Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes intravitales del pulmón izquierdo del ratón trasplantado utilizando microscopía de dos fotones. Esto representa una herramienta valiosa para estudiar la dinámica celular y las interacciones en tiempo real después del trasplante de pulmón murino.

Resumen

Las complicaciones después del trasplante de pulmón están relacionadas en gran medida con la respuesta del sistema inmunitario del huésped al injerto. Estas respuestas inmunitarias están reguladas por la diafonía entre las células del donante y del receptor. Una mejor comprensión de estos procesos se basa en el uso de modelos animales preclínicos y se ve favorecida por la capacidad de estudiar el tráfico de células inmunitarias intrainjerto en tiempo real. La microscopía intravital de dos fotones se puede utilizar para obtener imágenes de tejidos y órganos a profundidades de hasta varios cientos de micras con un daño fotográfico mínimo, lo que ofrece una gran ventaja sobre la microscopía confocal de un solo fotón. El uso selectivo de ratones transgénicos con expresión de proteínas fluorescentes específicas del promotor y/o transferencia adoptiva de células marcadas con colorantes fluorescentes durante la microscopía intravital de dos fotones permite el estudio dinámico de células individuales dentro de su entorno fisiológico. Nuestro grupo ha desarrollado una técnica para estabilizar pulmones de ratón, que nos ha permitido obtener imágenes de la dinámica celular en pulmones naïve e injertos pulmonares trasplantados ortotópicamente. Esta técnica permite una evaluación detallada del comportamiento celular dentro de la vasculatura y en el intersticio, así como el examen de las interacciones entre varias poblaciones celulares. Este procedimiento se puede aprender y adaptar fácilmente para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan las respuestas inflamatorias y tolerogénicas después del trasplante de pulmón. También puede ampliarse al estudio de otras afecciones pulmonares patogénicas.

Introducción

El trasplante de pulmón es la última opción para muchos pacientes que padecen enfermedad pulmonar terminal; Sin embargo, la supervivencia a largo plazo después del trasplante de pulmón es mala en comparación con otros trasplantes de órganos sólidos. La supervivencia a los 5 años es solo ~60%-70%¹, en comparación con el 80%-90% en los corazones² y el 85%-90% en los riñones³. Muchas complicaciones después del trasplante de pulmón, como la disfunción primaria del injerto, el rechazo mediado por anticuerpos y la disfunción crónica del injerto pulmonar, se deben a la r....

Protocolo

Todos los procedimientos de manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Cuidado de la Salud y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington.

1. Anestesia e intubación

NOTA: Se realiza un trasplante ortotópico de pulmón izquierdo en ratón, como se describió anteriormente^20,21. Los pulmones de ratones C57BL/6 (B6) de 20-25 g se trasplantan ....

Discusión

La excitación de dos fotones fue descrita por primera vez en su tesis doctoral por Maria Göppert-Mayer en 1931, quien más tarde ganó el Premio Nobel de Física por describir la estructura de la capa nuclear^22,23. La microscopía de fluorescencia tradicional se basa en la excitación de un solo fotón, con longitudes de onda de excitación que son más cortas y de mayor energía que las longitudes de onda de emisión. A difere.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control