Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Özet

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Özet

Akciğer nakli sonrası komplikasyonlar büyük ölçüde grefte yanıt veren konak bağışıklık sistemi ile ilgilidir. Bu tür bağışıklık tepkileri, donör ve alıcı hücreler arasındaki karışma ile düzenlenir. Bu süreçlerin daha iyi anlaşılması, klinik öncesi hayvan modellerinin kullanımına dayanır ve greft içi bağışıklık hücresi trafiğini gerçek zamanlı olarak inceleme becerisi ile desteklenir. İntravital iki foton mikroskobu, tek fotonlu konfokal mikroskopiye göre büyük bir avantaj sağlayan, minimum foto hasarı ile birkaç yüz mikrona kadar derinliklerde doku ve organları görüntülemek için kullanılabilir. İntravital iki foton mikroskobu sırasında promotöre özgü floresan protein ekspresyonu ve/veya floresan boya etiketli hücrelerin evlat edinici transferi ile transgenik farelerin seçici kullanımı, tek hücrelerin fizyolojik ortamlarında dinamik olarak incelenmesine olanak tanır. Grubumuz, fare akciğerlerini stabilize etmek için bir teknik geliştirdi ve bu da naif akciğerlerde ve ortotopik olarak nakledilen pulmoner greftlerde hücresel dinamikleri görüntülememizi sağladı. Bu teknik, vasküler sistem içindeki ve interstisyumdaki hücresel davranışın ayrıntılı olarak değerlendirilmesine ve ayrıca çeşitli hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir. Bu prosedür, akciğer nakli sonrası inflamatuar ve tolerojenik yanıtları düzenleyen bağışıklık mekanizmalarını incelemek için kolayca öğrenilebilir ve uyarlanabilir. Ayrıca diğer patojenik pulmoner durumların incelenmesine de genişletilebilir.

Giriş

Akciğer nakli, son dönem akciğer hastalığından muzdarip birçok hasta için son seçenektir; Ancak akciğer nakli sonrası uzun dönem sağkalım diğer solid organ nakillerine göre zayıftır. 5 yılda sağkalım sadece ~%60-70%^1'dir, bu oran kalp^2'de %80-90 ve böbreklerde %85-90'dır³. Akciğer transplantasyonu sonrası primer greft disfonksiyonu, antikor aracılı rejeksiyon ve kronik akciğer allogreft disfonksiyonu gibi birçok komplikasyon, allogrefte karşı konak immün yanıtına bağlıdır. Örneğin, grubumuz, transplantasyona bağlı iskemi-reperfüzyon hasarını takiben nötrofillerin ....

Protokol

Tüm hayvan işleme prosedürleri, Ulusal Sağlık Hizmetleri ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı Enstitüleri yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Anestezi ve entübasyon

NOT: Daha önce tarif edildiği gibi ortotopik fare sol akciğer nakli gerçekleştirilir^20,21. 20-25 g C57BL / 6 (B6) farelerden elde edilen akciğerler, cinsiyet ve yaş uyumlu B6 alıcılarına nakledilir. B6. LysM-GFP raportör f....

Tartışmalar

İki foton uyarımı ilk olarak 1931'de Maria Göppert-Mayer tarafından doktora tezinde tanımlandı ve daha sonra nükleer kabuk yapısını^22,23 tanımladığı için Nobel Fizik Ödülü'nü kazandı. Geleneksel floresan mikroskobu, emisyon dalga boylarından daha kısa ve daha yüksek enerjili uyarma dalga boyları ile tek foton uyarımına dayanır. Tek foton mikroskobunun aksine, iki foton mikroskobu, her biri yayılan flo.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control