Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Komplikationen nach einer Lungentransplantation hängen weitgehend damit zusammen, dass das Immunsystem des Wirts auf das Transplantat reagiert. Solche Immunantworten werden durch die Wechselwirkung zwischen Spender- und Empfängerzellen reguliert. Ein besseres Verständnis dieser Prozesse beruht auf der Verwendung präklinischer Tiermodelle und wird durch die Möglichkeit unterstützt, den Transport von Immunzellen innerhalb der Transplantate in Echtzeit zu untersuchen. Mit der Intravital-Zwei-Photonen-Mikroskopie können Gewebe und Organe für Tiefen von bis zu mehreren hundert Mikrometern mit minimaler Lichtschädigung abgebildet werden, was einen großen Vorteil gegenüber der konfokalen Einzelphotonenmikroskopie darstellt. Die selektive Verwendung transgener Mäuse mit Promotor-spezifischer Fluoreszenzproteinexpression und/oder adoptiver Transfer von fluoreszierenden Farbstoff-markierten Zellen während der intravitalen Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht die dynamische Untersuchung einzelner Zellen in ihrer physiologischen Umgebung. Unsere Gruppe hat eine Technik zur Stabilisierung der Lungen von Mäusen entwickelt, die es uns ermöglicht hat, die zelluläre Dynamik in naiven Lungen und orthotopisch transplantierten Lungentransplantaten abzubilden. Diese Technik ermöglicht eine detaillierte Beurteilung des zellulären Verhaltens innerhalb des Gefäßsystems und im Interstitium sowie die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zellpopulationen. Dieses Verfahren kann leicht erlernt und angepasst werden, um Immunmechanismen zu untersuchen, die entzündliche und tolerogene Reaktionen nach einer Lungentransplantation regulieren. Es kann auch auf die Untersuchung anderer pathogener Lungenerkrankungen ausgeweitet werden.

Einleitung

Die Lungentransplantation ist die letzte Option für viele Patienten, die an einer Lungenerkrankung im Endstadium leiden. Das Langzeitüberleben nach einer Lungentransplantation ist jedoch im Vergleich zu anderen soliden Organtransplantationen schlecht. Die Überlebensrate nach 5 Jahren beträgt nur ~60%-70%¹, verglichen mit 80%-90% bei Herzen² und 85%-90% bei Nieren³. Viele Komplikationen nach einer Lungentransplantation, wie z. B. eine Dysfunktion des primären Transplantats, eine Antikörper-vermittelte Abstoßung und eine chronische Dysfunktion des Lungentransplantat....

Protokoll

Alle Verfahren zum Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Washington University School of Medicine genehmigt.

1. Anästhesie und Intubation

HINWEIS: Eine orthotope Maus-Transplantation der linken Lunge wird durchgeführt, wie zuvor beschrieben^20,21. Lungen von 20-25 g C57BL/6 (B6) Mäusen werden in geschlechtlich und altersgleiche B6-Empfänger tra....

Diskussion

Die Zwei-Photonen-Anregung wurde erstmals 1931 in ihrer Doktorarbeit von Maria Göppert-Mayer beschrieben, die später den Nobelpreis für Physik für die Beschreibung der Kernschalenstruktur erhielt^22,23. Die traditionelle Fluoreszenzmikroskopie beruht auf Einzelphotonenanregung mit Anregungswellenlängen, die kürzer und energiereicher als die Emissionswellenlängen sind. Im Gegensatz zur Einzelphotonenmikroskopie wird bei der .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control