هنا ، نصف نظام nucleofection المصمم لتعزيز كفاءة توصيل الجينات في الخلايا الجذعية العصبية الموسعة (NSCs) المعزولة من منطقة تحت البطين للفئران البالغة. تظهر النتائج أن هذه الطريقة تحسن بشكل كبير اضطراب الجينات في NSCs ، متجاوزة فعالية بروتوكولات النقل التقليدية وتعزز معدل بقاء الخلية.
يمكن تحقيق عزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) من المنطقة تحت البطينية (SVZ) لدماغ الفأر البالغ في وسط مكمل بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) وعامل نمو البشرة (EGF) كميتوجين ، مما ينتج عنه مجاميع نسيلية تعرف باسم المجالات العصبية. هذا النظام في المختبر هو أداة قيمة لدراسة إمكانات NSC. يمكن استخدام نقل siRNAs أو الجينات المحمولة في البلازميدات للحث على اضطرابات التعبير الجيني ودراسة بيولوجيا NSC. ومع ذلك ، فإن توصيل الحمض النووي الخارجي إلى مزارع NSC يمثل تحديا بسبب انخفاض كفاءة نقل خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS). هنا ، نقدم نظاما محسنا للنواة يحقق كفاءة عالية في توصيل الجينات في NSCs الموسعة من الفئران البالغة SVZ. لقد أثبتنا أن هذه الطريقة البسيطة نسبيا تعزز اضطراب الجينات في NSCs البالغة ، متجاوزة بروتوكولات النقل التقليدية مع معدلات بقاء تتجاوز 80٪. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة في NSCs الأولية المعزولة ، مما يوفر تقدما حاسما في دراسات وظائف الجينات من خلال التلاعب بالتعبير الجيني عن طريق الضربة القاضية أو الإفراط في التعبير في مزارع الغلاف العصبي.
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) هي خلايا جذعية متعددة القدرات مقيمة في الدماغ. تمتلك هذه الخلايا القدرة على التجديد الذاتي والتمايز إلى السلالات العصبية الثلاثة: الخلايا النجمية ، oligodendrocytes ، والخلايا العصبية1. وبالتالي ، تلعب NSCs دورا حاسما في تكوين الخلايا العصبية للبالغين في الثدييات ، وهي عملية يتم فيها إنشاء خلايا عصبية جديدة في الدماغ2. تتواجد NSCs في الغالب في منطقتين داخل الدماغ البالغ تسمى المنافذ العصبية: المنطقة تحت البطينية (SVZ) على طول جدران البطينين الجانبيين والمنطقة تحت الحبيبية (SGZ) داخل التلفيف المسنن للحصين 3,4. NSCs (المعروفة أيضا باسم الخلايا البائية) في SVZ ، وهي أكثر الأماكن العصبية نشاطا في الفأر البالغ ، تجدد ذاتيا وتنتج أسلاف تضخيم العبور (TAPs أو خلايا C) التي تتمايز لاحقا إلى خلايا عصبية (خلايا A). تهاجر هذه الخلايا العصبية عبر تيار الهجرة المنقاري (RMS) إلى المصابيح الشمية (OB) ، حيث تخضع للتمايز الكامل إلى الخلايا العصبية البينية ، وتندمج في الدوائر الموجودة مسبقا3،4،5،6.
إن فهم التفاعل المعقد للإشارات والإشارات الجزيئية التي تنظم NSCs داخل هذه المنافذ أمر مهم لتسخير إمكاناتها للتطبيقات العلاجية. لهذا الغرض ، تم تطوير طرق مختلفة لدراسة هذه الخلايا ، بدءا من الثقافة الأولية الانتقائية ل NSCs إلى اختيار الخلايا باستخدام علامات السطح7،8،9،10. تفصل هذه المخطوطة عزل وزراعة SVZ NSCs في المختبر باستخدام وسط انتقائي خال من المصل يحتوي على كل من الميتوجينات: عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) وعامل نمو البشرة (EGF). يسهل هذا الوسط تكاثر الخلايا ويحافظ على جذع NSCs التي تم الحصول عليها من SVZ لأدمغة الفئران البالغة التي تشكل في المختبر مجاميع نسيلية ثلاثية الأبعاد وغير ملتصقة تعرف باسم الكرات العصبية9. تعمل ثقافات الغلاف العصبي كمنصة خاضعة للرقابة لمعالجة ودراسة الآليات والعوامل الجزيئية التي تؤثر على انتشار NSC والتجديد الذاتي والتمايز والبقاء على قيد الحياة11. والجدير بالذكر أن عدد الكرات العصبية الأولية التي تشكلت في الثقافة يسمح بتقدير عدد NSCs الموجودة في SVZ في الجسم الحي ، مما يجعلها أداة قوية لدراسة آثار الظروف المختلفة على تجمع NSC للبالغين12,13. وعلاوة على ذلك، بمجرد إنشاء الثقافة الأولية، يمكن لمراكز الأمن القومي أن تولد مجاميع جديدة (كرات عصبية ثانوية) عند المرور عبر الانقسامات المتماثلة في ظل ظروف الانتشار14. وبالتالي ، يمكن استخدام البذر منخفض الكثافة لخلايا الغلاف العصبي الثانوية (الفحص النسيلي) لتقييم معدل التجديد الذاتي لهذه الثقافات4،15،16،17.
على الرغم من إمكانات المجالات العصبية في الكشف عن الآليات التي تحكم تنظيم NSC ، يشكك بعض الباحثين في صحة النتائج في المختبر ، بحجة أن الظروف الاصطناعية التي تنمو فيها الخلايا قد لا تكرر بأمانة البيئة المكروية المعقدة في الجسم الحي للمنافذ العصبية18،19،20،21،22. نقطة أخرى مثيرة للجدل تدور حول عدم التجانس الملحوظ في المجالات العصبية. ومع ذلك ، يعتقد أن هذا التباين يعكس التقسيمات المتماثلة وغير المتماثلة ل NSCs التي تحدث بشكل طبيعي في الجسم الحي23,24. علاوة على ذلك ، دعم التحقق الأخير استخدام ثقافات NSC للتنبؤ بالآليات التي تعمل داخل مكانة SVZ العصبية في الجسم الحي ، وقد أظهرت العديد من الدراسات أن NSCs المستزرعة في المختبر تحافظ بدقة على ملف النسخ الذي لوحظ في الجسم الحي11،25.
لذلك ، لا تعمل ثقافات الغلاف العصبي كطريقة لاستكشاف قدرات انتشار وتمايز NSC فحسب ، بل تقدم أيضا نظاما لدراسة تأثير الجينات التي تحكم بيولوجيا NSC. تقنية محورية للتحقيق في وظيفة الجينات في NSCs هي اضطراب التعبير الجيني. يمكن نقل siRNAs أو الجينات التي يتم توصيلها من خلال البلازميدات إلى مزارع الخلايا ، مما يؤدي إلى ضربة قاضية أو تنظيم الجين المستهدف. يقلل هذا النهج متعدد الاستخدامات بشكل كبير من الوقت والتكلفة مقارنة بإنشاء مزارع باستخدام الفئران بالضربة القاضية المشروطة ، مما يوفر وسيلة واعدة لكشف الأسس الجينية لتكوين الخلايا العصبية واستكشاف الآفاق العلاجية. إن تغيير التعبير عن جينات معينة في NSCs يمكن من تعديل سلوكها ، مما يؤثر على العمليات البيولوجية الحاسمة مثل الانتشار والتمايز والهجرة. ومع ذلك ، فإن احتمال نقل NSCs ، لا سيما داخل المجالات العصبية للفئران ، يمثل تحديات ملحوظة. إن البنية ثلاثية الأبعاد للكرات العصبية تضر بكفاءة النقل ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى انخفاض معدلات توصيل الحمض النووي الخارجي الناجح ، مما يحد من مدى التلاعب الجيني26,27. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر إجراءات النقل بشكل ضار على صلاحية الخلية ووظائفها27. في هذا السياق ، نقدم نظام nucleofection كطريقة للتخفيف من تلف الخلايا ، وتحقيق معدل بقاء مرتفع وضمان فعالية أعلى في فحوصات توصيل الجينات المستخدمة لإزعاج ثقافات NSC.
تهدف هذه المخطوطة إلى توضيح الإجراء الخاص بعزل NSCs وتوسيعها ومعالجتها من مكانة SVZ العصبية البالغة لاضطراب الجينات باستخدام نظام زراعة الغلاف العصبي. تتجاوز هذه الطريقة فعالية بروتوكولات النقل التقليدية ، حيث تقدم معدلات بقاء أعلى بكثير وكفاءة توصيل الجينات المحسنة بين الخلايا المستهدفة.
تمت الموافقة مسبقا على جميع التجارب التي أجريت على من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة فالنسيا وأذنت بها Conselleria de Agricultura و Ganadería y Pesca و Generalitat Valenciana (إسبانيا).
1. الثقافة الأولية للمجالات العصبية
الجدول 1: حلول وسائل الإعلام الثقافية. يتم وصف وصفة وسيط التحكم. يتم إجراء محلول مزيج هرمون مختلط مسبقا. يمكن تحضير محاليل هرمون المخزون مسبقا كما هو موضح وتخزينها عند -20 درجة مئوية. قبل زراعة الخلايا ، استكمل وسط التحكم ب EGF و bFGF لإعداد وسط كامل. يتم توفير مواصفات التخزين والمخزونات وتركيزات العمل لكل مكون. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
2. توسيع ثقافات الغلاف العصبي
الجدول 2: الصفائح والقوارير المستخدمة للزراعة. يتم توفير أبعاد وأحجام ألواح البذر والقوارير الأكثر استخداما. يتضمن الجدول القطر ومنطقة النمو والحجم المتوسط المستخدم لكل وعاء ، إلى جانب مثال على عدد NSCs التي سيتم بذرها في ظل ظروف التمدد (10000 خلية / سم2). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.
3. نواة ثقافات الغلاف العصبي
تتيح ظروف الاستزراع المثلى عزل وتوسيع NSCs المشتقة من SVZ للبالغين في المختبر
كانت ثقافات NSCs المشتقة من SVZ البالغة بمثابة طريقة قيمة في المختبر للتحقيق في الآليات الجزيئية والإشارات المتخصصة التي تنظم NSCs داخل بيئاتها الدقيقة المحددة. تم استخدام فحص الغلاف العصبي الموضح في هذه المخطوطة لفحص عدد NSC داخل SVZ للبالغين. تم عزل أنسجة SVZ من أدمغة الفئران البالغة من العمر 3 أشهر ، وفصلها ، وزراعتها في وسط NSC كامل مع كل من EGF و bFGF أو كل على حدة. بعد 10 أيام في المختبر (DIV) ، تم تحديد العدد الإجمالي للمجالات الأولية التي تشكلت في ظل ظروف الاستزراع الثلاثة المتميزة هذه باستخدام مجهر تباين الطور (الشكل 2A ، B). ومن اللافت للنظر أن النتائج التي توصلنا إليها توضح أن وجود EGF أدى إلى الحد الأقصى لتشكيل المجال الأولي ، وهو ما يتضح من انخفاض عدد المجالات الأولية التي لوحظت في الثقافات مع bFGF فقط (الشكل 2A ، B). لتقييم قدرة التجديد الذاتي ل NSCs في ظل ظروف متوسطة متنوعة ، تم استزراع الخلايا وطلائها بكثافة منخفضة (5 خلايا / ميكرولتر) في وسط مكمل بمجموعات الميتوجين المذكورة أعلاه. كشف القياس الكمي للمجالات الثانوية أن SVZ NSCs تحتاج على الأقل إلى EGF للتجديد الذاتي بكفاءة وأن الجمع بين كل من EGF و bFGF يحسن قدرة الخلايا على التجديد الذاتي (الشكل 2B). علاوة على ذلك ، للحصول على تحليل مفصل لديناميكيات النمو عبر ظروف الوسائط المتنوعة ، تم تسجيل عدد الخلايا التي تم زرعها والحصول عليها من خلال 7 مقاطع. أكدت منحنيات النمو التي تم الحصول عليها من ظروف الوسائط المختلفة أن الثقافات المكملة ب EGF وحدها أو بالاشتراك مع bFGF أظهرت ديناميكيات نمو محسنة مقارنة بالثقافات المكملة فقط ب bFGF (الشكل 2C). بشكل جماعي ، تثبت هذه النتائج أن الاستخدام المتزامن لكل من EGF و bFGF يعزز محصول زراعة NSC في المختبر.
من أجل التحقيق في عدد NSC داخل SVZ عبر أعمار مختلفة بعد الولادة وتقييم تأثير شيخوخة الفئران على كفاءة ثقافة الغلاف العصبي ، تم تشريح أنسجة SVZ من الفئران التي تتراوح أعمارها بين شهر واحد حتى 12 شهرا. والجدير بالذكر أن النتائج التي توصلنا إليها كشفت عن انخفاض كبير في عدد المجالات الأولية مع زيادة العمر ، مما يدل على أقصى قدر من الكفاءة في عدد المجالات في حوالي 2 إلى 4 أشهر من العمر (الشكل 2 د). بالإضافة إلى ذلك ، لتقييم قدرة التجديد الذاتي ل NSCs أثناء الاستزراع الفرعي ، تم استزراع NSCs من الفئران التي تتراوح أعمارها بين 2 إلى 4 أشهر وبذرها بكثافة نسيلية (5 خلايا / ميكرولتر) في وسط كامل. أشار التحديد الكمي لعدد المجالات الثانوية عبر الممرات اللاحقة إلى انخفاض كبير في كفاءة الثقافة على الممرات (الشكل 2ه). بناء على كل هذه الملاحظات ، يوصى بإجراء فحوصات التجديد الذاتي خلال الممرات المبكرة لزيادة تحسين ظروف ثقافة NSC.
Nucleofection هي تقنية عالية الكفاءة لمعالجة التعبير الجيني في NSCs البالغين
بالنظر إلى أن NSCs ليست قابلة للنقل بسهولة ، للتلاعب بالتعبير الجيني ، نقدم هنا بروتوكولا للنواة مع معدل أعلى من توصيل الجينات الناجح دون الحاجة إلى استخدام النقل الفيروسي. بعد تشريح وزراعة SVZs الفردية من الفئران البالغة من العمر 2 إلى 4 أشهر ، تم استخدام NSCs ببلازميد يحمل GFP كما هو موضح (الشكل 3 أ). كشف الكشف عن الخلايا الإيجابية ل GFP بعد يومين من النواة عن كفاءة تتراوح من 30٪ إلى 50٪ ، بما يتفق مع الأدبيات السابقة28. لعزل NSCs بنجاح على وجه التحديد ، تم فرز الخلايا بواسطة FACS بناء على شدة مضان GFP بعد 3 إلى 5 أيام من النواة (الشكل 3A-C). أظهر ما يقرب من 40٪ من الخلايا التي تم تحليلها قبل FACS مستويات عالية من مضان GFP وتم اختيارها لاحقا عن طريق الفرز (الشكل 3C). أظهرت إعادة بذر GFP + NSCs المصنفة أن جميع الخلايا كانت إيجابية GFP ، مما يؤكد صحة طريقة عزل الخلايا القائمة على النواة (الشكل 3D). والجدير بالذكر أن NSCs ذات النواة حافظت على صلاحيتها من خلال الممرات اللاحقة ، مما يؤكد جدوى النواة ل NSCs البالغة. تؤكد هذه النتائج على فعالية الجمع بين النواة و FACS لإنشاء ثقافة نقية من NSCs المعدلة.
كمثال على تعديل الجينات في NSCs البالغة ، تم استخدام توهين الجينات عن طريق نواة الحمض النووي الريبي القصير (sh). على وجه التحديد ، تم استخدام الحمض النووي الريبي shRNA الذي يستهدف جين بولي ببتيد البروتين النووي الريبي النووي الصغير N (Snrpn) ، والذي يحمل مراسل CAG-GFP (SHSNRPN) في ثقافات NSC المشتقة من الفئران البالغة من العمر 2 شهر. تم تأكيد انخفاض تنظيم Snrpn بواسطة qPCR والكيمياء المناعية في الخلايا التي تم نواتها باستخدام بلازميد shSNRPN ولكن ليس للتحكم في بلازميد shSCRAMBLE (الشكل 3E ، F) 29. لتوضيح آثار خفض تنظيم Snrpn على قدرة التجديد الذاتي ل NSC ، تم إجراء اختبار منخفض الكثافة في الخلايا النووية (الشكل 3F ، G). كشف القياس الكمي للكرات العصبية الثانوية في الثقافات النووية عن زيادة قدرة تكوين الغلاف العصبي عند خفض تنظيم Snrpn (الشكل 3G). يؤكد هذا الفحص على قدرة النواة على معالجة التعبير الجيني في NSCs البالغة ، وبشكل أكثر تحديدا ، يحدد دور Snrpn في الحفاظ على الجذعية في NSCs البالغة.
الشكل 1: وصف مفصل لتشريح SVZ. (أ) بعد إزالة دماغ الفأر ، يتم نقل الدماغ بأكمله باستخدام DPBS إلى وسادة سيليكون للتشريح. (ب) إزالة المخيخ والمخيخ من الدماغ باستخدام مشرط. ج: ينقسم الدماغ إلى نصفي الكرة الأرضية لمتابعة عملية التشريح كل على حدة. د: يفتح الدماغ على طول خط الجسم الثفني، ويفصل القشرة والمخطط عن الحصين والحاجز والدماغ البيني، وبذلك يعرض البطينين الجانبيين. (إ-و) تتم إزالة الحصين والحاجز والدماغ البيني بعد الحد البطني للبطينين. (ز-ط) تتم إزالة الأنسجة خارج الأطراف المنضدية والذيلية ل SVZ والقشرة بعد الجسم الثفني. (ي-ك) يتم إمالة الأنسجة بحيث يواجه SVZ جانبيا ، مما يسمح بإزالة الأنسجة المخططة أسفل SVZ. (L) يتم الحصول على قطعة رقيقة من الأنسجة تحتوي على SVZ. تشير الخطوط المتقطعة السوداء إلى موقع القطع. تشير الخطوط المنقطة السوداء إلى موقع SVZ في كل خطوة. الاختصارات: OB = لمبة شمية. CB = المخيخ. شريط المقياس في A-H: 5 مم ؛ في I-L: 3 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: كل من الميتوجين EGF و bFGF ضروريان للثقافة المثلى وتوسيع NSCs في المختبر. (أ) صور مجهرية متباينة الطور لثقافات الغلاف العصبي الأولية والثانوية في وسط NSC مكملة بكل من EGF و bFGF أو كل ميتوجين على حدة. (ب) عدد المجالات الأولية التي تم الحصول عليها لكل فأر ولكل بئر بناء على تكوين الميتوجين لوسط الاستزراع: لا توجد ميتوجينات (رمادي ، ن = 9) ، EGF + bFGF (أزرق ، ن = 33) ، فقط EGF (أخضر ، ن = 20) ، أو فقط bFGF (وردي ، ن = 19 ؛ اللوحة اليسرى). عدد الكرات العصبية الثانوية التي تشكلت بكثافة منخفضة (5 خلايا / ميكرولتر) لكل بئر بناء على تكوين الميتوجين لوسط الاستزراع): لا توجد ميتوجينات (رمادي ، ن = 11) ، bFGF (وردي ، ن = 18) ، EGF (أخضر ، ن = 18) أو EGF + bFGF (أزرق ، ن = 37 ؛ اللوحة اليمنى). تم استخدام اختبار Kruskal-Wallis مع تحليل Dunn اللاحق. (ج) منحنيات النمو التي توضح العدد الإجمالي للخلايا التي تشكلت بعد 8 ممرات في ثقافات الغلاف العصبي المتميزة وفقا للميتوجينات الموجودة في وسط الاستزراع: bFGF (وردي ، ن = 5) ، EGF (أخضر ، ن = 5) أو EGF + bFGF (أزرق ، ن = 10). تم استخدام تحليل الانحدار الخطي. د: عدد الكرات العصبية الأولية المشتقة من فئران فردية تم تشريحها وتفكيكها من في مراحل نمو مختلفة بعد الولادة. تم استخدام تحليل الانحدار الخطي. (ن) بين قوسين. ه: عدد الكرات العصبية الثانوية التي تشكلت بكثافة منخفضة (5 خلايا/ميكرولتر) من خلال الممرات اللاحقة في المختبر لتقييم قدرتها على التجديد الذاتي. تم استخدام اختبار Kruskal-Wallis ، وتم تضمين قيم p: *: p<0.05 ؛ **: ص<0.01; ص<0.001; ص<0.0001.: ملحوظة: غير مهمة. تمثل أشرطة الخطأ SEM. شريط المقياس في A هو 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: رسم تخطيطي لعملية النوة النووية واختيار الخلايا القائمة على FACS للخلايا ذات النواة. (أ) نظرة عامة على عملية النوة النووية واختيار الخلايا القائمة على FACS للخلايا ذات النواة. 1) يتم دمج محلول الحمض النووي البلازميد مع محلول النواة ويضاف إلى الخلايا. ثم ينقل هذا الخليط إلى كفيت لتكوين النواة. 2) يتم إدخال الكوفيت الذي يحتوي على الحمض النووي والخلايا في nucleofector ، حيث يتم تطبيق صدمة كهربائية. بالنسبة لثقافات الغلاف العصبي المعزولة عن SVZ للبالغين ، نوصي باستخدام برنامج A-031 NSC. 3) بعد النواة ، يتم نقل الخلايا إلى قارورة تحتوي على وسط كامل مكمل ب EGF و bFGF. 4) يتم فرز الخلايا بواسطة FACS بناء على تعبير المراسل الموجود في الحمض النووي البلازميدي. 5) تخضع الخلايا المصنفة لمزيد من الثقافة للتجارب اللاحقة. (ب) استراتيجية الاختيار القائمة على FACS وبوابات ل NSCs ذات النواة. أولا ، يتم اختيار الخلايا الحية بناء على FSC-A العالي و SSC-A العالي (الرسم البياني الأيسر) ، ثم يتم التخلص من ثنائيات الخلايا وثلاثة توائم من خلال تحليل معلمات FSC-A مقابل FSC-H (الرسم البياني الأيمن). (ج) بوابات FACS للخلايا ذات النواة بناء على تعبير GFP الخاص بها (مضان SSC-A مقابل FITC-A). (د) الفحص المجهري لتباين الطور وصور مضان GFP ل NSCs ذات النواة قبل (ن = 3) وبعد (ن = 4) اختيار FACS (اللوحة اليسرى). يتم تصوير النسبة المئوية لخلايا GFP + ذات التأثير النووي قبل وبعد اختيار FACS (اللوحة اليمنى). تم استخدام اختبار T. (ه) التحليل الكمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) لتعبير Snrpn في تكاثر NSCs باستخدام shRNA الخاص ب Snrpn (n = 4). كان Nucleofection باستخدام تدافع shRNA بمثابة عنصر تحكم (n = 4). تم استخدام اختبار T. (F) صور الكيمياء الخلوية المناعية التي تعرض SNRPN (باللون الأحمر) في NSCs بعد 7 أيام من نواة shRNA (الألواح الخارجية). تم استخدام DAPI لمقاومة الحمض النووي. صور تمثيلية تصور الكرات العصبية المشتقة من NSCs تحت ظروف shSNRPN و shSCRAMBLE (الألواح الوسطى). (ز) التحديد الكمي لعدد الكرات العصبية التي تشكلت في مزارع NSC بعد النواة باستخدام shSNRPN (ن = 8) أو shSCRAMBLE (ن = 8). تم استخدام اختبار T. يتم تضمين قيم p: *: p<0.05 ؛ **: ص<0.01; ص<0.001; ص<0.0001.: ملحوظة: غير مهمة. تمثل أشرطة الخطأ SEM. شريط المقياس في D ، 10 ميكرومتر ؛ في F ، 100 ميكرومتر (صور عالية التكبير في F ، 7 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نظرا لعدم وجود علامات نهائية لتحديد مجموعة NSC في الجسم الحي ، فقد استند تحليل NSCs في المقام الأول إلى مراقبة سلوك الخلايا المعزولة من المنافذ العصبية في ظروف خارج الجسم الحي . وضع العمل الرائد الذي قام به رينولدز وفايس الأساس من خلال إنشاء ظروف زراعة دقيقة ، مما يتيح عزل وتوسيع الخلايا الفردية من أنسجة SVZ للفأر البالغ من العمر 2 شهرا في ظل ظروف غير لاصقة. عادة ما يتم نشر هذه الخلايا في وسط خال من المصل يحتوي على EGF و bFGF ، وهي ظروف تمنع تماما التمايز إلى الخلايا العصبية والدبقية مع تعزيز الانتشار. في الواقع ، في ظل ظروف الثقافةهذه 9 ، تموت معظم الخلايا خلال الأيام الأولى في الثقافة ، لكن مجموعة فرعية صغيرة تبدأ في الانقسام وتشكل في المقام الأول كرات عصبية عائمة9. يسهل التفكك الأنزيمي والمزارع الفرعية لهذه المجاميع الخلوية انتشار الثقافة ، مما يدل على قدرة التجديد الذاتي لهذه الثقافات.
والجدير بالذكر أن مزارع الغلاف العصبي تظهر إمكانات التوسع مع إضافة EGF فقط ، في حين أن NSCs المزروعة في وسط يحتوي على bFGF فقط لا تظهر تكاثر الخلايا على المدى الطويل30. يشير كلا الدليلين إلى EGF باعتباره الميتوجين الأساسي للتجديد الذاتي ل NSC. ومع ذلك ، فإن وجود كل من EGF و bFGF في وسط الاستزراع يحسن قدرة التجديد الذاتي ل NSCs31 ، وكذلك يساهم في موازنة إمكانات التمايز في الخلايا النجمية والخلايا العصبية والخلايا قليلة التغصن32،33،34،35. علاوة على ذلك ، فإن استخدام مزيج محدد من الهرمونات والعوامل بدلا من البدائل التجارية لتكملة الوسط يضمن الجودة العالية وقابلية التكاثر لثقافات NSC. في ظل هذه الظروف ، يمكن أن تستمر مزارع NSC للفأر كخطوط خلايا مستقرة دون الخضوع للتخليد. ومع ذلك ، فإن مصدر القلق في ثقافات الغلاف العصبي هو إمكانية خضوع مجموعات الخلايا التكاثرية للتحولات الجينية ، وتجاوز الآليات التنظيمية لدورة الخلية وتؤدي إلى نمط ظاهري خالد. لذلك ، على الرغم من أن مزارع الغلاف العصبي قابلة للتوسيع بدرجة كبيرة ، إلا أن الثقافات التي تتجاوز 10 ممرات في المختبر عادة ما يتم تجاهلها للدراسات ، لأنها قد تخضع لشيخوخة متكررة ، وقد تظهر خلايا ذات محتوى كروموسومي غير طبيعي أو ديناميكيات نمو غير منتظمة. علاوة على ذلك ، يجب مراقبة استخدام ثقافات الغلاف العصبي الراسخة على المدى الطويل بشكل مستمر. توفر ثقافات الغلاف العصبي أيضا الفرصة لفحص خصائصها وإمكاناتها في بيئة خاضعة للرقابة ، مما يوفر إعدادا أكثر دقة وقابلية للتعديل يمكن تعديله ومراقبته بدقة أكبر من الجسم الحي. من خلال التحليلات المستنسخة أو السكانية في المختبر ، من الممكن تحديد قدرات التجديد الذاتي والانتشار لهذه الخلايا ، مما يسهل تحديد الآليات الأساسية التي تحكم هذه الخصائص.
ومع ذلك، وعلى الرغم من القائمة الكبيرة من مزايا العمل مع NSCs في المختبر، فإن طبيعة بروتوكول الاستزراع هذا وحساسية NSCs يشكلان تحديا في هذا المجال. على سبيل المثال ، يمكن أن يختلف عدد الكرات العصبية الأولية المتولدة أثناء التشريح النموذجي بشكل كبير بناء على مهارة ودقة المجرب. توضح نتائج الغلاف العصبي الأولي هذا التباين في عدد الكرات العصبية الأولية التي تم الحصول عليها من SVZ للفئران البالغة من العمر شهرين ، والتي تتراوح بين 500 و 3000 كرة عصبية. قد تساهم عوامل مختلفة في هذا التباين. أولا ، تقلل دقة التشريح من الأنسجة المتنية غير المرغوب فيها ، والتي تمنع تكوين المجال الأساسي. ثانيا ، يسمح توليد قطع صغيرة من أنسجة SVZ بالهضم الأنزيمي الفعال والتثليج ، وبالتالي تقليل فقد الخلايا. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى ممارسة مسبقة كافية لبروتوكول التشريح وتطوير دقيق لمعالجة الأنسجة أثناء إنشاء مزارع الغلاف العصبي.
يكمن قيد آخر لهذه الثقافات في حقيقة أن المجالات العصبية يمكن أن تضم كلا من NSCs والخلايا السلفية ، مما يجعل من الصعب التمييز بين هاتين المجموعتين داخل الثقافات الأولية. في حين تم الإبلاغ عن علامات مختلفة مثل GFAP و Nestin و Musashi و SOX2 بواسطةNSCs 8 ، لم يتم ربط أي منها حصريا ب NSCs. مكنت تقنيات FACS الناشئة القائمة على التعبير عن مستضد سطح الخلية من عزل NSCs وذريتها. أظهرت هذه الدراسات أن أسلاف تضخيم العبور غير قادرين على تكوين كرات عصبية عند المرور25،36. وهكذا ، في حين أن العلاقة بين خلايا SVZ والخلايا البادئة للغلاف العصبي تتطلب مزيدا من الصقل18،19،20،21،22،23 ، فإن قدرة الكرات العصبية على المرور بشكل متسلسل على مدى فترة طويلة قد تعكس وجود NSCs في الثقافات.
كان نظام زراعة الغلاف العصبي هذا بمثابة نموذج قوي للتحقيق في تأثير مسارات الإشارات والتعبير الجيني في الحفاظ على قدرة التجديد الذاتي NSC في المختبر15,29. تتضمن إحدى الطرق لاستكشاف هذه الجوانب نقل NSCs إما للإفراط في التعبير عن جينات معينة أو إسقاطها. يمكن تحقيق ذلك من خلال تقنيات مختلفة ، بما في ذلك الطرق الفيروسية وغير الفيروسية. في حين أن النواقل الفيروسية غالبا ما تحقق كفاءة عالية في نقل الجينات ، إلا أن لها قيودا مهمة ، مثل متطلبات السلامة العالية وإنتاج النواقل الذي يستغرق وقتاطويلا 26. على العكس من ذلك ، فإن طرق النقل الكلاسيكية مثل lipofection والتثقيب الكهربائي تحقق معدلات نقل منخفضة للغاية ، مما يجعلها غير مجدية للخلايا التي يصعب نقلها. تقدم تقنية nucleofection نهجا سهل الاستخدام من خلال الجمع بين حلول nucleofection الخاصة بنوع الخلية مع المعلمات الكهربائية الفريدة لكل نوع خلية37,38. هذا يضمن نقل الحمض النووي مباشرة إلى نواة الخلية39 ، مما يسمح بدمج الحمض النووي بطريقة مستقلة عن دورة الخلية. وبالتالي ، يظهر nucleofection كتقنية قابلة للتطبيق لنقل الخلايا التي يصعب نقلها مثل NSCs28,40 للفأر.
أحد قيود هذه الطريقة هو أنه يوصى بما لا يقل عن 2 × 106 خلايا وضروري لكل نواة ، على الرغم من أنه في الظروف المثلى ، يمكن استخدام عدد أقل من الخلايا لكل نواة واحدة (أي 5 × 105 خلايا). عيب آخر لهذه الطريقة هو أن جودة وتركيز الحمض النووي المستخدم في النواة يؤثر بشكل كبير على كفاءة نقل الجينات. يوصى بشدة باستخدام الحمض النووي المحضر الخالي من السموم الداخلية لمنع ارتفاع معدل وفيات الخلايا بسبب وجود السموم الداخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام أكثر من 6 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي للنواة يمكن أن يقلل بشكل كبير من كفاءة نقل الجينات وصلاحية الخلية. أخيرا ، يعد إعطاء النبض الكهربائي أمرا بالغ الأهمية أيضا لبقاء الخلايا النووية.
في هذا العمل ، قمنا بتمثيل التلاعب بالتعبير الجيني Snrpn من خلال استخدام استراتيجية تنطوي على تقليل تنظيم تعبيره باستخدام البلازميدات العرضية. لا يتم دمج هذه البلازميدات في جينوم الخلايا ، ومع استمرار NSCs في التكاثر في المختبر ، سيتم تخفيف الحمض النووي الذي تم إدخاله لاحقا على طول انقسام الخلايا ، وبالتالي يفقد تأثير التلاعب الجيني. لذلك ، هذه الاستراتيجية قيمة لدراسة تأثير التغيير الحاد في فترة قصيرة أو لخلايا تاريخ الميلاد في المختبر. تتوفر بعض البدائل لتقييم التأثير المطول للاضطراب الجيني. على سبيل المثال ، يمكن استخدام نظام تكاملي مثل الخنزير القائم على الترانسبوزونBAC. يتكون هذا النظام من إدخال تسلسل الترميز المطلوب الموجود في البلازميد المحاط بتسلسلات قابلة للنقل ومشاركة الخلايا في النواة ببلازميد يحتوي على تسلسل إنزيم transposase41. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام الترانسبوزونات أو أنظمة كريسبر/كاس.
سيكون التطوير الإضافي لتقنيات النقل خطوة مهمة نحو فحوصات عالية الإنتاجية لتقييم دور الجينات المختلفة في فسيولوجيا الخلايا الجذعية العصبية للبالغين. بالاقتران مع طرق التنقية والتوسع المتطورة بشكل متزايد ، ستمكن هذه الدراسات من فهم البيولوجيا في المختبر ل NSCs البالغة ومقارنة الاختلافات البيولوجية بين المجالات العصبية العائمة و NSCs في الجسم الحي.
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
تم دعم هذا العمل بمنح من وزارة العلوم والابتكار والوكالة الحكومية للبحوث (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 و EUR2023-143479) إلى SRF. يتم تمويل EJV (FPU20 / 00795) و DSL (FPU22 / 03797) من قبل برنامج زمالة Formación de Profesorado Universitario الإسباني (FPU). يتم تمويل LLC (PRE2020-094137) و JDM (PREP2022-000680) من قبل برنامج زمالة Formación de Personal Investigador الإسباني (FPI). يتم تمويل CMM (CIACIF / 2022/366) من قبل Generalitat Valenciana. يتم تمويل MIL (CPI-22-481) من قبل زمالة Programa INVESTIGO (الجيل القادم من الاتحاد الأوروبي). تمويل الوصول المفتوح المقدم من وزارة العلوم والابتكار.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm pore-filter bottles (250 mL) | VWR | 514-0330P | |
0.22 μm pore-filter bottles (500 mL) | VWR | 514-0332P | |
12-well plate | LabClinics | PLC30012 | |
15 mL tube | Fisher | 10738771 | |
24-well plate | LabClinics | PLC30024 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | BioWest | L0180-100 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
48-well plate | ThermoFisher | 150687 | |
6-well plate | LabClinics | PLC30006 | |
96-well plate | Labclinics | PLC30096 | |
Accutase solution | Sigma | A6964-100ML | Referred as enzymatic solution |
Amaxa Mouse Neural Stem Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPG-1004 | |
Amaxa Nucleofector Iib | Lonza | 10700807 | |
Antibiotic/Antimitotic (A/A) | Sigma | A5955 | |
Apo-t-Transferrine | Sigma | T2252-1G | |
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | |
Blasticidin | Sigma | 203350 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25MG | |
Cell strainer 40 μm | LabClinics | PLC93040 | |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) | NZYTech | MB08701 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dulbecco’s Phosphate Saline Buffer (DPBS) | Gibco | 14080-055 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) F12 1:1 | Gibco | 11320-074 | |
E. coli DH5α Competent Cells | ThermoFisher | EC0112 | |
Earles's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | |
Epidermal Growth Factor - Human recombinant (EGF) | Gibco | 53003-018 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-6511 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Kit includes reagents for PCR |
Heparin | Sigma | H-3149 | |
Insuline | Sigma | I6634 | |
LB agar (Lennox) | LabKem | AGLB-00P-500 | |
LB broth (Lennox) | LabKem | LBBR-00P-500 | |
L-Cysteine | Sigma | C-8277 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
Neubauer chamber | Blaubrand | BR718620 | |
Nuclease free water | Labbox | WATR-00A-10K | |
NZYMaxiprep Endotoxin Free Kit | NZYTech | MB39901 | |
Papain Lyophilized | Worthington | LS003119 | |
Progesterone | Sigma | P-6149 | |
Putrescine | Sigma | P-7505 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10316-14 | |
shSCRAMBLE | Mission (Sigma) | SHC003 | |
shSNRPN | Mission (Sigma) | TRCN0000109285 | |
Sodium Selenite | Sigma | S-9133 | |
Spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
Sterile PES Syringe Filters (0.22 μm pore-filter) | Epica | SFPE-22E-050 | |
T12.5 cm2 Flask | Biofil | TCF012025 | |
T25 cm2 Flask | LabClinics | PLC70025 | |
T75 cm2 Flask | LabClinics | PLC70075 | |
Tweezers | Fine Science Tools | 91150-20 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved