Nakledilen Fare Akciğerinin İntravital İki Foton Mikroskobu

Özet

Burada, nakledilen farenin sol akciğerini iki foton mikroskobu kullanarak intravitalal olarak görüntülemek için bir protokol sunuyoruz. Bu, murin akciğer naklini takiben hücresel dinamikleri ve etkileşimleri gerçek zamanlı olarak incelemek için değerli bir araçtır.

Özet

Akciğer nakli sonrası komplikasyonlar büyük ölçüde grefte yanıt veren konak bağışıklık sistemi ile ilgilidir. Bu tür bağışıklık tepkileri, donör ve alıcı hücreler arasındaki karışma ile düzenlenir. Bu süreçlerin daha iyi anlaşılması, klinik öncesi hayvan modellerinin kullanımına dayanır ve greft içi bağışıklık hücresi trafiğini gerçek zamanlı olarak inceleme becerisi ile desteklenir. İntravital iki foton mikroskobu, tek fotonlu konfokal mikroskopiye göre büyük bir avantaj sağlayan, minimum foto hasarı ile birkaç yüz mikrona kadar derinliklerde doku ve organları görüntülemek için kullanılabilir. İntravital iki foton mikroskobu sırasında promotöre özgü floresan protein ekspresyonu ve/veya floresan boya etiketli hücrelerin evlat edinici transferi ile transgenik farelerin seçici kullanımı, tek hücrelerin fizyolojik ortamlarında dinamik olarak incelenmesine olanak tanır. Grubumuz, fare akciğerlerini stabilize etmek için bir teknik geliştirdi ve bu da naif akciğerlerde ve ortotopik olarak nakledilen pulmoner greftlerde hücresel dinamikleri görüntülememizi sağladı. Bu teknik, vasküler sistem içindeki ve interstisyumdaki hücresel davranışın ayrıntılı olarak değerlendirilmesine ve ayrıca çeşitli hücre popülasyonları arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir. Bu prosedür, akciğer nakli sonrası inflamatuar ve tolerojenik yanıtları düzenleyen bağışıklık mekanizmalarını incelemek için kolayca öğrenilebilir ve uyarlanabilir. Ayrıca diğer patojenik pulmoner durumların incelenmesine de genişletilebilir.

Giriş

Akciğer nakli, son dönem akciğer hastalığından muzdarip birçok hasta için son seçenektir; Ancak akciğer nakli sonrası uzun dönem sağkalım diğer solid organ nakillerine göre zayıftır. 5 yılda sağkalım sadece ~%60-70%^1'dir, bu oran kalp^2'de %80-90 ve böbreklerde %85-90'dır³. Akciğer transplantasyonu sonrası primer greft disfonksiyonu, antikor aracılı rejeksiyon ve kronik akciğer allogreft disfonksiyonu gibi birçok komplikasyon, allogrefte karşı konak immün yanıtına bağlıdır. Örneğin, grubumuz, transplantasyona bağlı iskemi-reperfüzyon hasarını takiben nötrofillerin akciğer allogreftine hızla alındığını ve kan monositlerini çevreleyen dinamik kümeler oluşturduğunu göstermiştir⁴. Donör ve alıcı hücreler arasındaki karışma, zararlı alloimmün yanıtlardan ^5,6,7 sorumludur ve bu dinamik hücre etkileşimlerini canlı bir hayvan modelinde inceleme yeteneği paha biçilmezdir.

İki foton mikroskobu, dokuların minimum foto ağartılması ile birkaç yüz mikrona kadar olan derinlikler için yüksek çözünürlüklü intravital görüntülemeye izin verir ^8,9. Neokorteks^10,11, cilt ^12,13 ve böbrek ^14,15 dahil olmak üzere çeşitli doku ve anatomik bölgelerde kullanılır. Daha yakın zamanlarda, akciğer ve kalp gibi statik olmayan organlara uyarlanmıştır ^4,16,17. Bu protokolde, murin ortotopik sol akciğer naklini takiben görüntü stabilize edilmiş, ventilasyonlu ve perfüze edilmiş pulmoner greftlerin görüntülenmesi için bir teknik tarif edilmiştir. Nakil modelinin önemli bir yararı, donör ve alıcıyı ayrı ayrı genetik olarak manipüle etme yeteneğidir. Bireysel hücre popülasyonları, knock-in floresan protein ekspresyonu ile transgenik fare suşları, floresan etiketli hücrelerin⁵ evlat edinici transferi veya hücreye özgü belirteçleri ^4,16,17,18 bağlamak için floresan etiketli antikorların intravenöz enjeksiyonu ile görselleştirilebilir.

Görüntüleme sırasında akciğeri stabilize etmek için, bu protokol akciğerin bir kapak camına yapıştırılmasını içerirken, diğer gruplar özel yapım bir geri dönüşümlü vakum cihazı¹⁹ kullanarak emme stabilizasyonunu tanımlamıştır. Protokolümüzün, daha geniş bir görüntüleme alanı ve bir mikroskopi laboratuvarında yaygın olarak bulunan malzemeleri (kapak camı ve yapıştırıcı dahil) kullanarak göreceli kurulum kolaylığı dahil olmak üzere çeşitli avantajları vardır. Bu yapıştırma tekniği akciğeri üst yüzeyde kısıtladığı için ventilasyon hareketini azaltması ve daha derin görüntülemeye olanak sağlaması beklenir. Bu intravital görüntüleme tekniği, bağışıklık hücresi davranışının ve etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak ayrıntılı bir şekilde gözlemlenmesine olanak tanır ve bu da akciğer naklini takiben inflamatuar ve tolerojenik yanıtları düzenleyen bağışıklık mekanizmalarının incelenmesine katkıda bulunur.

Protokol

Tüm hayvan işleme prosedürleri, Ulusal Sağlık Hizmetleri ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı Enstitüleri yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Anestezi ve entübasyon

NOT: Daha önce tarif edildiği gibi ortotopik fare sol akciğer nakli gerçekleştirilir^20,21. 20-25 g C57BL / 6 (B6) farelerden elde edilen akciğerler, cinsiyet ve yaş uyumlu B6 alıcılarına nakledilir. B6. LysM-GFP raportör fareler, akciğer greftlerine nötrofil infiltrasyonunu görselleştirmek için seçilmiş deneyler için alıcı olarak kullanılır. Alıcı fareler, akciğer naklinden hemen sonra görüntülenebilir.

1. İntraperitoneal ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (8-10 mg / kg) uygulamasıyla fareleri yeniden anestezize edin. Ek ağrı kontrolü için sürekli salimli buprenorfin (0.5-1.0 mg / kg) deri altına uygulayın. Bir pençe tutamıyla yeterli anestezi derinliğini onaylayın.
   NOT: Akciğer nakli ile planlanan intravital görüntüleme arasındaki süre iki saatten azsa, başlangıç ketamin dozunun% 50'si ile anestezik yeniden doz alabilir.
2. Elektrikli bir kesme makinesi kullanarak sol göğsün tamamındaki tüyleri alın ve fazla kırpılmış tüyleri çıkarmak için göğsü silin.
3. Kornea kurumasını önlemek için farenin gözlerine ilaçsız oftalmik merhem sürün.
4. Fareyi daha önce tarif edildiği gibi 20 G'lik bir anjiyokateter ile orotrakeal olarak yeniden entübe edin²¹.
5. 120 nefes/dk hızında oda havası ve 0,5 cc tidal hacim ile havalandırın.
6. Tüm prosedür boyunca endotrakeal olarak% 1 izofloran verin.
7. Görüntüleme sırasında kan damarlarını görselleştirmek için, görüntülemeden en az 5 dakika önce intravenöz olarak 50 μL fosfat tamponlu salin içinde 20 μL 655 nm hedeflenmemiş kuantum noktası (q-dots) enjekte edin.

2. Görüntüleme için sol akciğerin cerrahi hazırlığı

1. Fareyi sağ lateral dekübit konumuna getirin (bkz. Şekil 1A).
2. Göğüs derisini üç kez% 0.75 iyot ve% 70 etanol karışımı ile dezenfekte edin.
3. Sol torakotomiyi (fare akciğer naklinden itibaren) üçüncü interkostal boşluktan tekrar açın (bkz. Şekil 1A).
4. Sol torakotomi bölgesi üzerindeki cildin ve yumuşak dokunun 1,5 cm x 1,5 cm ölçülerinde bir kısmını çıkarın (bkz. Şekil 1B).
5. Kaburga rezeksiyonundan önce, hemostaz elde etmek için herhangi bir mikrovaskülatürü tromboze etmek için önce kaburgaları ~ 10 s boyunca klempleyin (bkz. Şekil 1C, D).
6. Akciğeri çıkarmak için yeterince büyük bir görüntüleme penceresi oluşturmak için 3^{. ila 5.} kaburgaların kısımlarını rezeke edin (~ 0.8 cm kraniyokaudal ve ~ 1.0 cm anteroposterior, Şekil 1D, E).
7. Elektrokoter ile kaburga kenarlarından herhangi bir ek kanamayı durdurun.
   NOT: Görüntüleme süresi boyunca aşırı kan kaybını önlemek için kaburgaların kesik kenarında hemostaz elde etmek çok önemlidir.
8. Sağ göğsün altına küçük bir yumru (4 cm x 4 cm gazlı bez 3 kez uzunlamasına katlanır) yerleştirin (bkz. Şekil 1E).
9. Pamuklu çubuklar kullanarak, akciğer greftini göğüsten kaldırın ve akciğerin alt kısmını 1 cm x 3 cm'lik tuzlu suya batırılmış gazlı bez şeridine yerleştirin (bkz. Şekil 1F).
   NOT: Bu tuzlu suya batırılmış gazlı bez şeridi, akciğerin kaymasını önler, akciğer için nemli bir ortam sağlar, akciğeri rezeke edilen kaburgaların keskin kenarlarından korur ve akciğeri kalp hareketinden ayırır. Çevresel görüntüleme odası akciğer üzerine uygulandıktan sonra (Şekil 1G, H, bölüm 3'te açıklanmıştır), görüntüleme süresi boyunca açık göğüs boşluğundan minimum ısı ve sıvı kaybı olmalıdır.

3. Görüntüleme odası hazırlığı

NOT: Bir görüntüleme odası özel olarak üretilmiştir (bkz. Şekil 2A). Bu görüntüleme odası, bir taban plakası ve aralarına farenin yerleştirildiği ve her iki tarafta yaylı cıvatalarla yerine sabitlendiği bir üst plakadan oluşur (Şekil 2B). Üst plaka, ~ 2 cm çapında dairesel bir kesik içerir. Üst plakanın ön tarafındaki bu açıklığa, objektif merceği koruyacak şekilde uygun boyutta siyah bir O halkası yerleştirilir (Şekil 2C). 24 mm x 50 mm'lik bir kapak camı, yüksek vakumlu gres kullanılarak üst plakanın arkasına yapıştırılır, bu da su geçirmez bir sızdırmazlık sağlayacaktır. Bu kapak camı, aşağıdaki akciğere yapışarak ve görüntüleme ortamını (yani su) yukarıda tutarak görüntüleme penceresi görevi görecektir. Dairesel görüntüleme penceresinin içine vakum yağı girmediğinden emin olun. Kapak camı her yeni görüntüleme deneyi için değiştirilecektir. Taban plakası, bir termokupl sıcaklık probu kullanılarak 35-37 °C'ye ısıtılır (Şekil 2A).

1. Entübe fareyi, açık sol göğüs yukarı bakacak şekilde görüntüleme odasının taban plakasına yerleştirin (bkz. Şekil 1G, H). Fareyi ipek bantla yüzüne, ön pençelerine ve kuyruğuna sabitleyin (bkz. Şekil 1H ve Şekil 2A).
2. Üst plakaya takılı kapak camının alt tarafına ( Şekil 2C'de gri daire, altta) yapıştırıcı sürün ve ortada 0.8-1.0 cm'lik tutkalsız bir daire bırakın.
   NOT: Tutkalsız dairenin boyutu ile hareket artefaktının miktarı arasında bir denge vardır; Bu nedenle, dairenin çapının 1.0 cm'yi geçmemesi tavsiye edilir.
3. Yapıştırıcı akciğer yüzeyine temas edecek şekilde kapak camı akciğerle temas edene kadar üst plakayı indirin (bkz. Şekil 1G).
   NOT: Sol akciğer, görüntülenecek alan olan ortada temiz, tutkalsız bir daire ile kapak camına yapıştırılacaktır.
4. Kapak camını akciğere karşı tutun ve yapıştırıcı alanı çevredeki dokuya yapışacak şekilde akciğeri 1-2 saniye şişirin. Fare endotrakeal tüpünden ventilatöre giden çıkış tüpünü tıkayarak akciğer şişirmesini gerçekleştirin.
   NOT: Akciğeri 1-2 saniyeden daha uzun süre şişirmeyin, çünkü bu aşırı barotravmaya neden olabilir.
5. Akciğer dokusu üzerindeki baskıyı azaltmak için üst plakayı hafifçe geri çekin. Görüntüleme penceresi içindeki akciğer alanının ventilasyonla hareket etmediğinden emin olun.
6. Kelebek somunu her bir cıvatanın üzerine sabitleyerek üst plakanın her iki ucunu da sabitleyin (bkz. Şekil 2B).

4. İki fotonlu görüntüleme

NOT: İntravital mikroskopi için 20x veya 25x >1.0 sayısal açıklıklı (NA) suya daldırma objektifine sahip sabit aşamalı, dik bir mikroskop kullanılmalıdır. Aşağıda, bu çalışmada B6 ila B6 için kullanılan kurulum yer almaktadır. LysM-GFP, 655 nm q-dot kan damarı etiketlemeli sol akciğer nakli. Bu protokolü uygularken, mikroskobun, lazerlerin ve dikroik filtrelerin kurulumu, spesifik deneyin ihtiyaçlarına ve kullanılan floresan raportörlere göre uyarlanabilir.

1. Tüm görüntüleme odasını entübe edilmiş alıcı fare (B6 sol akciğer, B6'ya nakledildi. 655 nm q-noktalı LysM-GFP) mikroskop sahnesine (bkz. Şekil 2A).
2. 480 nm, 560 nm ve 635 nm dalga boylarında dikroik filtreler kullanın, bu da sinyalleri GFP raportöründen, q-noktalarından ve kollajen tarafından üretilen ikinci harmonik üretim (SHG) sinyalinden (445 nm) uygun şekilde ayıracaktır. Bu filtreler, belirli deneye göre uyarlanabilir.
   NOT: Kollajen tarafından üretilen SHG sinyali, alveolar hava boşluklarını temsil eden karanlık krater benzeri yapıları sınırlar ( Şekil 3'teki beyaz oklara bakınız).
3. Uyarma için titanyum-safir femtosaniye darbeli lazeri 890 nm'ye (yakın kızılötesi aralık içinde) ayarlayın. Yeterli bir sinyal elde etmek için mümkün olan en düşük lazer gücünü kullanın.
   NOT: Sinyal ayrımını en üst düzeye çıkarmak için lazer ayarları, belirli deney için ayarlanmalıdır.
4. Üst plakadaki kapak camını tamamen kaplamak için ~1 mL su uygulayın, bu O-ring ve kapak camının vakumlu gres contası tarafından üst plakaya yerinde tutulacaktır (bkz. Şekil 1G ve Şekil 2C).
5. Mikroskopta 20x >1.0 NA suya daldırma objektifini kullanın. Objektif merceğin belirli deneye göre uyarlandığından emin olun.
   NOT: Daha büyük NA, daha fazla ışık toplama, daha yüksek kontrast ve daha ayrıntılı görüntüler sağlar. Suya daldırma objektifleri, su veya tampon biyolojik dokularla daha uyumlu olduğu için tercih edilir.
6. Mikroskobun objektifini suya indirin ve akciğerin yüzeyine odaklanın.
7. Taban plakası ısıtıcısını etkinleştirin ve sıcaklığı 35-37 °C'de tutun.
   NOT: Doku sıcaklığının korunamaması veya akciğere yeterli perfüzyon sağlanamaması ile ilgili endişeler varsa, taban plakasına ek olarak üst plakayı ısıtmak için iki ek direnç takılabilir (bkz. Ek Şekil 1).
8. Tercih ettiğiniz edinme yazılımıyla görüntü yığınları elde edin.
   NOT: Karartma perdelerinin/panjurlarının kullanılmasını ve tüm ışık kaynaklarının stratejik olarak örtülmesini gerektirebilecek satın alma sırasında odanın tamamen karanlık olduğundan emin olun.

5. Video edinme

NOT: Aşağıdaki parametreler, belirli deneye göre uyarlanabilir. Adım 5.1-5.3, B6 ila B6 için kullanılan spesifik parametreleri açıklar. Referans kılavuzu olarak kullanılabilecek Lysm-GFP murin sol akciğer nakli.

1. Video hızında çift yönlü bir tarayıcı kullanarak, xy tarama boyutlarını 512 x 512 piksel olarak ayarlayın.
2. Bir xyz step ünitesi kullanarak, adım başına ortalama 10 kare ile 21 adımlı bir z yığınının hızlandırılmış kayıtlarını alın. Her yığının elde edilmesi yaklaşık 20 saniye sürer, bu da kare ortalaması için gereken süreyi, step motorun hareket etmesi ve konumunu kontrol etmesi için gereken süreyi ve 100 ms'lik bir gecikmeyi içerir.
   NOT: Bu çalışmada kullanılan mikroskop üzerindeki çift yönlü tarayıcı, 30 kare/sn video hızında çalışır. Bu, spesifik mikroskop kurulumuna bağlı olarak değişebilir.
3. Doku parankimi içindeki lökosit göçünün hızlandırılmış görüntülemesini elde etmek için 80 ardışık z-yığını elde edin. Bu, 20 s/yığında yaklaşık ~27 dakika sürer.
   NOT: Dokuya aşırı lazer maruziyetini önlemek için yığın boyutu, kare ortalaması, lazer gücü ve hızlandırılmış kaydın toplam uzunluğu en aza indirilmelidir. Kullanılan floresan raportörler parlaksa (yani GFP) ve lazer gücü düşükse, 10 kare ortalama, 512 x 512 piksel tarama ile 21 adımlı bir z yığınını ~27 dakika boyunca 20 saniye aralıklarla tekrarlamak fare tarafından iyi tolere edilir. Daha uzun görüntüleme süreleri isteniyorsa, toplam lazer maruziyetini aynı tutmak için yığın başına alım süresi artırılmalıdır (yani, ~ 1,5 saat boyunca yığın başına 1 dakika). Bu ayarların, kullanılan floresan raporlayıcılara göre optimize edilmesi gerekecektir.
4. Görüntü alımının sonunda fareyi ötenazi yapın. Ötenazi yapmak için, fareyi ketamin (80-100 mg / kg) ve ksilazin (8-10 mg / kg) ile uyuşturun ve ardından servikal çıkık yapın. Tipik görüntüleme hazırlıkları, farenin canlılığını 2 saate kadar kolayca koruyacaktır.
   NOT: Bu süreyi uzatmak için ek sıvı takviyesi, izofluran ile anestezi ve sıcaklık regülasyonuna dikkat edilmesi gerekebilir.
5. Imaris ile video oluşturmayı tamamlayın. Diğer görüntüleme yazılımları (ImageJ gibi) da kullanılabilir.
   NOT: Görüntüler, kanal karışmasını gidermek için kontrast geliştirme, yumuşatma ve kanal aritmetiği kullanılarak çekim sonrasında işlenebilir.

Sonuçlar

4 ° C'de 1 saat soğuk iskemik depolamadan sonra, sol akciğeri bir B6 faresinden ortotopik olarak bir B6'ya naklettik. LysM-GFP fare⁴ ve daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi intravital iki fotonlu görüntüleme gerçekleştirildi. Nakil sonrası 2 saat (Şekil 3A) ve 24 saat (Şekil 3B) olmak üzere iki zaman noktasında görüntüleme gerçekleştirdik. Kan damarları, görüntülemeden hemen ön...

Tartışmalar

İki foton uyarımı ilk olarak 1931'de Maria Göppert-Mayer tarafından doktora tezinde tanımlandı ve daha sonra nükleer kabuk yapısını^22,23 tanımladığı için Nobel Fizik Ödülü'nü kazandı. Geleneksel floresan mikroskobu, emisyon dalga boylarından daha kısa ve daha yüksek enerjili uyarma dalga boyları ile tek foton uyarımına dayanır. Tek foton mikroskobunun aksine, iki foton mikroskobu, her biri yayılan flo...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control