいて適合させることができます。
    注:コラーゲンによって生成されたSHG信号は、肺胞の空域を表す暗いクレーターのような構造を画定します( 図3の白い矢印を参照)。
  3. チタンサファイアフェムト秒パルスレーザーを890nm(近赤外域内)に設定して励起します。十分な信号を得るためには、できるだけ低いレーザー出力を使用してください。
    注:レーザー設定は、信号分離を最大化するために、特定の実験に合わせて調整する必要があります。
  4. トッププレートのカバーガラスを完全に覆うために~1mLの水を適用し、Oリングとカバーガラスの真空グリースシールによってトッププレートに固定されます( 図1G および 図2Cを参照)。
  5. 顕微鏡で20x >1.0 NA水浸対物レンズを使用します。対物レンズが特定の実験に基づいて適合していることを確認します。
    注意: NAが大きいほど、より多くの光を集め、コントラストを高くし、より詳細な画像を得ることができます。水浸対物レンズは、水またはバッファーが生体組織とより適合性が高いため、好まれます。
  6. 顕微鏡の対物レンズを水中に下げ、肺の表面に焦点を合わせます。
  7. ベースプレートヒーターを作動させ、温度を35〜37°Cに保ちます。
    注:組織温度を維持できない、または肺への適切な灌流ができないという懸念がある場合は、ベースプレートに加えてトッププレートを温めるために2つの追加の抵抗器を取り付けることができます( 補足図1を参照)。
  8. お好みの取得ソフトウェアで画像スタックを取得します。
    注意: 取得中は部屋が完全に暗くなっていることを確認してください。これには、遮光カーテン/ブラインドの使用と、すべての光源の戦略的カバーが含まれる場合があります。

5. ビデオ撮影

注:次のパラメータは、特定の実験に基づいて適合させることができます。手順5.1〜5.3では、B6からB6に使用される特定のパラメータについて説明します。Lysm-GFPマウス左肺移植は、リファレンスガイドとして使用できます。

  1. ビデオレートの双方向スキャナーを使用して、x-y スキャン寸法を 512 x 512 ピクセルに設定します。
  2. xyzステッパーユニットを使用して、21ステップの zスタックのタイムラプス録画を取得し、ステップごとに10フレームの平均化を行います。各スタックの集録には約20秒かかり、これにはフレーム平均化に必要な時間、ステッピングモータが移動してその位置を確認するのに必要な時間、および100msの遅延が含まれます。
    注:この研究で使用した顕微鏡の双方向スキャナーは、30フレーム/秒のビデオレートで動作します。これは、特定の顕微鏡のセットアップによって異なる場合があります。
  3. 80 個の連続した Z スタックを取得して、組織実質内の白血球移動のタイムラプス イメージングを取得します。これには、20 秒/スタックで約 ~27 分かかります。
    注:組織への過度のレーザー曝露を防ぐために、スタックサイズ、フレーム平均化、レーザー出力、およびタイムラプス記録の全長を最小限に抑える必要があります。使用する蛍光レポーターが明るく(GFPなど)、レーザー出力が低い場合、マウスでは、平均10フレーム、512 x 512ピクセルスキャンで21ステップの zスタックを20秒間隔で~27分間繰り返すことができます。より長いイメージング期間が必要な場合は、レーザーの総露光量を一定に保つために、スタックあたりの取得時間を長くする必要があります(つまり、~1.5時間にわたってスタックあたり1分)。これらの設定は、使用する蛍光レポーターに基づいて最適化する必要があります。
  4. 画像取得の最後にマウスを安楽死させます。安楽死させるには、マウスにケタミン(80-100 mg / kg)とキシラジン(8-10 mg / kg)で麻酔をかけ、続いて子宮頸部脱臼を行います。一般的なイメージング調製物は、マウスの生存率を最大2時間容易に維持します。
    注:この期間を延長するには、追加の水分補給、イソフルランによる麻酔、および温度調節への注意が必要になる場合があります。.
  5. Imarisによる完全なビデオレンダリング。他のイメージングソフトウェア(ImageJなど)も使用できます。
    注:画像は、コントラスト強調、スムージング、およびチャネル演算を使用して取得後に処理され、チャネルクロストークを除去できます。

結果

4°Cで1時間の低温虚血保存後、B6マウスからB6マウスに左肺を同所的に移植しました。LysM-GFPマウス4を、次いで上記のように生体内二光子イメージングを行った。移植後の2つの時点でイメージングを行いました-2時間(図3A)と24時間(図3B)です。血管は、イメージングの直前に注入されたqドットによって赤で?...

ディスカッション

2光子励起は、1931年にマリア・ゲッペルト・マイヤー(Maria Göppert-Mayer)が博士論文で初めて発表したもので、彼女は核殻の構造を記述して後にノーベル物理学賞を受賞した22,23。従来の蛍光顕微鏡は、発光波長よりも短くエネルギーの高い励起波長を持つ単一光子励起に依存しています。単一光子顕微鏡法とは対照的に、二?...

開示事項

著者らは、関連する開示を報告していない。

謝辞

この研究は、NIH 1P01AI11650およびFoundation for Barnes-Jewish Hospitalからの助成金によってサポートされています。ワシントン大学医学部のIn vivo Imaging Coreに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.75% povidone-iodineAplicareNDC 52380-0126-2For disinfectant
1-inch 20G IV catheterTerumoSROX2025CAFor endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tapeDurapore3M ID 7100057168To secure mouse in position
20x water immersion long objective lensOlympusN20X-PFH
3M Vetbond glueMedi-Vet.com10872To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dotsThermoFisherQ21021MPFor labeling of blood vessels
70% ethanolSigma AldrichEX0281For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Black O ring (2 cm)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Bolt (2)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laserCoherentN/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)Thomas Scientific1202F63For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)Fine Science Tools13009-12
Dual channel heater controllerWarner InstrumentsTC-344B
Fine scissors (1)Fine Science Tools15040-11
Fixed-stage upright microscopeOlympusBX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)McKesson476709To place under left lung
High vacuum greaseDow CorningN/ATo adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%Sigma Aldrich26675-46-7For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)Hardware storeN/AFor custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicatorsSolon56225To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipperOster078400-020-001
Puralube Vet eye ointmentMedi-Vet.com11897To prevent eye dessiccation
Small animal ventilatorHarvard Apparatus55-0000
Straight forceps (1)Fine Science Tools91113-10
Three channel shutter driverUniblitzVMM-D3Resonant scanner
x.y.z optical stepper motorPrior ScientificOptiScan II
Xylazine 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20For pain control

参考文献

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282 (2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119 (2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36 (2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636 (2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120 (2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700 (2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761 (2021).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved