Intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie der transplantierten Mauslunge

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, mit dem die transplantierte linke Lunge der Maus mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie intravital abgebildet werden kann. Dies stellt ein wertvolles Werkzeug dar, um die zelluläre Dynamik und Wechselwirkungen in Echtzeit nach einer Lungentransplantation von Mäusen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Komplikationen nach einer Lungentransplantation hängen weitgehend damit zusammen, dass das Immunsystem des Wirts auf das Transplantat reagiert. Solche Immunantworten werden durch die Wechselwirkung zwischen Spender- und Empfängerzellen reguliert. Ein besseres Verständnis dieser Prozesse beruht auf der Verwendung präklinischer Tiermodelle und wird durch die Möglichkeit unterstützt, den Transport von Immunzellen innerhalb der Transplantate in Echtzeit zu untersuchen. Mit der Intravital-Zwei-Photonen-Mikroskopie können Gewebe und Organe für Tiefen von bis zu mehreren hundert Mikrometern mit minimaler Lichtschädigung abgebildet werden, was einen großen Vorteil gegenüber der konfokalen Einzelphotonenmikroskopie darstellt. Die selektive Verwendung transgener Mäuse mit Promotor-spezifischer Fluoreszenzproteinexpression und/oder adoptiver Transfer von fluoreszierenden Farbstoff-markierten Zellen während der intravitalen Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht die dynamische Untersuchung einzelner Zellen in ihrer physiologischen Umgebung. Unsere Gruppe hat eine Technik zur Stabilisierung der Lungen von Mäusen entwickelt, die es uns ermöglicht hat, die zelluläre Dynamik in naiven Lungen und orthotopisch transplantierten Lungentransplantaten abzubilden. Diese Technik ermöglicht eine detaillierte Beurteilung des zellulären Verhaltens innerhalb des Gefäßsystems und im Interstitium sowie die Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zellpopulationen. Dieses Verfahren kann leicht erlernt und angepasst werden, um Immunmechanismen zu untersuchen, die entzündliche und tolerogene Reaktionen nach einer Lungentransplantation regulieren. Es kann auch auf die Untersuchung anderer pathogener Lungenerkrankungen ausgeweitet werden.

Einleitung

Die Lungentransplantation ist die letzte Option für viele Patienten, die an einer Lungenerkrankung im Endstadium leiden. Das Langzeitüberleben nach einer Lungentransplantation ist jedoch im Vergleich zu anderen soliden Organtransplantationen schlecht. Die Überlebensrate nach 5 Jahren beträgt nur ~60%-70%¹, verglichen mit 80%-90% bei Herzen² und 85%-90% bei Nieren³. Viele Komplikationen nach einer Lungentransplantation, wie z. B. eine Dysfunktion des primären Transplantats, eine Antikörper-vermittelte Abstoßung und eine chronische Dysfunktion des Lungentransplantats, sind auf die Immunantwort des Wirts auf das Allotransplantat zurückzuführen. Zum Beispiel hat unsere Gruppe gezeigt, dass Neutrophile nach einer transplantatinduzierten Ischämie-Reperfusionsverletzung schnell in das Lungenallotransplantat rekrutiert werden und dynamische Cluster bilden, die Blutmonozyten umgeben⁴. Die Wechselwirkung zwischen Spender- und Empfängerzellen ist für schädliche Alloimmunreaktionen verantwortlich ^5,6,7, und die Fähigkeit, diese dynamischen Zellinteraktionen in einem lebenden Tiermodell zu untersuchen, ist von unschätzbarem Wert.

Die Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht eine hochauflösende intravitale Bildgebung für Tiefen von bis zu mehreren hundert Mikrometern mit minimalem Photobleaching des Gewebes ^8,9. Es wird in einer Vielzahl von Geweben und anatomischen Stellen verwendet, einschließlich des Neokortex^10,11, der Haut^12,13 und der Niere^14,15. In jüngerer Zeit wurde es an nicht-statische Organe wie Lunge und Herz angepasst ^4,16,17. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Technik zur bildstabilisierten, beatmeten und perfundierten Lungentransplantate nach einer orthotopen linken Lungentransplantation von Mäusen. Ein wesentlicher Vorteil des Transplantationsmodells ist die Möglichkeit, Spender und Empfänger getrennt voneinander genetisch zu manipulieren. Einzelne Zellpopulationen können mit transgenen Mausstämmen mit Knock-in-Expression fluoreszierender Proteine, adoptivem Transfer von fluoreszenzmarkierten Zellen⁵ oder intravenöser Injektion von fluoreszenzmarkierten Antikörpern zur Bindung zellspezifischer Marker 4,16,17,18 visualisiert werden.

Um die Lunge während der Bildgebung zu stabilisieren, beinhaltet dieses Protokoll das Verkleben der Lunge mit einem Deckglas, während andere Gruppen die Saugstabilisierung mit einem speziell angefertigten reversiblen Vakuumgerät beschrieben haben¹⁹. Unser Protokoll hat mehrere Vorteile, darunter einen größeren Bereich für die Bildgebung und eine relativ einfache Einrichtung mit allgemein verfügbaren Materialien in einem Mikroskopielabor (einschließlich Deckglas und Kleber). Da diese Klebetechnik die Lunge an der oberen Oberfläche einschränkt, wird erwartet, dass sie die Beatmungsbewegung verringert und eine tiefere Bildgebung ermöglicht. Diese intravitale Bildgebungstechnik ermöglicht eine detaillierte Beobachtung des Verhaltens und der Wechselwirkungen von Immunzellen in Echtzeit, was zur Untersuchung von Immunmechanismen beiträgt, die entzündliche und tolerogene Reaktionen nach Lungentransplantationen regulieren.

Protokoll

Alle Verfahren zum Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee an der Washington University School of Medicine genehmigt.

1. Anästhesie und Intubation

HINWEIS: Eine orthotope Maus-Transplantation der linken Lunge wird durchgeführt, wie zuvor beschrieben^20,21. Lungen von 20-25 g C57BL/6 (B6) Mäusen werden in geschlechtlich und altersgleiche B6-Empfänger transplantiert. B6. LysM-GFP-Reportermäuse werden als Empfänger für ausgewählte Experimente verwendet, um die Infiltration von Neutrophilen in Lungentransplantate sichtbar zu machen. Empfängermäuse können unmittelbar nach einer Lungentransplantation abgebildet werden.

1. Reanästhesieren Sie Mäuse mit intraperitonealer Verabreichung von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (8-10 mg/kg). Verabreichen Sie Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung (0,5-1,0 mg/kg) subkutan zur zusätzlichen Schmerzkontrolle. Bestätigen Sie die ausreichende Anästhesietiefe mit einer Pfotenkneife.
   HINWEIS: Wenn die Zeit zwischen der Lungentransplantation und der geplanten intravitalen Bildgebung weniger als zwei Stunden beträgt, kann das Anästhetikum mit 50 % der Anfangsdosis Ketamin erneut dosiert werden.
2. Entfernen Sie die Haare von der gesamten linken Brust mit einer elektrischen Haarschneidemaschine und wischen Sie die Brust ab, um die überschüssigen abgeschnittenen Haare zu entfernen.
3. Tragen Sie eine nicht medikamentöse Augensalbe auf die Augen der Maus auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.
4. Re-intubieren Sie die Maus orotracheal mit einem 20-G-Angiokatheter, wie zuvor beschrieben²¹.
5. Beatmen Sie mit Raumluft mit einer Frequenz von 120 Atemzügen/min und einem Atemzugvolumen von 0,5 cm³.
6. Geben Sie während des gesamten Eingriffs 1 % Isofluoran endotracheal ab.
7. Um Blutgefäße während der Bildgebung sichtbar zu machen, injizieren Sie mindestens 5 Minuten vor der Bildgebung 20 μl 655 nm nicht-zielgerichtete Quantenpunkte (Q-Punkte) in 50 μl phosphatgepufferte Kochsalzlösung intravenös.

2. Chirurgische Vorbereitung der linken Lunge für die Bildgebung

1. Platzieren Sie die Maus in einer rechten seitlichen Dekubitusposition (siehe Abbildung 1A).
2. Desinfizieren Sie die Brusthaut dreimal mit einer Mischung aus 0,75 % Jod und 70 % Ethanol.
3. Öffnen Sie die linke Thorakotomie (aus einer Mauslungentransplantation) durch den dritten Interkostalraum wieder (siehe Abbildung 1A).
4. Entfernen Sie einen Teil der Haut und des Weichgewebes über der linken Thorakotomiestelle mit den Maßen 1,5 cm x 1,5 cm (siehe Abbildung 1B).
5. Vor der Rippenresektion klemmen Sie zunächst die Rippen für ~10 s ein, um die Mikrogefäße zu thrombosieren und eine Blutstillung zu erreichen (siehe Abbildung 1C, D).
6. Sezieren Sie Teile der 3^. bis 5^. Rippe, um ein Bildgebungsfenster zu schaffen, das groß genug ist, um die Lunge zu befreien (~0,8 cm kraniokaudal und ~1,0 cm anteroposterior, Abbildung 1D, E).
7. Stoppen Sie zusätzliche Blutungen aus den Rippenkanten mit Elektrokauter.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine Blutstillung an der Schnittkante der Rippen zu erreichen, um einen übermäßigen Blutverlust während der Bildgebung zu vermeiden.
8. Legen Sie eine kleine Beule (4 cm x 4 cm Gaze 3-fach längs gefaltet) unter die rechte Brust (siehe Abbildung 1E).
9. Heben Sie das Lungentransplantat mit Wattestäbchen aus der Brust und legen Sie den unteren Teil der Lunge auf einen 1 cm x 3 cm großen Streifen mit Kochsalzlösung getränkter Gaze (siehe Abbildung 1F).
   HINWEIS: Dieser Streifen aus mit Kochsalzlösung getränkter Gaze verhindert das Verrutschen der Lunge, sorgt für ein feuchtes Milieu der Lunge, schützt die Lunge vor den scharfen Kanten der resezierten Rippen und trennt die Lunge von der Herzbewegung. Sobald die umlaufende Bildgebungskammer über der Lunge angelegt wird (Abbildung 1G, H, beschrieben in Abschnitt 3), sollte es während der Bildgebung zu minimalen Wärme- und Flüssigkeitsverlusten aus der offenen Brusthöhle kommen.

3. Vorbereitung der Bildgebungskammer

HINWEIS: Eine Bildgebungskammer wird speziell angefertigt (siehe Abbildung 2A). Diese Bildgebungskammer besteht aus einer Grundplatte und einer Deckplatte, zwischen denen die Maus platziert und mit federbelasteten Schrauben auf beiden Seiten befestigt wird (Abbildung 2B). Die obere Platte enthält einen kreisförmigen Ausschnitt mit einem Durchmesser von ~2 cm. In diese Öffnung an der Vorderseite der Deckplatte wird ein entsprechend großer schwarzer O-Ring eingesetzt, der die Objektivlinse schützt (Abbildung 2C). Auf der Rückseite der Deckplatte wird ein 24 mm x 50 mm großes Deckglas mit Hochvakuumfett aufgeklebt, das eine wasserdichte Abdichtung erzeugt. Dieses Deckglas dient als Bildgebungsfenster, indem es an der Lunge unten haftet und das Bildgebungsmedium (d. h. Wasser) oben hält. Stellen Sie sicher, dass kein Vakuumfett in das kreisförmige Bildfenster gelangt. Das Deckglas wird bei jedem neuen bildgebenden Experiment ausgetauscht. Die Grundplatte wird mit einem Thermoelement-Temperaturfühler auf 35-37 °C erhitzt (Abbildung 2A).

1. Platzieren Sie die intubierte Maus mit der offenen linken Brust nach oben auf der Grundplatte der Bildgebungskammer (siehe Abbildung 1G, H). Befestigen Sie die Maus mit Seidenband über Gesicht, Vorderpfoten und Schwanz (siehe Abbildung 1H und Abbildung 2A).
2. Tragen Sie Kleber auf die Unterseite des Deckglases auf, das an der oberen Platte befestigt ist (grauer Kreis in Abbildung 2C, unten), und lassen Sie in der Mitte einen 0,8-1,0 cm großen klebstofffreien Kreis.
   HINWEIS: Es gibt einen Kompromiss zwischen der Größe des klebstofffreien Kreises und der Menge des Bewegungsartefakts. Es wird daher empfohlen, dass der Kreis einen Durchmesser von 1,0 cm nicht überschreitet.
3. Senken Sie die obere Platte ab, bis das Deckglas die Lunge berührt, wobei der Kleber die Lungenoberfläche berührt (siehe Abbildung 1G).
   HINWEIS: Die linke Lunge wird mit einem sauberen, klebstofffreien Kreis in der Mitte auf das Deckglas geklebt, der der Bereich ist, der abgebildet wird.
4. Halten Sie das Deckglas gegen die Lunge und blasen Sie die Lunge 1-2 s lang auf, so dass die Klebefläche am umgebenden Gewebe haftet. Erreichen Sie das Aufblasen der Lunge, indem Sie den Abflussschlauch vom Endotrachealtubus der Maus zum Beatmungsgerät verschließen.
   HINWEIS: Blasen Sie die Lunge nicht länger als 1-2 Sekunden auf, da dies zu einem übermäßigen Barotrauma führen kann.
5. Ziehen Sie sich von der oberen Platte leicht zurück, um den Druck auf das Lungengewebe zu verringern. Stellen Sie sicher, dass sich der Bereich der Lunge innerhalb des Bildgebungsfensters bei der Beatmung nicht bewegt.
6. Befestigen Sie beide Enden der oberen Platte, indem Sie die Rändelmutter über jeder Schraube befestigen (siehe Abbildung 2B).

4. Zwei-Photonen-Bildgebung

HINWEIS: Für die Intravitalmikroskopie sollte ein aufrechtes Mikroskop mit festem Tisch und einem Wasserimmersionsobjektiv mit 20x oder 25x >1,0 numerischer Apertur (NA) verwendet werden. Nachfolgend finden Sie das Setup, das in dieser Studie für einen B6 bis B6 verwendet wurde. LysM-GFP-Transplantat der linken Lunge mit 655-nm-Q-Punkt-Blutgefäßmarkierung. Bei der Anwendung dieses Protokolls kann der Aufbau des Mikroskops, der Laser und der dichroitischen Filter an die Anforderungen des jeweiligen Experiments und die verwendeten Fluoreszenzreporter angepasst werden.

1. Platzieren Sie die gesamte Bildgebungskammer mit der intubierten Empfängermaus (B6, linke Lunge transplantiert in B6. LysM-GFP mit 655 nm q-dots) auf den Mikroskoptisch (siehe Abbildung 2A).
2. Verwenden Sie dichroitische Filter mit den Wellenlängen 480 nm, 560 nm und 635 nm, die die Signale angemessen vom GFP-Reporter, den Q-Dots und dem SHG-Signal (Second Harmonic Generation) (445 nm) trennen, das vom Kollagen erzeugt wird. Diese Filter können je nach Experiment angepasst werden.
   HINWEIS: Das von Kollagen erzeugte SHG-Signal grenzt dunkle kraterartige Strukturen ab, die alveoläre Lufträume darstellen (siehe weiße Pfeile in Abbildung 3).
3. Stellen Sie den gepulsten Titan-Saphir-Femtosekundenlaser für die Anregung auf 890 nm (im Nahinfrarotbereich) ein. Verwenden Sie die geringstmögliche Laserleistung, um ein ausreichendes Signal zu erzielen.
   HINWEIS: Die Lasereinstellungen sollten für das jeweilige Experiment angepasst werden, um die Signaltrennung zu maximieren.
4. Tragen Sie ~1 ml Wasser auf, um das Deckglas auf der Deckplatte vollständig abzudecken, das durch den O-Ring und die Vakuumfettdichtung des Deckglases auf der Deckplatte an Ort und Stelle gehalten wird (siehe Abbildung 1G und Abbildung 2C).
5. Verwenden Sie am Mikroskop das Wasserimmersionsobjektiv 20x >1,0 NA. Stellen Sie sicher, dass die Objektivlinse auf der Grundlage des spezifischen Experiments angepasst wird.
   HINWEIS: Eine größere NA ermöglicht eine bessere Lichterfassung, einen höheren Kontrast und detailliertere Bilder. Wasserimmersionsobjektive werden bevorzugt, da Wasser oder Puffer besser mit biologischem Gewebe kompatibel sind.
6. Senken Sie das Objektiv des Mikroskops ins Wasser und fokussieren Sie auf die Oberfläche der Lunge.
7. Aktivieren Sie die Fußplattenheizung und halten Sie die Temperatur auf 35-37 °C.
   HINWEIS: Wenn Bedenken hinsichtlich der Unfähigkeit bestehen, die Gewebetemperatur oder eine ausreichende Durchblutung der Lunge aufrechtzuerhalten, können zusätzlich zur Basisplatte zwei zusätzliche Widerstände angebracht werden, um die obere Platte zu erwärmen (siehe ergänzende Abbildung 1).
8. Erfassen Sie Bildstapel mit der Erfassungssoftware Ihrer Wahl.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Raum während der Aufnahme vollständig dunkel ist, was die Verwendung von Verdunkelungsvorhängen/Jalousien und eine strategische Abdeckung aller Lichtquellen beinhalten kann.

5. Videoaufnahme

HINWEIS: Die folgenden Parameter können je nach Experiment angepasst werden. In den Schritten 5.1-5.3 werden die spezifischen Parameter beschrieben, die für B6 bis B6 verwendet werden. Lysm-GFP Maus-Transplantation der linken Lunge, die als Referenzhilfe verwendet werden kann.

1. Legen Sie mit einem bidirektionalen Scanner mit Videorate die Abmessungen des XY-Scans auf 512 x 512 Pixel fest.
2. Mit einer xyz-Stepper-Einheit können Sie Zeitrafferaufnahmen eines 21-stufigen Z-Stacks mit einer Mittelung von 10 Frames pro Schritt aufnehmen. Die Erfassung jedes Stacks dauert etwa 20 s, einschließlich der Zeit, die für die Frame-Mittelwertbildung erforderlich ist, des Schrittmotors, um sich zu bewegen und seine Position zu überprüfen, und einer Verzögerung von 100 ms.
   HINWEIS: Der bidirektionale Scanner am Mikroskop, der in dieser Studie verwendet wurde, arbeitet mit einer Videorate von 30 Bildern/s. Dies kann je nach Mikroskopkonfiguration unterschiedlich sein.
3. Erfassen Sie 80 aufeinanderfolgende Z-Stacks, um eine Zeitraffer-Bildgebung der Leukozytenmigration innerhalb des Gewebeparenchyms zu erhalten. Dies dauert ca. ~27 min bei 20 s/Stack.
   HINWEIS: Die Stapelgröße, die Frame-Mittelwertbildung, die Laserleistung und die Gesamtlänge der Zeitrafferaufnahme sollten minimiert werden, um eine übermäßige Laserbelastung des Gewebes zu vermeiden. Wenn die verwendeten Fluoreszenzreporter hell sind (d. h. GFP) und die Laserleistung gering ist, wird die Wiederholung eines 21-stufigen Z-Stacks mit einem durchschnittlichen Scan von 10 Bildern und 512 x 512 Pixeln in 20-s-Intervallen für ~27 Minuten von der Maus gut toleriert. Wenn längere Bildgebungszeiträume gewünscht werden, sollte die Erfassungszeit pro Stapel erhöht werden, um die Gesamtlaserbelichtung gleich zu halten (d. h. 1 min pro Stapel über ~1,5 h). Diese Einstellungen müssen auf der Grundlage der verwendeten Fluoreszenzreporter optimiert werden.
4. Euthanasieren Sie die Maus am Ende der Bildaufnahme. Zur Euthanasie wird die Maus mit Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (8-10 mg/kg) betäubt, gefolgt von einer anschließenden Zervixluxation. Typische Bildgebungsvorbereitungen können die Lebensfähigkeit der Maus problemlos bis zu 2 Stunden lang aufrechterhalten.
   HINWEIS: Um diesen Zeitraum zu verlängern, können eine zusätzliche Flüssigkeitsergänzung, eine Anästhesie mit Isofluran und die Beachtung der Temperaturregulierung erforderlich sein.
5. Vollständiges Video-Rendering mit Imaris. Andere Imaging-Software (z. B. ImageJ) kann ebenfalls verwendet werden.
   HINWEIS: Bilder können nach der Aufnahme mithilfe von Kontrastverbesserung, Glättung und Kanalarithmetik verarbeitet werden, um Kanalübersprechen zu entfernen.

Ergebnisse

Nach 1 h kalter ischämischer Lagerung bei 4 °C transplantierten wir orthotopisch die linke Lunge von einer B6-Maus in eine B6-Maus. LysM-GFP-Maus⁴ und dann wurde eine intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung durchgeführt, wie oben beschrieben. Wir führten die Bildgebung zu zwei Zeitpunkten nach der Transplantation durch - 2 h (Abbildung 3A) und 24 h (Abbildung 3B). Die Blutgefäße werden durch die Q-Punk...

Diskussion

Die Zwei-Photonen-Anregung wurde erstmals 1931 in ihrer Doktorarbeit von Maria Göppert-Mayer beschrieben, die später den Nobelpreis für Physik für die Beschreibung der Kernschalenstruktur erhielt^22,23. Die traditionelle Fluoreszenzmikroskopie beruht auf Einzelphotonenanregung mit Anregungswellenlängen, die kürzer und energiereicher als die Emissionswellenlängen sind. Im Gegensatz zur Einzelphotonenmikroskopie wird bei der ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control