Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale del polmone sinistro del topo trapiantato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo rappresenta uno strumento prezioso per studiare le dinamiche e le interazioni cellulari in tempo reale dopo il trapianto di polmone murino.

Abstract

Le complicanze dopo il trapianto di polmone sono in gran parte correlate alla risposta del sistema immunitario dell'ospite al trapianto. Tali risposte immunitarie sono regolate dal crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi. Una migliore comprensione di questi processi si basa sull'uso di modelli animali preclinici ed è aiutata dalla capacità di studiare il traffico di cellule immunitarie all'interno del trapianto in tempo reale. La microscopia intravitale a due fotoni può essere utilizzata per l'imaging di tessuti e organi per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotodanno minimo, il che offre un grande vantaggio rispetto alla microscopia confocale a singolo fotone. L'uso selettivo di topi transgenici con espressione proteica fluorescente promotore-specifica e/o il trasferimento adottivo di cellule marcate con colorante fluorescente durante la microscopia intravitale a due fotoni consente lo studio dinamico di singole cellule all'interno del loro ambiente fisiologico. Il nostro gruppo ha sviluppato una tecnica per stabilizzare i polmoni di topo, che ci ha permesso di visualizzare le dinamiche cellulari nei polmoni naïve e negli innesti polmonari trapiantati ortotopicamente. Questa tecnica consente una valutazione dettagliata del comportamento cellulare all'interno del sistema vascolare e nell'interstizio, nonché l'esame delle interazioni tra le varie popolazioni cellulari. Questa procedura può essere facilmente appresa e adattata per studiare i meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie e tollerogeniche dopo il trapianto di polmone. Può anche essere esteso allo studio di altre condizioni polmonari patogene.

Introduzione

Il trapianto di polmone è l'opzione finale per molti pazienti affetti da malattia polmonare allo stadio terminale; Tuttavia, la sopravvivenza a lungo termine dopo il trapianto di polmone è scarsa rispetto ad altri trapianti di organi solidi. La sopravvivenza a 5 anni è solo ~60%-70%¹, rispetto all'80%-90% nei cuori² e all'85%-90% nei reni³. Molte complicanze dopo il trapianto di polmone, come la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto mediato da anticorpi e la disfunzione cronica dell'allotrapianto polmonare, sono dovute alla risposta immunitaria dell'ospit....

Protocollo

Tutte le procedure di manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Washington University School of Medicine.

1. Anestesia e intubazione

NOTA: Viene eseguito il trapianto ortotopico di polmone sinistro di topo, come precedentemente descritto^20,21. I polmoni di topi C57BL/6 (B6) da 20-25 g vengono trapiantati in riceventi di....

Discussione

L'eccitazione a due fotoni è stata descritta per la prima volta nella sua tesi di dottorato da Maria Göppert-Mayer nel 1931, che in seguito vinse il premio Nobel per la fisica per aver descritto la struttura del guscio nucleare^22,23. La microscopia a fluorescenza tradizionale si basa sull'eccitazione di un singolo fotone, con lunghezze d'onda di eccitazione più corte e più elevate rispetto alle lunghezze d'onda di emissione. .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control