Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale del polmone sinistro del topo trapiantato utilizzando la microscopia a due fotoni. Questo rappresenta uno strumento prezioso per studiare le dinamiche e le interazioni cellulari in tempo reale dopo il trapianto di polmone murino.

Abstract

Le complicanze dopo il trapianto di polmone sono in gran parte correlate alla risposta del sistema immunitario dell'ospite al trapianto. Tali risposte immunitarie sono regolate dal crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi. Una migliore comprensione di questi processi si basa sull'uso di modelli animali preclinici ed è aiutata dalla capacità di studiare il traffico di cellule immunitarie all'interno del trapianto in tempo reale. La microscopia intravitale a due fotoni può essere utilizzata per l'imaging di tessuti e organi per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotodanno minimo, il che offre un grande vantaggio rispetto alla microscopia confocale a singolo fotone. L'uso selettivo di topi transgenici con espressione proteica fluorescente promotore-specifica e/o il trasferimento adottivo di cellule marcate con colorante fluorescente durante la microscopia intravitale a due fotoni consente lo studio dinamico di singole cellule all'interno del loro ambiente fisiologico. Il nostro gruppo ha sviluppato una tecnica per stabilizzare i polmoni di topo, che ci ha permesso di visualizzare le dinamiche cellulari nei polmoni naïve e negli innesti polmonari trapiantati ortotopicamente. Questa tecnica consente una valutazione dettagliata del comportamento cellulare all'interno del sistema vascolare e nell'interstizio, nonché l'esame delle interazioni tra le varie popolazioni cellulari. Questa procedura può essere facilmente appresa e adattata per studiare i meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie e tollerogeniche dopo il trapianto di polmone. Può anche essere esteso allo studio di altre condizioni polmonari patogene.

Introduzione

Il trapianto di polmone è l'opzione finale per molti pazienti affetti da malattia polmonare allo stadio terminale; Tuttavia, la sopravvivenza a lungo termine dopo il trapianto di polmone è scarsa rispetto ad altri trapianti di organi solidi. La sopravvivenza a 5 anni è solo ~60%-70%¹, rispetto all'80%-90% nei cuori² e all'85%-90% nei reni³. Molte complicanze dopo il trapianto di polmone, come la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto mediato da anticorpi e la disfunzione cronica dell'allotrapianto polmonare, sono dovute alla risposta immunitaria dell'ospite all'allotrapianto. Ad esempio, il nostro gruppo ha dimostrato che i neutrofili vengono rapidamente reclutati nell'allotrapianto polmonare a seguito di danno da ischemia-riperfusione indotta dal trapianto e formano cluster dinamici che circondano i monociti del sangue⁴. Il crosstalk tra le cellule donatrici e riceventi è responsabile delle risposte alloimmunitarie deleterie ^5,6,7 e la capacità di studiare queste interazioni cellulari dinamiche in un modello animale vivo è inestimabile.

La microscopia a due fotoni consente l'imaging intravitale ad alta risoluzione per profondità fino a diverse centinaia di micron con un fotosbiancamento minimo dei tessuti ^8,9. Viene utilizzato in una varietà di tessuti e siti anatomici, tra cui la neocorteccia^10,11, la pelle^12,13 e il rene ^14,15. Più recentemente, è stato adattato a organi non statici come il polmone e il cuore ^4,16,17. In questo protocollo, descriviamo una tecnica per l'imaging di innesti polmonari stabilizzati, ventilati e perfusi dopo trapianto di polmone sinistro ortotopico murino. Un vantaggio chiave del modello di trapianto è la capacità di manipolare geneticamente il donatore e il ricevente separatamente. Le singole popolazioni cellulari possono essere visualizzate con ceppi di topi transgenici con espressione proteica fluorescente knock-in, trasferimento adottivo di cellule marcate con fluorescenza⁵ o iniezione endovenosa di anticorpi marcati con fluorescenza per legare marcatori specifici della cellula 4,16,17,18.

Al fine di stabilizzare il polmone durante l'imaging, questo protocollo prevede l'incollaggio del polmone a un vetrino di copertura, mentre altri gruppi hanno descritto la stabilizzazione dell'aspirazione utilizzando un dispositivo di vuoto reversibile su misura¹⁹. Il nostro protocollo presenta diversi vantaggi, tra cui un'area di imaging più ampia e una relativa facilità di configurazione utilizzando materiali comunemente disponibili in un laboratorio di microscopia (inclusi vetrino coprioggetto e colla). Poiché questa tecnica di incollaggio vincola il polmone sulla superficie superiore, si prevede che riduca il movimento ventilatorio e consenta un imaging più profondo. Questa tecnica di imaging intravitale consente un'osservazione dettagliata del comportamento e delle interazioni delle cellule immunitarie in tempo reale, contribuendo allo studio dei meccanismi immunitari che regolano le risposte infiammatorie rispetto a quelle tollerogeniche dopo il trapianto di polmone.

Protocollo

Tutte le procedure di manipolazione degli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso la Washington University School of Medicine.

1. Anestesia e intubazione

NOTA: Viene eseguito il trapianto ortotopico di polmone sinistro di topo, come precedentemente descritto^20,21. I polmoni di topi C57BL/6 (B6) da 20-25 g vengono trapiantati in riceventi di B6 di pari sesso ed età. B6. I topi reporter LysM-GFP sono utilizzati come destinatari per esperimenti selezionati per visualizzare l'infiltrazione di neutrofili negli innesti polmonari. I topi riceventi possono essere sottoposti a imaging immediatamente dopo un trapianto di polmone.

1. Anestetizzare nuovamente i topi con somministrazione intraperitoneale di ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (8-10 mg/kg). Somministrare buprenorfina a rilascio prolungato (0,5-1,0 mg/kg) per via sottocutanea per un ulteriore controllo del dolore. Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia con un pizzico di zampa.
   NOTA: Se il tempo tra il trapianto di polmone e l'imaging intravitale pianificato è inferiore a due ore, è possibile ridosare l'anestetico con il 50% della dose iniziale di ketamina.
2. Rimuovere i peli da tutto il torace sinistro utilizzando un tagliacapelli elettrico e strofinare il torace per rimuovere i peli tagliati in eccesso.
3. Applicare un unguento oftalmico non medicato sugli occhi del topo per prevenire l'essiccazione corneale.
4. Reintubare il topo per via orotracheale con un angiocatheter da 20 G, come descritto in precedenza²¹.
5. Ventilare con aria ambiente a una velocità di 120 respiri/min e un volume corrente di 0,5 cc.
6. Erogare l'1% di isofluorano per via endotracheale durante l'intera procedura.
7. Per visualizzare i vasi sanguigni durante l'imaging, iniettare 20 μL di punti quantici non bersaglio (q-dot) da 655 nm in 50 μL di soluzione salina tamponata con fosfato per via endovenosa almeno 5 minuti prima dell'imaging.

2. Preparazione chirurgica del polmone sinistro per l'imaging

1. Posizionare il mouse in posizione di decubito laterale destro (vedi Figura 1A).
2. Disinfettare la pelle del torace con una miscela di iodio allo 0,75% ed etanolo al 70%, tre volte.
3. Riaprire la toracotomia sinistra (da trapianto di polmone di topo) attraverso il terzo spazio intercostale (vedi Figura 1A).
4. Rimuovere una porzione della pelle e dei tessuti molli sopra il sito di toracotomia sinistro, che misura 1,5 cm x 1,5 cm (vedere Figura 1B).
5. Prima della resezione delle costole, clamp prima le costole per ~10 s per trombotizzare qualsiasi microvascolarizzazione per ottenere l'emostasi (vedi Figura 1C, D).
6. Resecare porzioni della 3-5a ^costola per creare una finestra di imaging sufficientemente grande da districare il polmone (~0,8 cm cranio-caudalmente e ~1,0 cm antero-posteriormente, Figura 1D, E).
7. Fermare qualsiasi ulteriore sanguinamento dai bordi delle costole con l'elettrocauterizzazione.
   NOTA: È fondamentale ottenere l'emostasi nel bordo tagliato delle costole per evitare un'eccessiva perdita di sangue durante il periodo di imaging.
8. Posizionare una piccola protuberanza (4 cm x 4 cm, garza piegata longitudinalmente 3 volte) sotto il torace destro (vedi Figura 1E).
9. Utilizzando tamponi di cotone, sollevare l'innesto polmonare dal torace e posizionare la parte inferiore del polmone su una striscia di 1 cm x 3 cm di garza imbevuta di soluzione salina (vedere Figura 1F).
   NOTA: Questa striscia di garza imbevuta di soluzione salina impedisce lo scivolamento del polmone, mantiene un ambiente umido per il polmone, protegge il polmone dai bordi taglienti delle costole resecate e separa il polmone dal movimento cardiaco. Una volta applicata la camera di imaging circonferenziale sul polmone (Figura 1G, H, descritta nella sezione 3), dovrebbe esserci una minima perdita di calore e liquidi dalla cavità toracica aperta durante il periodo di imaging.

3. Preparazione della camera di imaging

NOTA: Una camera di imaging è costruita su misura (vedere la Figura 2A). Questa camera di imaging è costituita da una piastra di base e da una piastra superiore tra le quali il mouse è posizionato e fissato in posizione con bulloni a molla su entrambi i lati (Figura 2B). La piastra superiore contiene un ritaglio circolare di ~2 cm di diametro. Un O-ring nero di dimensioni corrispondenti è posizionato in questa apertura sul lato anteriore della piastra superiore, che proteggerà la lente dell'obiettivo (Figura 2C). Un vetro di copertura da 24 mm x 50 mm viene fatto aderire alla parte posteriore della piastra superiore utilizzando grasso per alto vuoto, che creerà una tenuta stagna. Questo vetro di copertura fungerà da finestra di imaging aderendo al polmone sottostante e tenendo il supporto di imaging (cioè l'acqua) sopra. Assicurarsi che il grasso sottovuoto non penetri all'interno della finestra di imaging circolare. Il vetro di copertura verrà sostituito per ogni nuovo esperimento di imaging. La piastra di base viene riscaldata a 35-37 °C utilizzando una sonda di temperatura a termocoppia (Figura 2A).

1. Posizionare il topo intubato sulla piastra di base della camera di imaging con il torace sinistro aperto rivolto verso l'alto (vedere Figura 1G, H). Fissare il mouse con del nastro di seta sul viso, sulle zampe anteriori e sulla coda (vedere la Figura 1H e la Figura 2A).
2. Applicare la colla sul lato inferiore del vetro di copertura attaccato alla piastra superiore (cerchio grigio nella Figura 2C, in basso), lasciando un cerchio privo di colla di 0,8-1,0 cm al centro.
   NOTA: Esiste un compromesso tra la dimensione del cerchio senza colla e la quantità di artefatto di movimento; Pertanto, si raccomanda che il cerchio non superi 1,0 cm di diametro.
3. Abbassare la piastra superiore fino a quando il vetro di copertura non tocca il polmone, con la colla che tocca la superficie polmonare (vedere Figura 1G).
   NOTA: Il polmone sinistro sarà incollato al vetrino di copertura con un cerchio pulito e privo di colla al centro, che è l'area che verrà ripresa.
4. Tenere il coprioggetto contro il polmone e gonfiare il polmone per 1-2 s in modo che l'area di colla aderisca al tessuto circostante. Realizzare il gonfiaggio polmonare occludendo il tubo di deflusso dal tubo endotracheale del topo al ventilatore.
   NOTA: Non gonfiare il polmone per più di 1-2 secondi, poiché ciò potrebbe causare un barotrauma eccessivo.
5. Staccare leggermente la piastra superiore per ridurre la pressione sul tessuto polmonare. Assicurarsi che l'area del polmone all'interno della finestra di imaging non si muova con la ventilazione.
6. Fissare entrambe le estremità della piastra superiore fissando il dado a testa zigrinata su ciascun bullone (vedere la Figura 2B).

4. Imaging a due fotoni

NOTA: Per la microscopia intravitale è necessario utilizzare un microscopio verticale a stadio fisso con un obiettivo a immersione in acqua con apertura numerica (NA) 20x o 25x >1.0. Di seguito è riportata la configurazione utilizzata in questo studio per un B6 a B6. Trapianto di polmone sinistro LysM-GFP con marcatura dei vasi sanguigni q-dot a 655 nm. Quando si applica questo protocollo, la configurazione del microscopio, dei laser e dei filtri dicroici può essere adattata in base alle esigenze dell'esperimento specifico e dei reporter fluorescenti utilizzati.

1. Posizionare l'intera camera di imaging con il topo ricevente intubato (polmone sinistro B6 trapiantato in B6. LysM-GFP con q-dot da 655 nm) sul tavolino del microscopio (vedi Figura 2A).
2. Utilizzare filtri dicroici di lunghezze d'onda 480 nm, 560 nm e 635 nm, che separeranno in modo appropriato i segnali dal reporter GFP, dai punti q e dal segnale di generazione di seconda armonica (SHG) (445 nm) generato dal collagene. Questi filtri possono essere adattati in base all'esperimento specifico.
   NOTA: Il segnale SHG generato dal collagene delimita strutture scure simili a crateri, che rappresentano spazi aerei alveolari (vedi frecce bianche in Figura 3).
3. Impostare il laser pulsato a femtosecondi in titanio-zaffiro su 890 nm (nell'intervallo del vicino infrarosso) per l'eccitazione. Utilizzare la potenza laser più bassa possibile per ottenere un segnale sufficiente.
   NOTA: Le impostazioni del laser devono essere regolate per l'esperimento specifico per massimizzare la separazione del segnale.
4. Applicare ~1 ml di acqua per coprire completamente il vetro di copertura sulla piastra superiore, che sarà tenuto in posizione dall'O-ring e dal paragrasso sottovuoto del vetro di copertura sulla piastra superiore (vedere Figura 1G e Figura 2C).
5. Utilizzare l'obiettivo a immersione in acqua 20x >1.0 NA sul microscopio. Assicurarsi che la lente dell'obiettivo sia adattata in base all'esperimento specifico.
   NOTA: Un NA più grande consente una maggiore raccolta della luce, un contrasto più elevato e immagini più dettagliate. Gli obiettivi ad immersione in acqua sono preferiti in quanto l'acqua o il tampone sono più compatibili con i tessuti biologici.
6. Abbassare l'obiettivo del microscopio nell'acqua e mettere a fuoco la superficie del polmone.
7. Attivare il riscaldatore della piastra di base e mantenere la temperatura a 35-37 °C.
   NOTA: In caso di dubbi sull'incapacità di mantenere la temperatura dei tessuti o un'adeguata perfusione polmonare, è possibile collegare due resistori aggiuntivi per riscaldare la piastra superiore oltre alla piastra di base (vedere la Figura 1 supplementare).
8. Acquisisci stack di immagini con il software di acquisizione preferito.
   NOTA: Assicurarsi che la stanza sia completamente buia durante l'acquisizione, il che può comportare l'uso di tende/persiane oscuranti e una copertura strategica di tutte le fonti di luce.

5. Acquisizione video

NOTA: I seguenti parametri possono essere adattati in base all'esperimento specifico. I passaggi 5.1-5.3 descrivono i parametri specifici utilizzati per i modelli da B6 a B6. Trapianto di polmone sinistro murino Lysm-GFP, che può essere utilizzato come guida di riferimento.

1. Utilizzando uno scanner bidirezionale a velocità video, impostare le dimensioni della scansione x-y su 512 x 512 pixel.
2. Utilizzando un'unità passo-passo xyz, è possibile acquisire registrazioni time-lapse di uno z-stack a 21 step con una media di 10 fotogrammi per step. Ogni stack richiede circa 20 s per l'acquisizione, che include il tempo necessario per la media dei fotogrammi, il motore passo-passo per muoversi e controllare la sua posizione e un ritardo di 100 ms.
   NOTA: Lo scanner bidirezionale sul microscopio utilizzato in questo studio funziona a una velocità video di 30 fotogrammi/s. Questo può variare a seconda della configurazione specifica del microscopio.
3. Acquisisci 80 z-stack consecutivi per ottenere l'imaging time-lapse della migrazione dei leucociti all'interno del parenchima tissutale. Questo richiede circa ~27 minuti a 20 s/stack.
   NOTA: La dimensione della pila, la media dei fotogrammi, la potenza del laser e la lunghezza totale della registrazione time-lapse devono essere ridotte al minimo per evitare un'eccessiva esposizione del laser al tessuto. Se i reporter fluorescenti utilizzati sono luminosi (ad esempio, GFP) e la potenza del laser è bassa, la ripetizione di uno z-stack di 21 passi con una media di 10 fotogrammi, una scansione di 512 x 512 pixel, a intervalli di 20 s per ~27 minuti è ben tollerata dal mouse. Se si desiderano periodi di imaging più lunghi, il tempo di acquisizione per stack deve essere aumentato per mantenere la stessa esposizione laser totale (ad esempio, 1 min per stack su ~1,5 ore). Queste impostazioni dovranno essere ottimizzate in base ai reporter fluorescenti utilizzati.
4. Eutanasia del mouse al termine dell'acquisizione dell'immagine. Per l'eutanasia, anestetizzare il topo con ketamina (80-100 mg/kg) e xilazina (8-10 mg/kg), seguita da una successiva lussazione cervicale. Le preparazioni di imaging tipiche mantengono facilmente la vitalità del topo fino a 2 ore.
   NOTA: Per prolungare questo periodo, potrebbe essere necessaria un'ulteriore integrazione di liquidi, l'anestesia con isoflurano e l'attenzione alla regolazione della temperatura.
5. Rendering video completo con Imaris. È possibile utilizzare anche altri software di imaging (come ImageJ).
   NOTA: Le immagini possono essere elaborate dopo l'acquisizione utilizzando il miglioramento del contrasto, l'attenuazione e l'aritmetica dei canali per rimuovere la diafonia dei canali.

Risultati

Dopo 1 ora di conservazione ischemica a freddo a 4 °C, abbiamo trapiantato ortotopicamente il polmone sinistro da un topo B6 a un B6. LysM-GFP sul topo⁴, e quindi è stato eseguito l'imaging intravitale a due fotoni, come descritto sopra. Abbiamo eseguito l'imaging in due punti temporali dopo il trapianto: 2 ore (Figura 3A) e 24 ore (Figura 3B). I vasi sanguigni sono etichettati in rosso dai punti q inie...

Discussione

L'eccitazione a due fotoni è stata descritta per la prima volta nella sua tesi di dottorato da Maria Göppert-Mayer nel 1931, che in seguito vinse il premio Nobel per la fisica per aver descritto la struttura del guscio nucleare^22,23. La microscopia a fluorescenza tradizionale si basa sull'eccitazione di un singolo fotone, con lunghezze d'onda di eccitazione più corte e più elevate rispetto alle lunghezze d'onda di emissione. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control