Microscopia intravital de dois fótons do pulmão de camundongo transplantado

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para obter imagens intravitais do pulmão esquerdo de camundongo transplantado usando microscopia de dois fótons. Isso representa uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica e as interações celulares em tempo real após o transplante de pulmão murino.

Resumo

As complicações após o transplante pulmonar estão amplamente relacionadas à resposta do sistema imunológico do hospedeiro ao enxerto. Essas respostas imunes são reguladas por interferência entre células doadoras e receptoras. Uma melhor compreensão desses processos depende do uso de modelos animais pré-clínicos e é auxiliada pela capacidade de estudar o tráfego de células imunes intra-enxerto em tempo real. A microscopia intravital de dois fótons pode ser usada para obter imagens de tecidos e órgãos para profundidades de até várias centenas de mícrons com fotodano mínimo, o que oferece uma grande vantagem sobre a microscopia confocal de fóton único. O uso seletivo de camundongos transgênicos com expressão de proteína fluorescente específica do promotor e/ou transferência adotiva de células marcadas com corante fluorescente durante a microscopia intravital de dois fótons permite o estudo dinâmico de células únicas em seu ambiente fisiológico. Nosso grupo desenvolveu uma técnica para estabilizar pulmões de camundongos, o que nos permitiu obter imagens da dinâmica celular em pulmões virgens e enxertos pulmonares transplantados ortotopicamente. Essa técnica permite uma avaliação detalhada do comportamento celular dentro da vasculatura e no interstício, bem como o exame das interações entre várias populações celulares. Este procedimento pode ser prontamente aprendido e adaptado para estudar os mecanismos imunológicos que regulam as respostas inflamatórias e tolerogênicas após o transplante pulmonar. Também pode ser expandido para o estudo de outras condições pulmonares patogênicas.

Introdução

O transplante de pulmão é a opção final para muitos pacientes que sofrem de doença pulmonar em estágio terminal; no entanto, a sobrevida em longo prazo após o transplante de pulmão é baixa em comparação com outros transplantes de órgãos sólidos. A sobrevida em 5 anos é de apenas ~ 60% -70% ¹, em comparação com 80% -90% nos corações² e 85% -90% nos rins³. Muitas complicações após o transplante pulmonar, como disfunção primária do enxerto, rejeição mediada por anticorpos e disfunção crônica do aloenxerto pulmonar, são devidas à resposta imune do hospedeiro ao aloenxerto. Por exemplo, nosso grupo mostrou que os neutrófilos são rapidamente recrutados para o aloenxerto pulmonar após lesão de isquemia-reperfusão induzida por transplante e formam agrupamentos dinâmicos em torno dos monócitos sanguíneos⁴. A diafonia entre células doadoras e receptoras é responsável por respostas aloimunes deletérias ^5,6,7, e a capacidade de estudar essas interações celulares dinâmicas em um modelo animal vivo é inestimável.

A microscopia de dois fótons permite imagens intravitais de alta resolução para profundidades de até várias centenas de mícrons com fotobranqueamento mínimo dos tecidos ^8,9. É usado em uma variedade de tecidos e locais anatômicos, incluindo o neocórtex^10,11, a pele^12,13 e o rim^14,15. Mais recentemente, foi adaptado para órgãos não estáticos, como pulmão e coração4,16,17. Neste protocolo, descrevemos uma técnica para obter imagens de enxertos pulmonares estabilizados, ventilados e perfundidos após transplante de pulmão esquerdo ortotópico murino. Um dos principais benefícios do modelo de transplante é a capacidade de manipular geneticamente o doador e o receptor separadamente. Populações de células individuais podem ser visualizadas com cepas de camundongos transgênicos com expressão de proteína fluorescente knock-in, transferência adotiva de células marcadas com fluorescência⁵ ou injeção intravenosa de anticorpos marcados com fluorescência para ligar marcadores específicos de células 4,16,17,18.

Para estabilizar o pulmão durante a imagem, esse protocolo envolve a colagem do pulmão a uma lamínula, enquanto outros grupos descreveram a estabilização da sucção usando um dispositivo de vácuo reversível feito sob medida¹⁹. Nosso protocolo tem várias vantagens, incluindo uma área maior de imagem e relativa facilidade de configuração usando materiais comumente disponíveis em um laboratório de microscopia (incluindo lamínula e cola). Como essa técnica de colagem restringe o pulmão na superfície superior, espera-se que diminua o movimento ventilatório e permita imagens mais profundas. Essa técnica de imagem intravital permite a observação detalhada do comportamento e das interações das células imunes em tempo real, o que contribui para o estudo dos mecanismos imunológicos que regulam as respostas inflamatórias versus tolerogênicas após o transplante pulmonar.

Protocolo

Todos os procedimentos de manejo de animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do National Institutes of Health Care and Use of Laboratory Animals e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina da Universidade de Washington.

1. Anestesia e intubação

NOTA: O transplante ortotópico de pulmão esquerdo de camundongo é realizado, conforme descrito anteriormente^20,21. Pulmões de camundongos C57BL/6 (B6) de 20-25 g são transplantados para receptores B6 pareados por sexo e idade. B6. Camundongos repórteres LysM-GFP são usados como receptores para experimentos selecionados para visualizar a infiltração de neutrófilos em enxertos pulmonares. Os camundongos receptores podem ser visualizados imediatamente após um transplante de pulmão.

1. Reanestesiar camundongos com administração intraperitoneal de cetamina (80-100 mg / kg) e xilazina (8-10 mg / kg). Administre buprenorfina de liberação sustentada (0,5-1,0 mg / kg) por via subcutânea para controle adicional da dor. Confirme a profundidade adequada da anestesia com uma pitada da pata.
   NOTA: Se o tempo entre o transplante de pulmão e a imagem intravital planejada for inferior a duas horas, pode-se redosar o anestésico com 50% da dose inicial de cetamina.
2. Remova o cabelo de todo o peito esquerdo usando um aparador elétrico e limpe o peito para remover o excesso de pelos cortados.
3. Aplique pomada oftálmica não medicamentosa nos olhos do camundongo para evitar o ressecamento da córnea.
4. Reintubar o camundongo por via orotraqueal com um angiocateter de 20 G, conforme descrito anteriormente²¹.
5. Ventile com ar ambiente a uma taxa de 120 respirações/min e volume corrente de 0,5 cc.
6. Administre isofluorano a 1% por via endotraqueal durante todo o procedimento.
7. Para visualizar os vasos sanguíneos durante a imagem, injete 20 μL de pontos quânticos não direcionados de 655 nm (q-dots) em 50 μL de solução salina tamponada com fosfato por via intravenosa pelo menos 5 minutos antes da imagem.

2. Preparo cirúrgico do pulmão esquerdo para exames de imagem

1. Coloque o mouse em decúbito lateral direito (consulte a Figura 1A).
2. Desinfete a pele do peito com uma mistura de 0,75% de iodo e 70% de etanol, três vezes.
3. Reabra a toracotomia esquerda (de transplante de pulmão de camundongo) através do terceiro espaço intercostal (ver Figura 1A).
4. Remover uma porção da pele e tecido mole sobre o local da toracotomia esquerda, medindo 1,5 cm x 1,5 cm (ver Figura 1B).
5. Antes da ressecção da costela, primeiro clampeie as costelas por ~ 10 s para trombosar qualquer microvasculatura para obter hemostasia (ver Figura 1C, D).
6. Ressecção porções da^3ª à^5ª costelas para criar uma janela de imagem grande o suficiente para desencarcerar o pulmão (~ 0,8 cm craniocaudalmente e ~ 1,0 cm ântero-posteriormente, Figura 1D, E).
7. Pare qualquer sangramento adicional das bordas das costelas com eletrocautério.
   NOTA: É fundamental obter hemostasia na borda cortada das costelas para evitar perda excessiva de sangue durante o período de imagem.
8. Coloque uma pequena protuberância (gaze de 4 cm x 4 cm dobrada longitudinalmente 3 vezes) sob o peito direito (ver Figura 1E).
9. Usando cotonetes, eleve o enxerto pulmonar para fora do tórax e coloque a parte inferior do pulmão em uma tira de gaze embebida em solução salina de 1 cm x 3 cm (ver Figura 1F).
   NOTA: Esta tira de gaze embebida em solução salina evita o deslizamento do pulmão, mantém um ambiente úmido para o pulmão, protege o pulmão das bordas afiadas das costelas ressecadas e separa o pulmão do movimento do coração. Uma vez que a câmara de imagem circunferencial é aplicada sobre o pulmão (Figura 1G, H, descrita na seção 3), deve haver perda mínima de calor e fluido da cavidade torácica aberta durante o período de imagem.

3. Preparação da câmara de imagem

NOTA: Uma câmara de imagem é construída sob medida (consulte a Figura 2A). Esta câmara de imagem consiste em uma placa de base e uma placa superior entre as quais o mouse é colocado e fixado no lugar com parafusos com mola em ambos os lados (Figura 2B). A placa superior contém um recorte circular medindo ~2 cm de diâmetro. Um anel de vedação preto de tamanho correspondente é colocado nesta abertura na parte frontal da placa superior, que protegerá a lente objetiva (Figura 2C). Uma lamínula de 24 mm x 50 mm é colada na parte de trás da placa superior usando graxa de alto vácuo, o que criará uma vedação à prova d'água. Esta lamínula servirá como janela de imagem, aderindo ao pulmão abaixo e segurando o meio de imagem (ou seja, água) acima. Certifique-se de que nenhuma graxa a vácuo entre na janela circular de imagem. A lamínula será substituída para cada novo experimento de imagem. A placa de base é aquecida a 35-37 °C usando uma sonda de temperatura de termopar (Figura 2A).

1. Coloque o camundongo intubado na placa de base da câmara de imagem com o tórax esquerdo aberto voltado para cima (ver Figura 1G, H). Prenda o mouse com fita adesiva sobre o rosto, patas dianteiras e cauda (consulte a Figura 1H e a Figura 2A).
2. Aplique cola na parte inferior da lamínula fixada na placa superior (círculo cinza na Figura 2C, parte inferior), deixando um círculo sem cola de 0,8-1,0 cm no centro.
   NOTA: Há uma compensação entre o tamanho do círculo sem cola e a quantidade de artefato de movimento; Assim, recomenda-se que o círculo não exceda 1,0 cm de diâmetro.
3. Abaixe a placa superior até que a lamínula entre em contato com o pulmão, com a cola tocando a superfície pulmonar (consulte a Figura 1G).
   NOTA: O pulmão esquerdo será colado à lamínula com um círculo limpo e sem cola no meio, que é a área que será fotografada.
4. Segure a lamínula contra o pulmão e encha o pulmão por 1-2 s para que a área da cola adira ao tecido circundante. Realize a insuflação pulmonar ocluindo o tubo de saída do tubo endotraqueal do camundongo para o ventilador.
   NOTA: Não infle o pulmão por mais de 1-2 segundos, pois isso pode causar barotrauma excessivo.
5. Afaste ligeiramente a placa superior para reduzir a pressão no tecido pulmonar. Certifique-se de que a área do pulmão dentro da janela de imagem não se mova com a ventilação.
6. Prenda ambas as extremidades da placa superior prendendo a porca de aperto manual sobre cada parafuso (consulte a Figura 2B).

4. Imagem de dois fótons

NOTA: Um microscópio vertical de estágio fixo com uma objetiva de imersão em água de abertura numérica (NA) de 20x ou 25x >1,0 deve ser usado para microscopia intravital. Abaixo está a configuração usada neste estudo para um B6 a B6. Transplante de pulmão esquerdo LysM-GFP com marcação de vasos sanguíneos q-dot de 655 nm. Ao aplicar este protocolo, a configuração do microscópio, lasers e filtros dicróicos pode ser adaptada com base nas necessidades do experimento específico e dos repórteres fluorescentes usados.

1. Coloque toda a câmara de imagem com o camundongo receptor intubado (B6 pulmão esquerdo transplantado em B6. LysM-GFP com pontos q de 655 nm) na platina do microscópio (ver Figura 2A).
2. Use filtros dicróicos de comprimentos de onda de 480 nm, 560 nm e 635 nm, que separarão adequadamente os sinais do repórter GFP, pontos q e sinal de geração de segundo harmônico (SHG) (445 nm) gerado pelo colágeno. Esses filtros podem ser adaptados com base no experimento específico.
   NOTA: O sinal SHG gerado pelo colágeno demarca estruturas escuras semelhantes a crateras, que representam espaços aéreos alveolares (veja as setas brancas na Figura 3).
3. Defina o laser pulsado de femtossegundo de titânio-safira para 890 nm (dentro da faixa do infravermelho próximo) para excitação. Use a menor potência de laser possível para obter um sinal suficiente.
   NOTA: As configurações do laser devem ser ajustadas para o experimento específico para maximizar a separação do sinal.
4. Aplique ~ 1 mL de água para cobrir completamente a lamínula na placa superior, que será mantida no lugar pelo O-ring e pela vedação de graxa a vácuo da lamínula na placa superior (consulte a Figura 1G e a Figura 2C).
5. Use a objetiva de imersão em água 20x >1.0 NA no microscópio. Certifique-se de que a lente objetiva seja adaptada com base no experimento específico.
   NOTA: NA maior permite mais coleta de luz, maior contraste e imagens mais detalhadas. As objetivas de imersão em água são preferidas, pois a água ou o tampão são mais compatíveis com os tecidos biológicos.
6. Abaixe a objetiva do microscópio na água e concentre-se na superfície do pulmão.
7. Ative o aquecedor da placa de base e mantenha a temperatura em 35-37 °C.
   NOTA: Se houver preocupações sobre a incapacidade de manter a temperatura do tecido ou perfusão adequada para o pulmão, dois resistentes adicionais podem ser anexados para aquecer a placa superior, além da placa de base (ver Figura 1 suplementar).
8. Adquira pilhas de imagens com o software de aquisição de sua escolha.
   NOTA: Certifique-se de que a sala esteja completamente escura durante a aquisição, o que pode envolver o uso de cortinas/persianas blackout e cobertura estratégica de todas as fontes de luz.

5. Aquisição de vídeo

NOTA: Os seguintes parâmetros podem ser adaptados com base no experimento específico. As etapas 5.1-5.3 descrevem os parâmetros específicos usados para B6 a B6. Transplante de pulmão esquerdo murino Lysm-GFP, que pode ser usado como guia de referência.

1. Usando um scanner bidirecional de taxa de vídeo, defina as dimensões de digitalização x-y para 512 x 512 pixels.
2. Usando uma unidade de passo xyz, adquira gravações de lapso de tempo de uma pilha z de 21 etapas com média de 10 quadros por etapa. Cada pilha leva cerca de 20 s para ser adquirida, o que inclui o tempo necessário para a média do quadro, o motor de passo para se mover e verificar sua posição e um atraso de 100 ms.
   NOTA: O scanner bidirecional no microscópio usado neste estudo opera a uma taxa de vídeo de 30 quadros / s. Isso pode diferir dependendo da configuração específica do microscópio.
3. Adquira 80 pilhas z consecutivas para obter imagens de lapso de tempo da migração de leucócitos dentro do parênquima tecidual. Isso leva cerca de ~ 27 min a 20 s / pilha.
   NOTA: O tamanho da pilha, a média do quadro, a potência do laser e a duração total da gravação de lapso de tempo devem ser minimizados para evitar a exposição excessiva do laser ao tecido. Se os repórteres fluorescentes usados forem brilhantes (ou seja, GFP) e a potência do laser for baixa, repetir uma pilha z de 21 etapas com uma média de 10 quadros, varredura de 512 x 512 pixels, em intervalos de 20 s por ~ 27 min é bem tolerado pelo mouse. Se forem desejados períodos mais longos de imagem, o tempo de aquisição por pilha deve ser aumentado para manter a exposição total do laser igual (ou seja, 1 min por pilha durante ~1,5 h). Essas configurações precisarão ser otimizadas com base nos repórteres fluorescentes usados.
4. Eutanásia do mouse no final da aquisição da imagem. Para eutanasiar, anestesiar o camundongo com cetamina (80−100 mg/kg) e xilazina (8−10 mg/kg), seguida de luxação cervical subsequente. As preparações de imagem típicas manterão facilmente a viabilidade do camundongo por até 2 h.
   NOTA: Para estender esse período, pode ser necessária suplementação adicional de fluidos, anestesia com isoflurano e atenção à regulação da temperatura.
5. Renderização de vídeo completa com Imaris. Outros softwares de imagem (como o ImageJ) também podem ser usados.
   NOTA: As imagens podem ser processadas após a aquisição usando aprimoramento de contraste, suavização e aritmética de canal para remover a diafonia do canal.

Resultados

Após 1 h de armazenamento isquêmico frio a 4 °C, transplantamos ortotopicamente o pulmão esquerdo de um camundongo B6 para um B6. LysM-GFP camundongo⁴ e, em seguida, foi realizada imagem intravital de dois fótons, conforme descrito acima. Realizamos exames de imagem em dois momentos pós-transplante - 2 h (Figura 3A) e 24 h (Figura 3B). Os vasos sanguíneos são marcados em vermelho pelos pontos q in...

Discussão

A excitação de dois fótons foi descrita pela primeira vez em sua tese de doutorado por Maria Göppert-Mayer em 1931, que mais tarde ganhou o Prêmio Nobel de Física por descrever a estrutura da camada nuclear^22,23. A microscopia de fluorescência tradicional depende da excitação de fóton único, com comprimentos de onda de excitação mais curtos e de maior energia do que os comprimentos de onda de emissão. Em contraste c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.75% povidone-iodine	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To secure mouse in position
20x water immersion long objective lens	Olympus	N20X-PFH
3M Vetbond glue	Medi-Vet.com	10872	To glue coverglass to lung
655 nm non-targeted quantum dots	ThermoFisher	Q21021MP	For labeling of blood vessels
70% ethanol	Sigma Aldrich	EX0281	For disinfectant
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231
Black O ring (2 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Bolt (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Brass thumb nut (2)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Chameleon titanium-sapphire femtosecond pulsed laser	Coherent	N/A
Cover glass (24 mm x 50 mm)	Thomas Scientific	1202F63	For custom-built imaging chamber
Curved mosquito clamp (1)	Fine Science Tools	13009-12
Dual channel heater controller	Warner Instruments	TC-344B
Fine scissors (1)	Fine Science Tools	15040-11
Fixed-stage upright microscope	Olympus	BX51WI
Gauze (cut to 1 cm x 3 cm)	McKesson	476709	To place under left lung
High vacuum grease	Dow Corning	N/A	To adhere coverglass onto top plate
Isoflurane 1%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Metal sheet (3 cm x 7 cm)	Hardware store	N/A	For custom-built imaging chamber
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000
Straight forceps (1)	Fine Science Tools	91113-10
Three channel shutter driver	Uniblitz	VMM-D3	Resonant scanner
x.y.z optical stepper motor	Prior Scientific	OptiScan II
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control