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요약

여기에서는 성체 쥐 뇌실 영역에서 분리된 확장된 신경 줄기 세포(NSC)에서 유전자 전달 효율성을 향상시키도록 설계된 핵절충 시스템에 대해 설명합니다. 이 연구 결과는 이 방법이 NSC의 유전자 섭동을 크게 개선하여 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하고 세포 생존율을 향상시킨다는 것을 보여줍니다.

초록

성체 쥐 뇌의 뇌실하 영역(SVZ)에서 신경 줄기 세포(NSC)의 분리 및 확장은 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 표피 성장 인자(EGF)를 미토겐으로 보충하여 신경구로 알려진 클론 응집체를 생성하는 배지에서 달성할 수 있습니다. 이 in vitro 시스템은 NSC 잠재력을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 플라스미드에 운반된 siRNA 또는 유전자의 transfection은 유전자 발현에 대한 섭동을 유도하고 NSC 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 NSC 배양에 대한 외인성 핵산 전달은 중추신경계(CNS) 세포 transfection의 낮은 효율성으로 인해 어렵습니다. 여기에서는 성체 쥐 SVZ의 확장된 NSC에서 높은 유전자 전달 효율을 달성하는 개선된 핵절충 시스템을 소개합니다. 당사는 이 비교적 간단한 방법이 성인 NSC의 유전자 섭동을 향상시켜 생존율이 80%를 초과하는 기존 transfection 프로토콜을 능가한다는 것을 입증했습니다. 또한, 이 방법은 1차 분리 NSC에도 적용할 수 있으며, 신경권 배양에서 knockdown 또는 과발현을 통한 유전자 발현 조작을 통해 유전자 기능 연구에서 중요한 발전을 제공합니다.

서문

신경 줄기 세포(NSC)는 뇌에 상주하는 다능 줄기 세포입니다. 이 세포는 자가 재생 능력을 가지고 있으며 성상교세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte), 뉴런(neuron)의 세 가지 신경 계통으로 분화할 수 있습니다1. 결과적으로, NSC는 포유류의 성체 신경 발생, 즉 뇌에서 새로운 신경 세포가 생성되는 과정에 중요한 역할을 합니다2. 비소세포(NSC)는 주로 신경인성 틈새(neurogenic niche)라고 불리는 성인 뇌 내의 두 영역, 즉 외측 심실의 벽을 따라 있는 뇌실하 영역(subventricular zone, SVZ)과 해마의 치상이랑(dentate gyrus) 내의 입하 영역(SGZ)에 존재합니다 3,4. 성체 마우스에서 가장 활동적인 신경인성 틈새인 SVZ의 NSC(B 세포라고도 함)는 자가 재생되어 통과 증폭 전구 세포(TAP 또는 C 세포)를 생성한 후 신경 아세포(A 세포)로 분화합니다. 이 신경아세포는 로스트랄 이동류(rostral migratory stream, RMS)를 통해 후각구(olfactory bulbs, OB)로 이동하며, 여기서 인터뉴런(interneuron)으로 완전히 분화되어 기존의 회로(circuitry) 3,4,5,6에 통합됩니다.

이러한 틈새 내에서 NSC를 조절하는 분자 단서와 신호의 복잡한 상호 작용을 이해하는 것은 치료 응용 분야에 대한 잠재력을 활용하는 데 중요합니다. 이를 위해 NSC의 선택적 1차 배양에서 표면 마커 7,8,9,10을 사용한 세포 선택에 이르기까지 이 세포 집단을 연구하기 위한 다양한 방법이 개발되었습니다. 본 논문은 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 표피 성장 인자(EGF)라는 두 가지 유사 항액을 모두 포함하는 무혈청 선택적 배지를 사용하여 SVZ NSC의 시험관 내 분리 및 배양에 대해 자세히 설명합니다. 이 배지는 세포 증식을 촉진하고 신경권(neurospheres)으로 알려진 시험관 내 클론, 3차원, 비부착성 응집체를 형성하는 성인 마우스 뇌의 SVZ에서 얻은 NSC의 줄기성을 유지합니다9. 신경권 배양은 NSC 증식, 자가 재생, 분화 및 생존에 영향을 미치는 분자 메커니즘 및 요인을 조작하고 연구하기 위한 통제된 플랫폼 역할을 합니다11. 특히, 배양에서 형성된 일차 신경구의 수는 생체 내 SVZ에 존재하는 NSC의 수를 추정할 수 있게 하며, 이는 성인 NSC 풀에 대한 다양한 조건의 영향을 연구하기 위한 강력한 도구가 됩니다(12,13). 더욱이, 일단 1차 배양이 확립되면, NSC는 증식 조건 하에서 대칭적 분열을 통과할 때 새로운 응집체(2차 신경구)를 생성할 수 있다14. 따라서, 2차 신경구 세포의 저밀도 파종(클론 분석)은 이러한 배양물의 자가 재생률을 평가하기 위해 활용될 수 있습니다 4,15,16,17.

NSC 조절을 지배하는 메커니즘을 밝히는 데 있어 신경권의 잠재력에도 불구하고, 일부 연구자들은 세포가 성장하는 인공 조건이 신경인성 틈새 18,19,20,21,22 의 복잡한 생체 내 미세환경을 충실하게 복제하지 못할 수 있다고 주장하면서 시험관 내 발견의 타당성에 의문을 제기합니다. 또 다른 논란의 여지가 있는 점은 신경권에서 관찰된 이질성에 관한 것이다. 그럼에도 불구하고, 이러한 변동성은 in vivo23,24에서 자연적으로 발생하는 NSC의 대칭 및 비대칭 분할을 반영하는 것으로 여겨진다. 또한, 최근의 검증은 SVZ 신경인성 틈새 내에서 작동하는 메커니즘을 예측하기 위한 NSC 배양의 활용을 지원했으며, 여러 연구에서 시험관 내에서 배양된 NSC가 생체 내에서 관찰된 전사체 프로필을 정확하게 유지한다는 것을 입증했습니다 11,25.

따라서 신경권 배양은 NSC 증식 및 분화 능력을 탐구하는 방법일 뿐만 아니라 NSC 생물학을 지배하는 유전자의 영향을 연구하는 시스템을 제공합니다. 비소세포종(NSC)에서 유전자 기능을 조사하기 위한 핵심 기법은 유전자 발현 섭동(gene expression perturbation)입니다. 플라스미드를 통해 전달된 siRNA 또는 유전자는 세포 배양에 transfection되어 표적 유전자의 knockdown 또는 upregulation을 초래할 수 있습니다. 이 다재다능한 접근법은 조건부 녹아웃 마우스를 사용하여 배양하는 것에 비해 시간과 비용을 크게 줄여 신경 발생의 유전적 기반을 밝히고 치료 전망을 탐색할 수 있는 유망한 방법을 제시합니다. NSC에서 특정 유전자의 발현을 변경하면 유전자의 행동을 조절할 수 있으며, 증식, 분화 및 이동과 같은 중요한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나 특히 쥐 신경구 내에서 NSC를 transfection할 수 있다는 전망은 주목할 만한 도전 과제를 제시합니다. 신경구의 3차원 구조는 형질주입의 효율성을 손상시키며, 종종 성공적인 외인성 핵산 전달률이 낮아져 유전자 조작의 범위를 제한한다26,27. 또한, transfection 절차는 세포의 생존력과 기능에 해로운 영향을 미칠 수 있다27. 이러한 맥락에서 우리는 세포 손상을 완화하고 높은 생존율을 달성하며 NSC 배양을 교란하는 데 사용되는 유전자 전달 분석에서 더 높은 효능을 보장하는 방법으로 nucleofection 시스템을 제시합니다.

이 원고는 신경권 배양 시스템을 사용하여 유전자를 교란하기 위해 성인 SVZ 신경인성 틈새에서 NSC를 분리, 확장 및 핵화하는 절차를 설명하는 것을 목표로 합니다. 이 방법은 기존 transfection 프로토콜의 효과를 능가하여 표적 세포 간의 생존율이 크게 높아지고 유전자 전달 효율이 개선됩니다.

프로토콜

동물을 대상으로 한 모든 실험은 이전에 발렌시아 대학의 윤리 위원회의 승인을 받았으며 Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (스페인)의 승인을 받았습니다.

1. 신경구의 1차 문화

  1. 시약의 준비
    1. 탈이온수에 Dulbecco의 DPBS(Phosphate Saline Buffer)의 완충 용액을 준비하고 고압멸균으로 멸균합니다. 또는 탈이온수에 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mMNa2HPO4 및 1.8mMKH2PO4용액을 첨가하여 0.1M PBS pH 7.4를 준비합니다.
    2. 두 개의 12웰 플레이트에 이전에 냉각된 DPBS를 채우고 얼음 위에 보관합니다: 하나는 절개 전에 뇌 전체를 보존하는 데 사용되고, 다른 하나는 조직이 처리될 때까지 절개된 SVZ를 보존하는 데 사용됩니다.
    3. 아래 설명에 따라 파파인 함유 효소 혼합물을 준비합니다.
      1. Earl's Balanced Salt Solution(EBSS)에서 각각 0.2mg/mL의 최종 농도로 EDTA/L-시스테인 해리 용액을 준비합니다. 완전히 용해되려면 튜브를 37°C의 수조에서 배양합니다.
      2. 파파인 12U/mL를 EDTA/L-시스테인 용액에 녹입니다. 뇌 당 500 μL의 효소 용액이 사용된다고 가정하십시오.
      3. 효소가 완전히 용해될 때까지 37°C의 수조에 파파인 용액을 약 20분 동안 넣습니다.
      4. 주사기와 0.22μm-기공 필터로 효소 혼합물을 필터 멸균하고 사용할 때까지 4°C에서 유지합니다.
        알림: 파파인은 37°C에서 30분 후에 활성화되며 4°C에서 12시간 동안 보관할 수 있습니다.
    4. 표 1에 따른 호르몬 혼합액을 첨가하여 대조배양액을 제조하고 니트로셀룰로오스 0.22μm-pore 필터를 사용하여 여과-멸균한다. 매체를 4 °C로 유지하고 사용하기 전에 37 °C의 수조에서 데우십시오.
    5. 표 1에 따라 사용하기 직전에 대조 매체에 EGF 및 bFGF를 보충하여 전체 배지를 준비합니다. 필터링으로 미토겐이 손실될 수 있으므로 전체 매체를 필터링하지 마십시오.
  2. 뇌 적출 및 SVZ 해부
    참고: 쥐는 안락사 전에 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다. 8주에서 16주령의 C57BL/6 마우스가 사용됩니다. 남녀 모두 준비에서 눈에 띄는 차이없이 사용됩니다.
    1. 수술 전에 고압멸균으로 해부 도구를 멸균하십시오. 그런 다음 메스, 핀셋, 가위, 주걱을 70% 에탄올로 채워진 비커에 담그십시오. 70% 에탄올로 모든 작업 표면을 철저히 청소하십시오.
    2. CO2 과다 복용으로 마우스를 희생하고 자궁 경부 탈구로 확인합니다. 뇌 조직 오염 가능성을 최소화하기 위해 머리에 70% 에탄올을 뿌립니다.
    3. 가위를 사용하여 쥐의 머리를 몸의 나머지 부분과 분리합니다. 두개골이 완전히 드러날 때까지 로스트로-꼬리 축을 따라 작은 가위로 두개골 위의 피부를 자릅니다.
    4. 먼저 작은 가위로 시상 봉합사를 따라 두개골을 잘라 뇌를 노출시킨 다음 가는 핀셋을 사용하여 뼈를 제거합니다. 이 단계에서 두개골 아래의 뇌 조직에 손상을 입히지 않도록 주의하십시오.
    5. 주걱을 사용하여 두개골에서 뇌를 조심스럽게 추출하고 차가운 DPBS가 들어 있는 12웰 플레이트에 넣습니다. 해부가 완료될 때까지 접시를 얼음 위에 두십시오.
    6. 뇌 전체를 박리가 진행될 실리콘 패드에 옮기고 뇌에 차가운 DPBS 몇 방울을 떨어뜨립니다(그림 1A).
    7. 메스를 사용하여 뇌의 말단에 위치한 OB와 꼬리 부분에 위치한 소뇌를 제거하면서 양쪽 측면 심실을 포함하는 뇌의 중앙 부분을 유지합니다(그림 1B).
    8. 세로 균열을 따라 뇌를 두 개의 반구로 나눈 다음 두 반구를 개별적으로 절개합니다(그림 1C).
    9. 한쪽 반구로 작업하면서 중간 영역이 위쪽을 향하도록 방향을 바꿉니다. 뇌량(corpus callosum)을 따라 뇌를 열어 피질과 선조체를 해마, 중격, 간뇌에서 분리하여 외측 심실을 노출시킵니다(그림 1D).
      알림: SVZ는 심실의 구멍과 선조체 사이에 위치하므로 후속 단계는 SVZ를 주변 조직에서 가능한 한 정확하게 격리하는 것을 목표로 합니다.
    10. 심실의 복부 한계를 따라 해마, 중격 및 간뇌를 제거하고(그림 1E,F), SVZ의 로스트랄 및 꼬리 끝 너머의 조직(그림 1G), 뇌량(corpus callosum)을 따르는 피질(그림 1H,I)을 제거합니다.
    11. SVZ가 옆을 향하도록 조직을 기울여(그림 1J) SVZ 아래의 선조체 조직을 제거하여(그림 1K) NSC를 포함하는 얇은 조직 조각을 얻을 수 있습니다(그림 1L).
    12. 조직 처리가 시작될 때까지 동일한 마우스에서 절개된 두 SVZ를 모두 차갑고 멸균된 DPBS가 들어 있는 12웰 플레이트에 보관합니다.
      참고: 한쪽 뇌에서 두 SVZ를 모두 절제하는 데 10분이 소요됩니다. 시간이 길면 세포 생존율에 영향을 미칠 수 있습니다. 배양액의 수율을 증가시켜야 하는 경우, 동일한 연령, 성별, 유전적 배경 및 유전자형을 가진 여러 마우스의 SVZ를 풀링할 수 있습니다.
  3. NSC의 격리 및 시딩(Isolation and seeding)
    1. 조직의 응집을 용이하게 하기 위해 각 SVZ를 4-5개의 작은 조각으로 자릅니다.
      참고: 이 단계부터 전체 절차는 층류 후드의 멸균 상태에서 수행해야 합니다.
    2. 멸균 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 잘게 잘린 SVZ를 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 접시에 파편이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
    3. 튜브 바닥에 조직 침전물을 넣고 남아 있는 DPBS를 제거합니다.
    4. 브레인당 여과된 파파인 함유 효소 혼합물 500μL(SVZ 2개)를 추가하고 튜브를 37°C의 수조에서 30분 동안 배양합니다.
    5. 배양 후 37°C에서 사전 예열된 대조 배지 5mL를 각 샘플에 추가합니다.
    6. 샘플을 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 마이크로피펫이나 진공 펌프를 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
    7. 대조 매체 1mL를 추가하고 균질한 세포 현탁액이 얻어질 때까지 화염 광택 처리된 파스퇴르 유리 피펫을 사용하여 10배에서 20배까지 위아래로 피펫팅하면서 펠릿을 기계적으로 조심스럽게 분해합니다.
      주의: 이는 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나이며, 과도하거나 불충분한 세분화는 배양물의 수율에 부정적인 영향을 미치기 때문입니다.
    8. 대조 배지 4mL를 추가하고 반전으로 혼합하여 세포를 세척합니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기 그런 다음 상층액을 제거합니다.
    9. 1mL의 완전한 배지를 추가하고 세포 현탁액을 균질화하기 위해 위아래로 10배 피펫팅하여 펠릿을 재현탁시킵니다.
    10. 세포 현탁액의 부분 표본을 트리판 블루로 1/2 희석한 후 현미경 아래의 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 현탁액을 계산하거나 자동 세포 카운터를 활용합니다. 배양액이 단일 세포 수준에서 세분화되어 있는지 확인합니다.
    11. 세포 현탁액이 준비되면 얻은 세포를 500μL의 완전한 배지의 최종 부피에서 48웰 플레이트의 8웰에 동일하게 파종합니다.
      참고: 일반적으로 두 개의 SVZ에서 20,000개의 세포를 얻어 최종 파종 밀도는 약 2,500 cells/mL로 배양에서 최대 수율을 달성합니다.
  4. 신경구 형성
    1. 37 ° C 및 5 % CO2 의 가습 된 인큐베이터에서 5-7 일 동안 in vitro (DIV) 동안 세포를 배양합니다. 이러한 조건 하에서, 분화된 세포는 죽는 동안 NSC와 전구세포는 유사분열 자극에 반응하여 증식하여 일차 신경구로 인식되는 클론 응집체를 형성합니다.
      참고: EGF 또는 bFGF를 사용하여 신경구 형성을 유도할 수 있습니다. 그러나 이 두 가지 성장 요인을 완전히 대체할 수 있는 것은 아닙니다.
    2. 도립 현미경 결합 카메라를 사용하여 신경구의 크기를 확인하고 신경구가 50-100 μm의 크기 범위에 도달하면 우물에서 형성된 모든 주요 신경구를 10배 배율로 계산합니다. 형성된 1차 신경구의 총 수는 SVZ 틈새에 존재하는 NSC의 수를 추정하는 역할을 합니다.
    3. 10일이 지나면 각 웰에서 배양 배지를 채취하여 패시징을 시작합니다. 5-7 DIV 후에 후속 passaging을 수행하지만, 1차 구체가 subculturing에 이상적인 크기(약 100μm)에 도달하는 데 약간 더 긴 기간이 필요할 수 있다는 점에 유의할 가치가 있습니다.

표 1: 배양 배지 솔루션. 제어 매체의 조리법이 설명되어 있습니다. 미리 혼합된 호르몬 혼합 용액이 만들어집니다. 스톡 호르몬 용액은 표시된 대로 미리 준비하고 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 세포 배양 전에 대조 배지에 EGF 및 bFGF를 보충하여 완전한 배지를 준비합니다. 저장 사양, 재고 및 작업 농도는 각 구성 요소에 대해 제공됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

2. 신경권 문화의 확장

  1. 신경구의 통로
    1. 멀티웰 플레이트에서 신경구를 포함하는 배지를 수집하여 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 몇 밀리리터의 DPBS로 웰을 헹구어 가능한 한 많은 세포의 회수를 보장합니다.
    2. 300 x g에서 5분 동안 신경구를 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.
    3. 펠릿에 200μL의 효소 용액( 재료 표 참조)을 추가하고 튜브 바닥을 가볍게 두드려 제거합니다. 신경구 해리를 촉진하기 위해 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    4. 대조 배지 1mL를 추가하여 효소 반응을 중단하고 P1000 마이크로피펫으로 10배에서 20배까지 위아래로 피펫팅하여 신경구를 기계적으로 해리합니다.
    5. 대조 배지 4mL를 추가로 추가하고 반전으로 혼합하여 세포를 세척합니다.
    6. 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다.
    7. 1mL의 완전한 배지를 추가하고 펠릿을 재현탁시켜 세포 현탁액을 10회 위아래로 피펫팅하여 균질화합니다.
      참고: 신경구의 원래 수와 크기가 너무 높으면 신뢰할 수 있는 세포 수를 보장하기 위해 세포 현탁액을 희석하기 위해 더 완전한 배지를 추가하십시오.
    8. 세포 현탁액의 부분 표본 1/2을 트리판 블루로 희석한 후 Neubauer 챔버를 사용하여 세포 현탁액을 계산하거나 자동 세포 카운터를 사용합니다.
    9. 세포 배양을 확장하려면 적절한 배양 플레이트 또는 플라스크에 완전한 배지를 사용하여 10,000 cells/cm2 밀도로 세포를 파종합니다( 표 2 참조).
    10. 37 ° C 및 각 통로에 대해 5 % CO2 의 가습 인큐베이터에서 5-7 DIV의 세포를 배양합니다.
      참고: Neurosphere 배양은 증식 능력을 변경하지 않고 10개 통로를 초과하지 않는 반복적인 하위 배양을 통해 일관되게 확장 및 증식할 수 있습니다. EGF 또는 bFGF는 배양에 사용할 수 있습니다. 그러나 배양의 장기적인 확장은 EGF가 있을 때만 달성할 수 있습니다.
  2. 자가 갱신 분석
    1. 신경구 배양을 통과시킨 후 96웰 플레이트에 1,000개의 개별 세포를 패팅하고 완전한 배지로 최대 200μL의 최종 부피를 완성하여 5개 cells/μL 배양의 최종 세포 밀도를 만듭니다.
      참고: 시드된 셀의 수는 가능한 한 정확해야 합니다. 필요한 경우 도금 전에 신뢰할 수 있는 셀 현탁액 부피를 보장하기 위해 중간 희석액을 준비합니다. 또한 기술적 변동성을 줄이기 위해 조건당 4-5번의 반복을 플레이트하는 것이 좋습니다.
    2. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 가습 된 인큐베이터에서 5 일 동안 또는 신경 구체가 적절한 크기 (60-100 μm)에 도달 할 때까지 세포를 배양합니다. 신경구 응집을 방지하기 위해 멀티웰 플레이트를 움직이거나 흔들지 마십시오.
    3. 신경구 형성 후 부착된 카메라가 장착된 도립 위상차 현미경을 사용하여 각 웰에 형성된 신경구의 수를 계산합니다. 자가 재생 분석은 EGF 또는 bFGF를 별도로 사용하여 수행할 수 있습니다.
  3. NSC 배양물의 냉동 보존
    참고: Neurosphere 배양은 향후 사용을 위해 냉동 보존할 수 있어 필요한 마우스 수를 최소화할 수 있습니다. 통로 10까지 세포를 보존하는 것이 좋습니다.
    1. 세포를 동결 보존하려면 완전한 배지에 담긴 세포 현탁액 1mL를 적절하게 라벨링된 극저온 튜브에 옮깁니다.
    2. 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 셀 현탁액에 최종 농도 10%로 첨가하고 튜브를 뒤집어 부드럽게 혼합합니다.
      참고: DMSO는 동결 보호제 역할을 하지만 세포에 독성이 있을 수 있으므로 이 단계를 신속하게 수행해야 합니다.
    3. 80°C/min에서 온도를 점진적으로 낮출 수 있는 냉동 용기를 사용하여 튜브를 -1°C 냉동고에 넣습니다. 이 점진적인 동결 과정은 냉동 보존 중 얼음 결정의 형성으로 인한 세포 손상을 방지합니다. 장기 보관을 위해 튜브를 -196°C의 액체 질소 탱크에 보관하십시오.
  4. NSC 문화의 해동
    참고: 필요한 경우 세포를 해동하고 실험을 위해 배양액을 다시 확장할 수 있습니다.
    1. 액체 질소 저장 탱크에서 동결된 NSC가 들어 있는 극저온 튜브를 제거하고 즉시 37°C 수조에 넣고 약 5분 동안 완전히 해동될 때까지 넣습니다.
      주의: DMSO는 독성이 있고 세포 생존력에 영향을 줄 수 있으므로 수조 시간을 최소화하는 것이 중요합니다.
    2. 해동된 세포를 5mL의 사전 예열된 대조 매체가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 빠르게 옮깁니다.
    3. 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 1mL의 완전한 배지를 추가하고 파종하기 전에 세포 현탁액을 균질화하기 위해 위아래로 10배 부드럽게 피펫팅하여 펠릿을 재현탁시킵니다.
      알림: 해동은 세포 생존력에 영향을 줄 수 있습니다. 따라서 새로운 실험을 위해 씨를 뿌리기 전에 적어도 한 번은 세포를 통과시키는 것이 좋습니다.
  5. 마이코플라스마 검사
    참고: 마이코플라스마 오염은 세포 건강을 손상시켜 성장 속도에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 마이코플라스마 검사는 실험의 무결성과 신뢰성을 보장하는 데 매우 중요합니다.
    1. DNA 추출
      1. DNA 추출을 위해 최소 100μL의 세포 배양을 수집합니다. 상층액과 세포 펠릿 모두 DNA 추출에 사용할 수 있습니다. 추출할 때까지 이 부분 표본을 -20 °C에서 보관하십시오.
      2. 튜브 뚜껑을 뚫고 써모블록을 사용하여 분취액을 99°C에서 15분 동안 끓입니다.
        알림: 튜브 뚜껑을 뚫으면 고온에서 끓는 동안 튜브가 열리는 것을 방지할 수 있습니다.
      3. 16,900 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. DNA를 포함하는 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. PCR 검사 전까지 DNA가 있는 튜브를 -20°C에서 보관합니다.
    2. 마이코플라스마 검출을 위한 PCR
      1. 10 μM 농도에서 8.9 μL의 뉴클레아제-프리 물, 3 μL의 5x 반응 완충액, 1.2 μL의 25 mM MgCl2, 0.25 μL의 2.5 mM dNTPs, 0.15 μL의 Taq 중합효소 및 0.25 μL의 각 마이코플라스마 특이적 프라이머를 사용하여 PCR 혼합물을 준비합니다(정방향, Fw: 5'GATGTTTAGCCGGGTCGAGAG3' 및 역방향, Rv: 5'GATGTCAAGAGTGGGTAAGGTT3')입니다.
      2. 게놈 추출 DNA 1μL를 추가합니다. DNA 오염을 방지하기 위해 층류 후드에서 PCR 혼합물을 준비합니다.
      3. 95°C에서 5분 동안 초기 변성한 후 95°C에서 30초 동안 35주기 변성, 53°C에서 1분 동안 어닐링, 72°C에서 30초 동안 연장, 72°C에서 5분 동안 최종 연장.
      4. 생성된 띠의 크기(약 500bp)를 식별하려면 3μL의 6x 로딩 염료 용액과 혼합된 DNA PCR 산물 15μL를 2% 아가로스 겔에 로드하고 100V에서 40-50분 동안 전기영동을 실행합니다.

표 2: 배양에 사용되는 플레이트 및 플라스크. 가장 일반적으로 사용되는 파종 플레이트와 플라스크의 치수와 부피가 제공됩니다. 이 표에는 각 용기에 사용되는 직경, 성장 면적 및 매체 부피와 함께 확장 조건(10,000 cells/cm2)에서 파종할 NSC 수의 예가 포함되어 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

3. 신경권 배양의 핵융합

  1. 시약의 준비
    1. DNA 준비
      1. 형질전환을 위해 1.5mL 튜브에 25μL의 유능한 E. coli DH5α 세포를 준비합니다.
      2. 관심 플라스미드 1 μL(100 - 200 ng/μL)를 세포에 추가하고 42°C에서 45초 동안 열 충격을 가합니다. 여기서, Snrpn 발현을 침묵시키기 위한 short hairpin (sh)RNA를 함유하는 플라스미드와 control plasmid shSCRAMBLE이 사용된다.
        알림: 변형 효과를 유지하기 위해 절차 전반에 걸쳐 유능한 세포를 얼음 위에 유지하십시오.
      3. 형질전환된 세포를 LB 한천 플레이트에 적절한 항생제를 도포하고 37°C에서 18시간 동안 배양합니다. 박테리아 식민지를 방해할 수 있는 결로로 인한 물방울 형성을 방지하기 위해 페트리 접시를 뒤집어 두십시오.
        참고: LB 배양 배지에 적절한 항생제를 첨가하여 형질전환된 박테리아가 독점적으로 성장할 수 있도록 합니다.
      4. 멸균 피펫 팁을 사용하여 개별 박테리아 콜로니를 선택하고 이전에 250mL의 LB로 채워진 Erlenmeyer 플라스크로 옮겨 액체 배양을 시작합니다. 더 큰 타겟 콜로니 주변에 위치한 작은 위성 콜로니는 원하는 플라스미드를 통합하지 않았을 수 있으므로 선택하지 마십시오.
      5. 밤새 37°C의 궤도 셰이커에서 세게 흔들면서 플라스크를 배양합니다.
      6. 내독소가 없는 maxiprep 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 박테리아 배양에서 순수한 플라스미드 DNA를 추출합니다. 적절한 양의 내독소가 없는 물에서 DNA를 재구성하여 1 - 2 μg/μL의 플라스미드 농도를 얻습니다.
        참고: maxiprep 수율은 배양 성장에 따라 달라집니다. 일반적으로 플라스미드 DNA 펠릿을 200 μL의 부피로 재현탁시키면 원하는 DNA 농도가 생성됩니다.
      7. 플라스미드 DNA가 있는 튜브를 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오. nucleofection을 위한 2 내지 6 μg의 플라스미드 DNA를 포함하는 최종 부피가 5 μL인 1.5 mL 튜브를 준비합니다.
    2. 재료 준비
      1. 핵 용액을 준비합니다. 권장 키트( 재료 표 참조)를 사용하는 경우 원하는 각 핵에 대해 95mL 튜브에 1.5μL의 핵절용 용액을 준비합니다. 피펫과 큐벳은 일반적으로 키트에 포함되어 있습니다. 모든 핵 상태에 대해 각각 하나씩 준비합니다.
      2. 조건에 따라 25mL의 사전 예열된 완전한 배지 4mL로 채워진 T4 플라스크를 준비하고 사용할 때까지 인큐베이터에 보관합니다.
  2. NSC의 핵
    1. 평가를 위해 조건당 1 - 2 x 106 개의 개별 셀을 사용합니다. 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
    2. 1mL의 DPBS를 추가하고 균일한 세포 현탁액을 보장하기 위해 위아래로 10배 피펫팅하여 펠릿을 재현탁시킵니다.
    3. 두 번째 세척을 위해 원심분리(단계 2.1.6)를 반복하고 마지막으로 펠릿을 95μL의 핵절용 용액에 재현탁시킵니다.
      알림: 세척 단계는 대조 매체에서 항생제를 제거하고 효과적인 핵검사를 보장하는 데 중요합니다.
    4. 95 μL의 세포를 뉴클레오펙션을 위해 선택된 각 플라스미드 5 μL(총 2 μg)를 포함하는 사전 혼합 용액과 결합합니다.
    5. P200 마이크로피펫을 사용하여 이 용액을 큐벳으로 옮기고 뉴클레펙터 장치에 넣습니다.
    6. nucleofector 시스템의 최적화된 NSC 프로그램을 사용하여 원하는 plasmid로 세포를 Nucleofect합니다.
    7. 전기천공법을 완료한 후 키트에 제공된 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐벳에 따뜻한 완전한 매체를 조심스럽게 주입합니다. 그 후, 큐벳의 내용물을 사전 예열된 완전한 매체가 들어 있는 미리 준비된 T25 플라스크로 옮깁니다. 전기천공법 후에는 세포 사멸, DNA 침전 및 점성 응집체의 형성이 있을 수 있습니다. 세포 생존율을 감소시킬 수 있으므로 이를 T25 플라스크로 옮기지 마십시오.
      참고: 이 단계는 매우 중요하며 높은 수율의 핵절제와 후속 배양 생존을 보장하기 위해 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.
    8. 37 °C 및 5 % CO2에서 가습 된 인큐베이터에서 3-5 일 동안 핵 세포를 배양합니다.
  3. nucleofected 세포의 선택
    1. 전략 A: 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통한 유세포 분석 선택
      1. 3-5 일의 nucleofection 후, 단계 2.1에 따라 nucleofected 배양물을 통과시키고 얻어진 모든 개별화 된 세포를 수집한다.
      2. 40μm 세포 여과기를 통해 샘플을 여과하여 세포 응집체를 제거하고 세포 분류기 유세포분석기로 분석합니다.
        참고: 비교 결과를 얻으려면 각 조건에서 동일한 수의 셀을 정렬하는 것이 중요합니다.
      3. cytometer의 소프트웨어를 사용하여 세포 크기에 해당하는 전방 산란광(FSC-A)과 세포 내 복잡성에 해당하는 측면 산란광(SSC-A)의 두 가지 측정에 따라 살아있는 세포를 게이트합니다. 높은 FSC-A 및 높은 SSC-A를 특징으로 하는 살아있는 세포의 집단을 선택합니다.
        참고: 선택적으로 분류하기 전에 0.1μg/mL의 4′,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 세포 현탁액에 추가합니다. 이렇게 하면 게이팅에서 죽은 세포와 자가사멸체를 버릴 수 있습니다.
      4. FSC-A 파라미터와 FSC-H 파라미터를 플로팅하여 셀 doublet과 triplet을 버립니다. 플롯의 대각선에 포함된 사건을 선택하여 singlet을 나타냅니다.
        참고: 세포가 레이저를 통과할 때 유세포분석기는 시간 경과에 따른 전압 변화를 감지합니다. FSC-A는 신호 면적을 나타내고 FSC-H는 피크 높이를 나타냅니다. 단일항은 FSC-A와 FSC-H(플롯의 대각선에 위치) 사이의 비례 관계를 보여주는 반면, 셀 응집체는 신호가 더 길기 때문에 FSC-H에 비해 더 큰 FSC-A를 표시합니다.
      5. 사용된 플라스미드에 의해 인코딩된 리포터 유전자의 형광 강도를 기반으로 nucleofected 세포를 선택합니다. 예를 들어, GFP+를 사용할 때 FITC-A 형광 수준과 SSC-A 플롯에 따라 세포를 선택할 수 있습니다.
      6. 각 조건에 대해 원하는 수의 표적 세포를 분리하고 완전한 배지로 채워진 수집 튜브에 직접 수집합니다.
      7. 10,000 cells/cm의 밀도에서 NSC를 종자합니다.2. 가습 인큐베이터에서 37 °C 및 5 % CO2 에서 분류 된 세포 배양을 배양합니다.
    2. 전략 B: 플라스미드에 인코딩된 항생제 내성을 이용한 선별
      1. 48시간의 핵절용 후 내성 세포를 선택하기 위해 적절한 농도의 항생제를 추가합니다.
        알림: 시작하기 전에 비핵계 세포에 대해 여러 농도의 항생제를 테스트하는 것이 좋습니다. 최적의 항생제 농도는 모든 비내성 세포가 제거되는 가장 낮은 양입니다. 예를 들어, NSC 배양에 대한 4μg/mL 항생제 블라스티딘의 최적 농도를 측정했습니다.
      2. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 가습 된 인큐베이터에서 48 시간 동안 세포를 배양합니다.
      3. 항생제 처리 48시간 후, 단계 2.1에 따라 핵절충된 세포를 계배양합니다. 신경구가 작게 유지되면 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 배양 배지에서 항생제를 제거합니다. 세포를 재현탁시키고 완전한 배지만 사용하여 플라스크에서 배양합니다. 37 ° C 및 5 % CO2 에서 2.1 단계 에 따라 확장 할 수 있을 때까지 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.

대표적 결과

최적의 배양 조건으로 체외에서 성인 SVZ 유래 NSC의 분리 및 증식이 가능합니다.
성인 SVZ에서 유래한 NSC 배양은 특정 미세환경 내에서 NSC를 조절하는 분자 메커니즘 및 틈새 신호를 조사하기 위한 유용한 시험관 내 분석법으로 사용되었습니다. 이 원고에 요약된 신경구 분석은 성인 SVZ 내의 NSC 수를 검사하는 데 사용되었습니다. SVZ 조직을 3개월 된 마우스의 뇌에서 분리하고, 해리하고, EGF와 bFGF를 모두 보충하거나 각각 따로 보충한 완전한 NSC 배지에서 배양했습니다. 10일 시험관입(DIV) 후, 이러한 세 가지 별개의 배양 조건 하에서 형성된 1차 구체의 총 수를 위상차 현미경을 사용하여 정량화했습니다(그림 2A,B). 놀랍게도, 우리의 발견은 EGF의 존재가 최대의 일차 구체 형성으로 이어졌다는 것을 보여주며, 이는 bFGF만 있는 배양에서 관찰되는 일차 구의 수가 감소한 것에서 분명합니다(그림 2A, B). 다양한 배지 조건에서 NSC의 자가 재생 능력을 평가하기 위해 세포를 하위 배양하고 앞서 언급한 미토겐 조합이 보충된 배지에서 저밀도(5 cells/μL)로 도금했습니다. 2차 구체 정량화에 따르면 SVZ NSC가 효율적으로 자가 재생되기 위해서는 최소한 EGF가 필요하며 EGF와 bFGF의 조합은 세포의 자가 재생 능력을 개선합니다(그림 2B). 또한, 다양한 배지 조건에 걸친 성장 역학의 자세한 분석을 위해 7개의 통로를 통해 파종되고 얻어진 세포의 수를 기록했습니다. 다양한 배지 조건에서 얻은 성장 곡선은 EGF를 단독으로 보충하거나 bFGF와 함께 보충한 배양이 bFGF만 보충한 배양에 비해 향상된 성장 동력을 나타냈다는 것을 확인했습니다(그림 2C). 종합적으로 이러한 결과는 EGF와 bFGF를 동시에 사용하면 시험관 내 NSC 배양 수율이 향상된다는 것을 입증합니다.

다양한 출생 후 연령에 걸쳐 SVZ 내 NSC 수를 조사하고 마우스 노화가 신경구 배양 효율성에 미치는 영향을 평가하기 위해 1개월에서 12개월까지의 마우스의 SVZ 조직을 절개했습니다. 특히, 우리의 연구 결과는 연령이 증가함에 따라 주요 구체의 수가 크게 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 생후 약 2-4개월에 구체 수의 최대 효율성을 보여줍니다(그림 2D). 또한, subcultureing 중 NSC의 자가 재생 능력을 평가하기 위해 2-4개월 된 마우스의 NSC를 하위 배양하고 완전한 배지에서 클론 밀도(5 cells/μL)로 파종했습니다. 후속 통로를 통한 2차 구체의 수를 정량화한 결과, 통로에 대한 배양 효율성이 상당히 감소한 것으로 나타났습니다(그림 2E). 이러한 모든 관찰을 바탕으로 NSC 배양 조건을 더욱 최적화하기 위해 초기 통로에서 자가 갱신 분석을 수행하는 것이 권장됩니다.

뉴클레오펙션(Nucleofection)은 성인 NSC에서 유전자 발현을 조작하기 위한 매우 효율적인 기술입니다
NSC는 유전자 발현을 조작하기 위해 쉽게 transfection할 수 없다는 점을 감안할 때, 여기에서는 바이러스 transduction을 사용할 필요 없이 더 높은 성공적인 유전자 전달률을 가진 nucleofection 프로토콜을 제시합니다. 2개월에서 4개월된 마우스의 개별 SVZ를 절개 및 배양한 후, NSC는 설명된 대로 GFP-운반 플라스미드로 핵융합되었습니다(그림 3A). 뉴클레오펙션 2일 후 GFP 양성 세포의 검출은 30%에서 50%에 이르는 효율을 나타냈으며, 이는 이전 문헌28과 일치했다. 성공적으로 뉴클레오펙션된 NSC를 특이적으로 분리하기 위해, 뉴클레오펙션(nucleofection) 3-5일 후의 GFP 형광 강도를 기준으로 FACS로 세포를 분류하였다(그림 3A-C). pre-FACS 분석 세포의 약 40%가 높은 GFP 형광 수준을 나타냈고 이후 분류를 통해 선택되었습니다(그림 3C). 분류된 GFP+ NSC의 재seeding은 모든 세포가 GFP 양성임을 보여주었으며, 이는 핵융합 기반 세포 분리 방법을 검증했습니다(그림 3D). 특히, 뉴클레오펙트된 NSC는 후속 과정을 통해 생존력을 유지하여 성인 NSC에 대한 뉴클레오펙션 타당성을 확인했습니다. 이러한 결과는 변형된 NSC의 순수 배양을 확립하기 위해 핵절충과 FACS를 결합하는 것의 효과를 강조합니다.

성인 NSC에서 유전자 조절의 예로, 짧은 헤어핀(sh) RNA 핵을 통한 유전자 감쇠가 사용되었습니다. 구체적으로, CAG-GFP 리포터(shSNRPN)를 운반하는 Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N(Snrpn) 유전자를 표적으로 하는 shRNA를 2개월 된 마우스에서 유래한 NSC 배양에서 핵융합했습니다. Snrpn의 하향 조절은 shSNRPN 플라스미드로 핵화된 세포에서 qPCR 및 면역세포화학에 의해 확인되었지만, 대조군 shSCRAMBLE 플라스미드에 대해서는 확인되지 않았습니다(그림 3E, F)29. NSC 자가 재생 능력에 대한 Snrpn 하향 조절의 효과를 설명하기 위해 핵절충된 세포에서 저밀도 분석을 수행했습니다(그림 3F,G). 핵절제된 배양에서 2차 신경구의 정량화는 Snrpn 하향 조절 시 신경구 형성 능력이 증가한다는 것을 보여주었습니다(그림 3G). 이 분석은 성인 NSC에서 유전자 발현을 조작할 수 있는 핵절착 능력을 강조하고, 보다 구체적으로 성인 NSC에서 줄기세포를 유지하는 데 있어 Snrpn의 역할을 식별합니다.

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그림 1: SVZ 해부에 대한 자세한 설명. (A) 쥐의 뇌를 제거한 후 전체 뇌를 DPBS로 실리콘 패드로 옮겨 절개합니다. (B) 산부인과와 소뇌를 메스를 사용하여 뇌에서 제거합니다. (C) 뇌는 두 개의 반구로 나뉘어 별도로 해부를 진행합니다. (D) 뇌는 뇌량(corpus callosum)의 선을 따라 열려 피질과 선조체를 해마, 중격 및 간뇌에서 분리하여 외측 심실을 노출시킵니다. (E-F) 해마(hippocampus), 중격(septum), 간뇌(diencephalon)는 심실의 복부 한계(ventral limit)를 따라 제거됩니다. (지-나) SVZ와 피질의 로스트랄 및 꼬리 끝 너머의 조직은 뇌량(corpus callosum)을 따라 제거됩니다. (제이케이) SVZ가 옆을 향하도록 조직이 기울어져 SVZ 아래의 선조체 조직을 제거할 수 있습니다. (L) SVZ를 포함하는 얇은 조직 조각이 얻어집니다. 검은색 점선은 절단 위치를 나타냅니다. 검은색 점선은 각 단계에서 SVZ의 위치를 나타냅니다. 약어: OB = 후각 전구; CB = 소뇌. AH의 눈금 막대 : 5 mm; I-L: 3mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 미토겐 EGF와 bFGF는 모두 in vitro에서 NSC의 최적 배양 및 확장에 필요합니다. (A) EGF 및 bFGF 또는 각 미토겐이 개별적으로 보충된 NSC 배지에서 1차 및 2차 신경권 배양의 위상차 현미경 이미지. (B) 배양 배지의 미토겐 조성에 따라 마우스당 및 웰당 얻어진 1차 구체의 수: 미토겐 없음(회색, n=9), EGF+bFGF(파란색, n=33), EGF만(녹색, n=20) 또는 bFGF(분홍색, n=19, 왼쪽 패널). 배양 배지의 미토겐 조성에 따라 웰당 낮은 밀도(5개 세포/μL)로 형성된 2차 신경구의 수: 미토겐 없음(회색, n=11), bFGF(분홍색, n=18), EGF(녹색, n=18) 또는 EGF+bFGF(파란색, n=37, 오른쪽 패널). Dunn의 사후 분석을 사용한 Kruskal-Wallis 테스트가 사용되었습니다. (C) 배양 배지에 존재하는 미토겐에 따라 뚜렷한 신경구 배양에서 8개 통과 후 형성된 세포의 총 수를 보여주는 성장 곡선: bFGF(분홍색, n=5), EGF(녹색, n=5) 또는 EGF+bFGF(파란색, n=10). 선형 회귀 분석이 사용되었습니다. (D) 다양한 출생 후 발달 단계의 동물에서 해부되고 분해된 개별 마우스에서 파생된 주요 신경구의 수. 선형 회귀 분석이 사용되었습니다. n은 괄호로 표시됩니다. (E) 자가 재생 능력을 평가하기 위해 시험관 내 후속 통로를 통해 저밀도(5개 세포/μL)에서 형성된 2차 신경구의 수. Kruskal-Wallis 검정이 사용되었으며 p 값이 포함됩니다 : * : p<0.05; **: p<0.01; : p<0.001; : p<0.0001. N.S: 중요하지 않습니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. A의 눈금 막대는 100 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: nucleofection 과정 및 nucleofected cell의 FACS 기반 cell selection의 개략도. (A) nucleofection 과정 및 nucleofected cell의 FACS 기반 cell selection에 대한 개요. 1) 플라스미드 DNA 용액을 뉴클레펙션 용액과 결합하여 세포에 첨가합니다. 그런 다음 이 혼합물을 뉴클레오펙션을 위해 큐벳으로 옮겨집니다. 2) DNA와 세포를 담고 있는 큐벳을 뉴클레오프텍터에 삽입하여 전기충격을 가합니다. 성인 SVZ에서 분리된 신경권 배양의 경우 A-031 NSC 프로그램을 사용하는 것이 좋습니다. 3) 뉴클레오펙션 후 세포는 EGF 및 bFGF가 보충된 완전한 배지가 포함된 플라스크로 옮겨집니다. 4) plasmid DNA에 포함된 reporter의 발현에 따라 FACS로 세포를 분류합니다. 5) 분류된 세포는 후속 실험을 위해 추가 배양을 거칩니다. (B) 핵융합된 NSC에 대한 FACS 기반 선택 전략 및 게이팅. 먼저 높은 FSC-A 및 높은 SSC-A를 기반으로 살아있는 세포를 선택한 다음(왼쪽 그래프) FSC-A 대 FSC-H 매개변수를 분석하여 세포 이중항 및 삼중항을 제거합니다(오른쪽 그래프). (C) GFP 발현을 기반으로 한 핵세포에 대한 FACS 게이팅(SSC-A 대 FITC-A 형광). (D) FACS 선택 전(n=3) 및 후(n=4) 핵화된 NSC의 위상차 현미경 및 GFP 형광 이미지(왼쪽 패널). nucleofected GFP+ 세포의 비율은 FACS 선택 전후에 표시됩니다(오른쪽 패널). t-검정이 사용되었습니다. (엘레) Snrpn 특이적 shRNA(n=4)로 핵화된 증식하는 NSC에서 Snrpn 발현의 정량적 PCR(qPCR) 분석. shRNA SCRAMBLE을 사용한 Nucleofection이 대조군으로 작용했습니다(n=4). t-검정이 사용되었습니다. (F) shRNA nucleofection 7일 후 NSC에서 SNRPN(빨간색)을 표시하는 면역세포화학 이미지(외부 패널). DNA를 대조염색하기 위해 DAPI를 사용했습니다. shSNRPN 및 shSCRAMBLE 조건에서 NSC에서 파생된 신경구를 묘사한 대표적인 이미지(중간 패널). (G) shSNRPN(n=8) 또는 shSCRAMBLE(n=8)을 사용한 핵절법 후 NSC 배양에서 형성된 신경구의 수 정량화. t-검정이 사용되었습니다. P 값이 포함됩니다 : * : P< 0.05; **: p<0.01; : p<0.001; : p<0.0001. N.S: 중요하지 않습니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. D의 눈금 막대, 10 μm; F, 100 μm(F, 7 μm의 고배율 이미지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

in vivo NSC 집단을 식별하기 위한 명확한 마커가 없기 때문에 NSC 분석은 주로 생체 외 조건에서 신경인성 틈새에서 분리된 세포의 거동을 관찰하는 데 기반을 두었습니다. Reynolds와 Weiss의 선구적인 연구는 비접착 조건에서 젊은 성인(2개월) 마우스 SVZ 조직의 개별 세포를 분리하고 확장할 수 있도록 정확한 배양 조건을 설정함으로써 토대를 마련했습니다. 이러한 세포는 일반적으로 EGF와 bFGF를 함유한 무혈청 배지에서 증식하며, 이러한 조건은 뉴런과 신경교세포로의 분화를 완전히 방지하면서 증식을 촉진합니다. 실제로, 이러한 배양 조건9 하에서, 대부분의 세포는 배양 첫 며칠 동안 죽지만, 소수의 부분집합이 분열하기 시작하여 주로 부유 신경구(floating neurosphere)9를 형성한다. 이러한 세포 응집체의 효소 해리 및 하위 배양은 배양 증식을 촉진하여 이러한 배양의 자가 재생 능력을 입증합니다.

특히, 신경권 배양은 EGF만 첨가하면 증식 가능성을 보이는 반면, bFGF만 함유하는 배지에서 성장한 NSC는 장기적인 세포 증식을 나타내지 않는다30. 두 증거 모두 EGF가 주요 NSC 자기 재생 미토겐임을 지적합니다. 그럼에도 불구하고, 배양 배지에서 EGF와 bFGF의 존재는 NSCs31의 자가 재생 능력을 향상시킬 뿐만 아니라 성상교세포, 뉴런 및 희소돌기아교세포(32,33,34,35)로의 분화 잠재력의 균형을 맞추는 데 기여합니다. 또한, 배지를 보충하기 위해 상업적 대안 대신 호르몬 및 요인의 정의된 혼합물을 사용하면 NSC 배양의 높은 품질과 재현성을 보장할 수 있습니다. 이러한 조건 하에서, 마우스 NSC 배양은 불멸화(immortalization)를 거치지 않고 안정적인 세포주로 지속될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 신경권 배양에서 우려되는 점은 증식성 세포 집단이 유전적 변형을 겪어 세포주기 조절 메커니즘을 우회하고 불멸화된 표현형으로 이어질 수 있는 가능성입니다. 따라서 신경권 배양은 확장성이 매우 높지만 체외 통로 10개 이상의 배양은 복제 노화를 겪을 수 있고 비정상적인 염색체 함량이나 불규칙한 성장 동력을 가진 세포가 나타날 수 있기 때문에 일반적으로 연구를 위해 폐기됩니다. 더욱이, 장기적으로 확립된 신경권 배양의 사용은 지속적으로 모니터링되어야 합니다. 신경권 배양은 또한 통제된 환경에서 그들의 특성과 잠재력을 검사할 수 있는 기회를 제공하며, 생체 내에서보다 더 정확하게 조절하고 모니터링할 수 있는 더 정확하고 조정 가능한 설정을 제공합니다. 체외에서 clonogenic 또는 집단 분석을 통해, 이러한 세포의 자가 재생 및 증식 능력을 정량화하는 것이 가능해, 이러한 특성을 지배하는 근본적인 메커니즘의 식별을 용이하게 합니다.

그럼에도 불구하고, in vitro에서 NSC와 협력하는 것의 많은 장점에도 불구하고, 이 배양 프로토콜의 특성과 NSC의 섬세함은 이 분야에서 도전 과제가 되고 있습니다. 예를 들어, 일반적인 해부 중에 생성되는 주요 신경구의 수는 실험자의 기술과 정밀도에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 1차 신경구 결과는 2개월 된 쥐의 SVZ에서 얻은 1차 신경구 수의 이러한 변동성을 보여주며, 이는 500개에서 3000개 사이의 신경구에 이릅니다. 다양한 요인이 이러한 변동성에 기여할 수 있습니다. 첫째, 박리의 정밀도는 원치 않는 실질 조직을 최소화하여 1차 구 형성을 억제합니다. 둘째, SVZ 조직의 작은 조각을 생성하면 효율적인 효소 소화 및 분쇄가 가능하여 세포 손실을 줄일 수 있습니다. 이는 해부 프로토콜의 충분한 사전 실습과 신경권 배양 확립 중 조직 처리의 미세 조정된 개발의 필요성을 강조합니다.

이러한 배양의 또 다른 한계는 신경구가 NSC와 전구 세포를 모두 포함할 수 있기 때문에 1차 배양 내에서 이 두 집단을 구별하기 어렵다는 사실에 있습니다. GFAP, Nestin, Musashi 및 SOX2와 같은 다양한 마커가 NSC8에 의해 발현되는 것으로 보고되었지만, 이들 중 어느 것도 NSC와 독점적으로 연관되어 있지는 않습니다. 세포 표면 항원 발현을 기반으로 하는 새로운 FACS 기술을 통해 NSC와 그 자손을 분리할 수 있습니다. 이러한 연구는 통과 증폭 전구 세포가통로 25, 36에서 신경 구체를 형성 할 수 없음을 입증했습니다. 따라서, SVZ 세포와 신경권 개시 세포 사이의 관계는 추가적인 개선이 필요하지만(18,19,20,21,22,23), 장기간에 걸쳐 연속적으로 통과할 수 있는 신경구의 능력은 배양에서 NSC의 존재를 반영할 수 있습니다.

이 신경구 배양 시스템은 시험관내 NSC 자가 재생 능력을 유지하는 데 있어 신호 전달 경로 및 유전자 발현의 영향을 조사하기 위한 강력한 모델 역할을 했습니다 15,29. 이러한 측면을 탐구하기 위한 한 가지 접근법은 NSC를 transfection하여 특정 유전자를 과발현하거나 knockdown하는 것입니다. 이는 바이럴 및 비바이럴 방법을 포함한 다양한 기술을 통해 달성할 수 있습니다. 바이러스 벡터는 종종 높은 유전자 전달 효율을 달성하지만, 높은 안전성 요구사항 및 시간 소모적인 벡터 생성과 같은 중요한 한계가 있다26. 반대로, lipofection 및 electroporation과 같은 고전적인 transfection 방법은 매우 낮은 transfection 속도를 달성하므로 transfection이 어려운 세포에는 적합하지 않습니다. 뉴클레오펙션 기술은 셀 유형별 뉴클레오펙션 용액을 각 셀 유형에 대한 고유한 전기적 매개변수와 결합하여 사용자 친화적인 접근 방식을 제공합니다(37,38). 이것은 DNA가 세포핵(39)으로 직접 전달되는 것을 보장하여, 세포주기-독립적인 방식으로 DNA 혼입을 가능하게 한다. 결과적으로, 뉴클레오펙션은 마우스 NSC와 같은 transfection이 어려운 세포를 transfection하기 위한 실행 가능한 기술로 부상하고 있습니다(28,40).

이 방법의 한 가지 제한은 각 핵에 대해 최소 2 x 106 세포가 권장되고 필요하지만, 최적의 조건에서는 단일 핵절× 더 적은 수의 세포가 사용될 수 있습니다(즉, 510 5 세포). 이 방법의 또 다른 단점은 핵절충에 사용되는 DNA의 품질과 농도가 유전자 전달 효율에 상당한 영향을 미친다는 것입니다. 내독소 존재로 인한 세포 폐사율 상승을 방지하기 위해 내독소가 없는 준비된 DNA를 사용하는 것이 적극 권장됩니다. 또한 핵절충을 위해 6μg 이상의 총 DNA를 사용하면 유전자 전달 효율과 세포 생존율을 모두 크게 감소시킬 수 있습니다. 마지막으로, 전기 펄스 투여는 핵세포의 생존에도 중요합니다.

이 연구에서 우리는 에피솜 플라스미드를 사용하여 발현의 하향 조절을 포함하는 전략을 사용하여 Snrpn 유전자 발현의 조작을 예시했습니다. 이러한 플라스미드는 세포의 게놈에 통합되지 않으며, NSC가 시험관 내에서 계속 증식함에 따라 도입된 DNA는 세포 분열을 따라 희석되어 유전자 조작의 효과를 잃게 됩니다. 따라서 이 전략은 단기간에 급격한 변화가 생기거나 생년월일 세포에 미치는 영향을 시험관 내에서 연구하는 데 유용합니다. 유전자 섭동의 더 장기적인 영향을 평가하기 위한 몇 가지 대안을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 트랜스포손 기반 piggyBAC과 같은 통합 시스템을 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 transposable sequences에 의해 측면에 포함된 플라스미드에 포함된 목적하는 암호화 서열을 도입하고, 효소 transposase41에 대한 서열을 포함하는 플라스미드와 세포를 co-nucleofect하는 것으로 구성됩니다. 또는 트랜스포손 또는 CRISPR/Cas 시스템을 사용할 수 있습니다.

transfection(transfection) 기술의 추가 개발은 성체 신경 줄기 세포 생리학에서 다양한 유전자의 역할을 평가하기 위한 고처리량 분석을 향한 중요한 단계가 될 것입니다. 점점 더 정교해지는 정제 및 확장 방법과 함께 이러한 연구를 통해 성인 NSC의 체외 생물학을 이해하고 부유 신경구와 생체 내 NSC 간의 생물학적 차이를 비교할 수 있습니다.

공개

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 작업은 Ministerio de Ciencia e Innovación 및 Agencia Estatal de Investigación (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 및 EUR2023-143479)를 SRF에 연결합니다. EJV(FPU20/00795) 및 DSL(FPU22/03797)은 Spanish Formación de Profesorado Universitario 펠로우십 프로그램(FPU)에서 자금을 지원합니다. LLC(PRE2020-094137) 및 JDM(PREP2022-000680)은 Spanish Formación de Personal Investigador(FPI) 펠로우십 프로그램의 자금 지원을 받습니다. CMM(CIACIF/2022/366)은 Generalitat Valenciana에서 자금을 지원합니다. MIL(CPI-22-481)은 Programa INVESTIGO 펠로우십(Next Generation EU)의 자금 지원을 받습니다. Ministerio de Ciencia e Innovación에서 제공하는 오픈 액세스 기금.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm pore-filter bottles (250 mL)VWR514-0330P
0.22 μm pore-filter bottles (500 mL)VWR514-0332P
12-well plateLabClinicsPLC30012
15 mL tubeFisher10738771
24-well plateLabClinicsPLC30024
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)BioWestL0180-100
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)SigmaD9542
48-well plateThermoFisher150687
6-well plateLabClinicsPLC30006
96-well plateLabclinicsPLC30096
Accutase solutionSigmaA6964-100MLReferred as enzymatic solution
Amaxa Mouse Neural Stem Cell Nucleofector KitLonzaVPG-1004
Amaxa Nucleofector IibLonza10700807
Antibiotic/Antimitotic (A/A)SigmaA5955
Apo-t-TransferrineSigmaT2252-1G
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)SigmaF0291
BlasticidinSigma203350
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaB4287-25MG
Cell strainer 40 μmLabClinicsPLC93040
Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)NZYTechMB08701
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418
Dulbecco’s Phosphate Saline Buffer (DPBS)Gibco14080-055
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) F12 1:1Gibco11320-074
E. coli DH5α Competent CellsThermoFisherEC0112
Earles's Balanced Salt Solution (EBSS)Gibco24010-043
Epidermal Growth Factor - Human recombinant (EGF)Gibco53003-018
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)SigmaE-6511
Fine ForcepsFine Science Tools11274-20
Fine Scissors SharpFine Science Tools14060-09
GlucoseSigmaG-7021
GoTaq G2 Flexi DNA PolymerasePromegaM7805Kit includes reagents for PCR
HeparinSigmaH-3149
InsulineSigmaI6634
LB agar (Lennox)LabKemAGLB-00P-500
LB broth (Lennox)LabKemLBBR-00P-500
L-CysteineSigmaC-8277
L-GlutamineGibco25030-024
Neubauer chamberBlaubrandBR718620
Nuclease free waterLabboxWATR-00A-10K
NZYMaxiprep Endotoxin Free KitNZYTechMB39901
Papain LyophilizedWorthingtonLS003119
ProgesteroneSigmaP-6149
PutrescineSigmaP-7505
ScalpelFine Science Tools10316-14
shSCRAMBLEMission (Sigma)SHC003
shSNRPNMission (Sigma)TRCN0000109285
Sodium SeleniteSigmaS-9133
SpatulaFine Science Tools10090-17
Sterile PES Syringe Filters (0.22 μm pore-filter)EpicaSFPE-22E-050
T12.5 cm2 FlaskBiofilTCF012025
T25 cm2 FlaskLabClinicsPLC70025
T75 cm2 FlaskLabClinicsPLC70075
TweezersFine Science Tools91150-20

참고문헌

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