Microscopía intravital de dos fotones del pulmón de ratón trasplantado

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes intravitales del pulmón izquierdo del ratón trasplantado utilizando microscopía de dos fotones. Esto representa una herramienta valiosa para estudiar la dinámica celular y las interacciones en tiempo real después del trasplante de pulmón murino.

Resumen

Las complicaciones después del trasplante de pulmón están relacionadas en gran medida con la respuesta del sistema inmunitario del huésped al injerto. Estas respuestas inmunitarias están reguladas por la diafonía entre las células del donante y del receptor. Una mejor comprensión de estos procesos se basa en el uso de modelos animales preclínicos y se ve favorecida por la capacidad de estudiar el tráfico de células inmunitarias intrainjerto en tiempo real. La microscopía intravital de dos fotones se puede utilizar para obtener imágenes de tejidos y órganos a profundidades de hasta varios cientos de micras con un daño fotográfico mínimo, lo que ofrece una gran ventaja sobre la microscopía confocal de un solo fotón. El uso selectivo de ratones transgénicos con expresión de proteínas fluorescentes específicas del promotor y/o transferencia adoptiva de células marcadas con colorantes fluorescentes durante la microscopía intravital de dos fotones permite el estudio dinámico de células individuales dentro de su entorno fisiológico. Nuestro grupo ha desarrollado una técnica para estabilizar pulmones de ratón, que nos ha permitido obtener imágenes de la dinámica celular en pulmones naïve e injertos pulmonares trasplantados ortotópicamente. Esta técnica permite una evaluación detallada del comportamiento celular dentro de la vasculatura y en el intersticio, así como el examen de las interacciones entre varias poblaciones celulares. Este procedimiento se puede aprender y adaptar fácilmente para estudiar los mecanismos inmunológicos que regulan las respuestas inflamatorias y tolerogénicas después del trasplante de pulmón. También puede ampliarse al estudio de otras afecciones pulmonares patogénicas.

Introducción

El trasplante de pulmón es la última opción para muchos pacientes que padecen enfermedad pulmonar terminal; Sin embargo, la supervivencia a largo plazo después del trasplante de pulmón es mala en comparación con otros trasplantes de órganos sólidos. La supervivencia a los 5 años es solo ~60%-70%¹, en comparación con el 80%-90% en los corazones² y el 85%-90% en los riñones³. Muchas complicaciones después del trasplante de pulmón, como la disfunción primaria del injerto, el rechazo mediado por anticuerpos y la disfunción crónica del injerto pulmonar, se deben a la respuesta inmunitaria del huésped al aloinjerto. Por ejemplo, nuestro grupo ha demostrado que los neutrófilos se reclutan rápidamente en el aloinjerto pulmonar después de una lesión por isquemia-reperfusión inducida por un trasplante y forman grupos dinámicos alrededor de los monocitos sanguíneos⁴. La diafonía entre las células donantes y receptoras es responsable de las respuestas aloinmunes deletéreas ^5,6,7, y la capacidad de estudiar estas interacciones celulares dinámicas en un modelo animal vivo es invaluable.

La microscopía de dos fotones permite obtener imágenes intravitales de alta resolución a profundidades de hasta varios cientos de micras con un fotoblanqueo mínimo de los tejidos ^8,9. Se utiliza en una variedad de tejidos y sitios anatómicos, incluyendo el neocórtex^10,11, la piel^12,13 y el riñón^14,15. Más recientemente, se ha adaptado a órganos no estáticos como el pulmón y el corazón ^4,16,17. En este protocolo, describimos una técnica para obtener imágenes de injertos pulmonares estabilizados, ventilados y perfundidos después de un trasplante de pulmón izquierdo ortotópico murino. Un beneficio clave del modelo de trasplante es la capacidad de manipular genéticamente al donante y al receptor por separado. Las poblaciones celulares individuales se pueden visualizar con cepas de ratones transgénicos con expresión de proteínas fluorescentes knock-in, transferencia adoptiva de células marcadas con fluorescencia⁵ o inyección intravenosa de anticuerpos marcados con fluorescencia para unirse a marcadores específicos de células 4,16,17,18.

Con el fin de estabilizar el pulmón durante la toma de imágenes, este protocolo consiste en pegar el pulmón a un cubreobjetos, mientras que otros grupos han descrito la estabilización por succión utilizando un dispositivo de vacío reversible hecho a medida¹⁹. Nuestro protocolo tiene varias ventajas, incluida una mayor área de imágenes y una relativa facilidad de configuración utilizando materiales comúnmente disponibles en un laboratorio de microscopía (incluidos cubreobjetos y pegamento). Dado que esta técnica de pegado restringe el pulmón en la superficie superior, se espera que disminuya el movimiento ventilatorio y permita obtener imágenes más profundas. Esta técnica de imagen intravital permite observar detalladamente el comportamiento y las interacciones de las células inmunitarias en tiempo real, lo que contribuye al estudio de los mecanismos inmunitarios que regulan las respuestas inflamatorias frente a las tolerogénicas tras el trasplante de pulmón.

Protocolo

Todos los procedimientos de manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas de los Institutos Nacionales de Cuidado de la Salud y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington.

1. Anestesia e intubación

NOTA: Se realiza un trasplante ortotópico de pulmón izquierdo en ratón, como se describió anteriormente^20,21. Los pulmones de ratones C57BL/6 (B6) de 20-25 g se trasplantan a receptores B6 del mismo sexo y edad. B6. Los ratones reporteros LysM-GFP se utilizan como receptores para experimentos seleccionados para visualizar la infiltración de neutrófilos en injertos pulmonares. Los ratones receptores pueden ser fotografiados inmediatamente después de un trasplante de pulmón.

1. Reanestesiar ratones con administración intraperitoneal de ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (8-10 mg/kg). Administrar buprenorfina de liberación sostenida (0,5-1,0 mg/kg) por vía subcutánea para un control adicional del dolor. Confirme la profundidad adecuada de la anestesia con un pellizco en la pata.
   NOTA: Si el tiempo entre el trasplante de pulmón y las imágenes intravitales planificadas es inferior a dos horas, puede volver a dosificar el anestésico con el 50% de la dosis inicial de ketamina.
2. Retire el vello de todo el pecho izquierdo con una maquinilla eléctrica y limpie el cofre para eliminar el exceso de pelos recortados.
3. Aplique un ungüento oftálmico no medicado en los ojos del ratón para prevenir la sequedad de la córnea.
4. Reintuble del ratón por vía orotraqueal con un angiocatéter de 20 G, como se ha descrito anteriormente²¹.
5. Ventile con aire ambiental a una velocidad de 120 respiraciones/min y un volumen corriente de 0,5 cc.
6. Administre un 1% de isofluorano por vía endotraqueal durante todo el procedimiento.
7. Para visualizar los vasos sanguíneos durante la obtención de imágenes, inyecte 20 μL de puntos cuánticos no dirigidos (q-dots) de 655 nm en 50 μL de solución salina tamponada con fosfato por vía intravenosa al menos 5 minutos antes de la obtención de imágenes.

2. Preparación quirúrgica del pulmón izquierdo para la obtención de imágenes

1. Coloque el ratón en una posición de decúbito lateral derecho (ver Figura 1A).
2. Desinfecte la piel del pecho con una mezcla de 0,75% de yodo y 70% de etanol, tres veces.
3. Vuelva a abrir la toracotomía izquierda (del trasplante de pulmón de ratón) a través del tercer espacio intercostal (véase la figura 1A).
4. Extraer una porción de la piel y el tejido blando sobre el sitio de la toracotomía izquierda, que mide 1,5 cm x 1,5 cm (véase la figura 1B).
5. Antes de la resección de las costillas, primero pinza las costillas durante ~10 s para trombosecar cualquier microvasculatura y lograr la hemostasia (ver Figura 1C, D).
6. Resecar partes de la^3ª a la^5ª costilla para crear una ventana de imagen lo suficientemente grande como para extraer el pulmón (~0,8 cm craneocaudalmente y ~1,0 cm anteroposterior, Figura 1D, E).
7. Detenga cualquier sangrado adicional de los bordes de las costillas con electrocauterización.
   NOTA: Es fundamental lograr la hemostasia en el borde cortado de las costillas para evitar la pérdida excesiva de sangre durante el período de imagen.
8. Coloque un pequeño bulto (gasa de 4 cm x 4 cm doblada longitudinalmente 3 veces) debajo del tórax derecho (ver Figura 1E).
9. Con hisopos de algodón, eleve el injerto pulmonar fuera del tórax y coloque la cara inferior del pulmón sobre una tira de gasa empapada en solución salina de 1 cm x 3 cm (véase la figura 1F).
   NOTA: Esta tira de gasa empapada en solución salina evita el deslizamiento del pulmón, mantiene un ambiente húmedo para el pulmón, protege el pulmón de los bordes afilados de las costillas resecadas y separa el pulmón del movimiento del corazón. Una vez que la cámara de imagen circunferencial se coloca sobre el pulmón (Figura 1G, H, descrita en la sección 3), debe haber una pérdida mínima de calor y líquido de la cavidad torácica abierta durante el período de imagen.

3. Preparación de la cámara de imágenes

NOTA: Una cámara de imágenes se construye a medida (consulte la Figura 2A). Esta cámara de imágenes consta de una placa base y una placa superior entre las cuales se coloca el mouse y se asegura en su lugar con pernos accionados por resorte a cada lado (Figura 2B). La placa superior contiene un recorte circular de ~2 cm de diámetro. Se coloca una junta tórica negra de tamaño correspondiente en esta abertura en la parte frontal de la placa superior, que protegerá la lente del objetivo (Figura 2C). Un cubreobjetos de 24 mm x 50 mm se adhiere a la parte posterior de la placa superior con grasa de alto vacío, lo que creará un sello hermético. Este cubreobjetos servirá como ventana de diagnóstico por imágenes al adherirse al pulmón por debajo y sostener el medio de diagnóstico por imágenes (es decir, agua) por encima. Asegúrese de que no entre grasa de vacío en la ventana circular de imagen. El cubreobjetos se reemplazará para cada nuevo experimento de imagen. La placa base se calienta a 35-37 °C utilizando una sonda de temperatura de termopar (Figura 2A).

1. Coloque el ratón intubado en la placa base de la cámara de diagnóstico por imágenes con el tórax izquierdo abierto hacia arriba (véase la figura 1G, H). Asegure el ratón con cinta de seda sobre la cara, las patas delanteras y la cola (consulte la Figura 1H y la Figura 2A).
2. Aplique pegamento en la parte inferior del cubreobjetos unido a la placa superior (círculo gris en la Figura 2C, abajo), dejando un círculo sin pegamento de 0,8-1,0 cm en el centro.
   NOTA: Hay una compensación entre el tamaño del círculo sin pegamento y la cantidad de artefacto de movimiento; Por lo tanto, se recomienda que el círculo no supere 1,0 cm de diámetro.
3. Baje la placa superior hasta que el cubreobjetos haga contacto con el pulmón, y el pegamento toque la superficie del pulmón (véase la figura 1G).
   NOTA: El pulmón izquierdo se pegará al cubreobjetos con un círculo limpio y sin pegamento en el medio, que es el área de la que se tomará la imagen.
4. Sostenga el cubreobjetos contra el pulmón e infle el pulmón durante 1-2 segundos para que el área de pegamento se adhiera al tejido circundante. Logre el inflado pulmonar ocluyendo el tubo de salida desde el tubo endotraqueal del ratón hasta el ventilador.
   NOTA: No infle el pulmón durante más de 1-2 segundos, ya que esto puede causar un barotrauma excesivo.
5. Retire ligeramente la placa superior para reducir la presión sobre el tejido pulmonar. Asegúrese de que el área del pulmón dentro de la ventana de diagnóstico por imágenes no se mueva con la ventilación.
6. Asegure ambos extremos de la placa superior asegurando la tuerca de mariposa sobre cada perno (consulte la Figura 2B).

4. Imágenes de dos fotones

NOTA: Para la microscopía intravital se debe utilizar un microscopio vertical de platina fija con un objetivo de inmersión en agua de apertura numérica (NA) de 20x o 25x >1.0. A continuación se muestra la configuración utilizada en este estudio para un B6 a B6. Trasplante de pulmón izquierdo LysM-GFP con marcaje de vasos sanguíneos de 655 nm en puntos q. Al aplicar este protocolo, la configuración del microscopio, los láseres y los filtros dicroicos se pueden adaptar en función de las necesidades del experimento específico y de los reporteros fluorescentes utilizados.

1. Coloque toda la cámara de imagen con el ratón receptor intubado (B6 pulmón izquierdo trasplantado a B6. LysM-GFP con puntos q de 655 nm) en la platina del microscopio (ver Figura 2A).
2. Utilice filtros dicroicos de longitudes de onda de 480 nm, 560 nm y 635 nm, que separarán adecuadamente las señales del reportero GFP, los puntos q y la señal de generación de segundos armónicos (SHG) (445 nm) generada por el colágeno. Estos filtros se pueden adaptar en función del experimento específico.
   NOTA: La señal SHG generada por el colágeno demarca estructuras oscuras en forma de cráter, que representan los espacios aéreos alveolares (ver flechas blancas en la Figura 3).
3. Ajuste el láser pulsado de femtosegundos de titanio-zafiro a 890 nm (dentro del rango del infrarrojo cercano) para la excitación. Utilice la potencia láser más baja posible para lograr una señal suficiente.
   NOTA: La configuración del láser debe ajustarse para el experimento específico para maximizar la separación de la señal.
4. Aplique ~ 1 mL de agua para cubrir completamente el cubreobjetos en la placa superior, que se mantendrá en su lugar mediante la junta tórica y el sello de grasa al vacío del cubreobjetos a la placa superior (consulte la Figura 1G y la Figura 2C).
5. Utilice el objetivo de inmersión en agua 20x >1.0 NA en el microscopio. Asegúrese de que la lente del objetivo se adapte en función del experimento específico.
   NOTA: Una NA más grande permite una mayor recolección de luz, mayor contraste e imágenes más detalladas. Se prefieren los objetivos de inmersión en agua, ya que el agua o el tampón son más compatibles con los tejidos biológicos.
6. Baje el objetivo del microscopio en el agua y concéntrese en la superficie del pulmón.
7. Active el calentador de la placa base y mantenga la temperatura a 35-37 °C.
   NOTA: Si existe preocupación sobre la incapacidad de mantener la temperatura de los tejidos o la perfusión adecuada al pulmón, se pueden colocar dos resistentes adicionales para calentar la placa superior además de la placa base (consulte la Figura complementaria 1).
8. Adquiera pilas de imágenes con el software de adquisición de su elección.
   NOTA: Asegúrese de que la habitación esté completamente oscura durante la adquisición, lo que puede implicar el uso de cortinas/persianas opacas y una cobertura estratégica de todas las fuentes de luz.

5. Adquisición de vídeo

NOTA: Los siguientes parámetros se pueden adaptar en función del experimento específico. En los pasos 5.1-5.3 se describen los parámetros específicos utilizados para los diagramas B6 a B6. Trasplante de pulmón izquierdo murino Lysm-GFP, que puede utilizarse como guía de referencia.

1. Con un escáner bidireccional de velocidad de vídeo, establezca las dimensiones del escaneo x-y en 512 x 512 píxeles.
2. Con una unidad paso a paso xyz, adquiera grabaciones de lapso de tiempo de una pila z de 21 pasos con un promedio de 10 fotogramas por paso. Cada pila tarda unos 20 segundos en adquirirse, lo que incluye el tiempo necesario para el promedio de tramas, el motor paso a paso para moverse y comprobar su posición, y un retraso de 100 ms.
   NOTA: El escáner bidireccional del microscopio utilizado en este estudio funciona a una velocidad de vídeo de 30 fotogramas/s. Esto puede diferir dependiendo de la configuración específica del microscopio.
3. Adquiera 80 pilas z consecutivas para obtener imágenes de lapso de tiempo de la migración de leucocitos dentro del parénquima tisular. Esto tarda unos ~27 minutos a 20 s/pila.
   NOTA: El tamaño de la pila, el promedio de fotogramas, la potencia del láser y la duración total de la grabación de lapso de tiempo deben minimizarse para evitar la exposición excesiva del láser al tejido. Si los reporteros fluorescentes utilizados son brillantes (es decir, GFP) y la potencia del láser es baja, el ratón tolera bien la repetición de una pila z de 21 pasos con un escaneo promedio de 10 fotogramas, 512 x 512 píxeles, a intervalos de 20 s durante ~27 minutos. Si se desean períodos más largos de obtención de imágenes, se debe aumentar el tiempo de adquisición por pila para mantener la exposición total al láser igual (es decir, 1 minuto por pila durante ~ 1,5 h). Estos ajustes deberán optimizarse en función de los reporteros fluorescentes utilizados.
4. Sacrificar al ratón al final de la adquisición de la imagen. Para aplicar la eutanasia, anestesiar al ratón con ketamina (80-100 mg/kg) y xilacina (8-10 mg/kg), seguido de una posterior luxación cervical. Las preparaciones típicas de imágenes mantendrán fácilmente la viabilidad del ratón hasta 2 h.
   NOTA: Para prolongar este período, es posible que se requiera suplementación adicional con líquidos, anestesia con isoflurano y atención a la regulación de la temperatura.
5. Renderizado de video completo con Imaris. También se puede utilizar otro software de imagen (como ImageJ).
   NOTA: Las imágenes se pueden procesar después de la adquisición utilizando la mejora del contraste, el suavizado y la aritmética de canales para eliminar la diafonía de canales.

Resultados

Después de 1 h de almacenamiento isquémico en frío a 4 °C, trasplantamos ortotópicamente el pulmón izquierdo de un ratón B6 a un B6. LysM-GFP en ratón⁴, y luego se realizaron imágenes intravitales de dos fotones, como se describió anteriormente. Realizamos imágenes en dos momentos post-trasplante: 2 h (Figura 3A) y 24 h (Figura 3B). Los vasos sanguíneos están marcados en rojo por los puntos q...

Discusión

La excitación de dos fotones fue descrita por primera vez en su tesis doctoral por Maria Göppert-Mayer en 1931, quien más tarde ganó el Premio Nobel de Física por describir la estructura de la capa nuclear^22,23. La microscopía de fluorescencia tradicional se basa en la excitación de un solo fotón, con longitudes de onda de excitación que son más cortas y de mayor energía que las longitudes de onda de emisión. A difere...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control