В данной работе мы описываем нуклеофекционную систему, предназначенную для повышения эффективности доставки генов в расширенных нейральных стволовых клетках (НСК), выделенных из субвентрикулярной зоны взрослой мыши. Полученные данные показывают, что этот метод значительно улучшает возмущение генов в НСК, превосходя по эффективности традиционные протоколы трансфекции и повышая выживаемость клеток.
Выделение и экспансия нейральных стволовых клеток (НСК) из субвентрикулярной зоны (SVZ) мозга взрослой мыши может быть достигнута в среде, дополненной основным фактором роста фибробластов (bFGF) и эпидермальным фактором роста (EGF) в виде митогенов, образующих клональные агрегаты, известные как нейросферы. Эта система in vitro является ценным инструментом для изучения потенциала НСК. Трансфекция миРНК или генов, переносимых в плазмидах, может быть использована для индуцирования нарушений экспрессии генов и изучения биологии НСК. Однако доставка экзогенных нуклеиновых кислот в культуры НСК затруднена из-за низкой эффективности трансфекции клеток центральной нервной системы (ЦНС). В данной работе мы представляем усовершенствованную систему нуклеофекции, которая обеспечивает высокую эффективность доставки генов в расширенные НСК от взрослых мышей SVZ. Мы демонстрируем, что этот относительно простой метод усиливает возмущение генов у взрослых НСК, превосходя традиционные протоколы трансфекции с выживаемостью более 80%. Более того, этот метод также может быть применен в первичных изолированных НСК, обеспечивая решающий прогресс в исследованиях функций генов за счет манипулирования экспрессией генов посредством нокдауна или сверхэкспрессии в культурах нейросферы.
Нейральные стволовые клетки (НСК) являются мультипотентными стволовыми клетками, проживающими в головном мозге. Эти клетки обладают способностью к самообновлению и дифференцировке в три нейронные линии: астроциты, олигодендроциты инейроны. Следовательно, НСК играют решающую роль в нейрогенезе взрослых млекопитающих, процессе, при которомв мозге генерируются новые нейроны. НСК преимущественно находятся в двух областях мозга взрослого человека, называемых нейрогенными нишами: субвентрикулярной зоне (SVZ) вдоль стенок боковых желудочков и субгранулярной зоне (SGZ) в зубчатой извилине гиппокампа 3,4. НСК (также известные как В-клетки) в СВЗ, наиболее активной нейрогенной нише у взрослой мыши, самообновляются и производят транзит-амплифицирующие предшественники (TAPs или C-клетки), которые впоследствии дифференцируются в нейробласты (А-клетки). Эти нейробласты мигрируют через ростральный миграционный поток (RMS) к обонятельным луковицам (OB), где они подвергаются полной дифференцировке в интернейроны, интегрируясь в ранее существовавшие схемы 3,4,5,6.
Понимание сложного взаимодействия молекулярных сигналов и сигналов, которые регулируют НСК в этих нишах, важно для использования их потенциала в терапевтических целях. С этой целью были разработаны различные методы изучения этой клеточной популяции, начиная от селективной первичной культуры НСК и заканчивая отбором клеток с использованием поверхностных маркеров 7,8,9,10. В настоящей рукописи подробно описывается выделение и культивирование НСК SVZ in vitro с использованием бессывороточной селективной среды, содержащей оба митогена: основной фактор роста фибробластов (bFGF) и эпидермальный фактор роста (EGF). Эта среда способствует пролиферации клеток и поддерживает стволовость НСК, полученных из СВЗ мозга взрослых мышей, образуя in vitro клональные, трехмерные, неадгезивные агрегаты, известные как нейросферы9. Культуры нейросферы служат управляемой платформой для манипулирования и изучения молекулярных механизмов и факторов, влияющих на пролиферацию, самообновление, дифференцировкуи выживание НСК. Примечательно, что количество первичных нейросфер, образованных в культуре, позволяет оценить количество НСК, присутствующих в СВЗ in vivo, что делает его мощным инструментом для изучения влияния различных состояний на пул взрослых НСК12,13. Более того, после того, как первичная культура создана, НСК могут генерировать новые агрегаты (вторичные нейросферы) при прохождении через симметричные деленияв условиях пролиферации. Таким образом, для оценки скорости самообновления этих культур можно использовать посев вторичных нейросферных клеток с низкой плотностью (клональный анализ) 4,15,16,17.
Несмотря на потенциал нейросфер в раскрытии механизмов, управляющих регуляцией НСК, некоторые исследователи ставят под сомнение достоверность выводов in vitro, утверждая, что искусственные условия, в которых растут клетки, могут не точно воспроизводить сложное микроокружение in vivo нейрогенных ниш 18,19,20,21,22. Еще один спорный момент связан с наблюдаемой гетерогенностью в нейросферах. Тем не менее, считается, что эта изменчивость отражает симметричное и асимметричное деление НСК, которые естественным образом происходят in vivo23,24. Кроме того, недавняя валидация подтвердила использование культур НСК для прогнозирования механизмов, действующих в нейрогенной нише SVZ in vivo, и несколько исследований показали, что НСК, культивируемые in vitro, точно поддерживают транскриптомный профиль, наблюдаемый in vivo11,25.
Таким образом, культуры нейросферы служат не только методом изучения пролиферации и дифференцировки НСК, но и предлагают систему для изучения влияния генов, управляющих биологией НСК. Ключевым методом исследования функции генов в НСК является пертурбация экспрессии генов. МиРНК или гены, доставляемые через плазмиды, могут быть трансфицированы в клеточные культуры, что приводит к нокдауну или апрегуляции гена-мишени. Такой универсальный подход значительно сокращает время и затраты по сравнению с созданием культур с использованием мышей с условным нокаутом, представляя собой многообещающее направление для разгадки генетических основ нейрогенеза и изучения терапевтических перспектив. Изменение экспрессии определенных генов в НСК позволяет модулировать их поведение, влияя на важнейшие биологические процессы, такие как пролиферация, дифференцировка и миграция. Тем не менее, перспектива трансфекции НСК, особенно в нейросферах мышей, представляет собой заметную проблему. Трехмерная структура нейросфер ставит под угрозу эффективность трансфекции, что часто приводит к низким показателям успешной доставки экзогенных нуклеиновых кислот, что ограничивает масштабы генетических манипуляций26,27. Кроме того, процедуры трансфекции могут пагубно повлиять на жизнеспособность и функциональность клеток27. В этом контексте мы представляем систему нуклеофекции как метод смягчения повреждения клеток, достигая высокой выживаемости и обеспечивая более высокую эффективность в анализах доставки генов, используемых для возмущения культур НСК.
Данная рукопись призвана проиллюстрировать процедуру выделения, расширения и нуклеофекции НСК из нейрогенной ниши взрослого СВЗ для возмущения генов с использованием системы нейросферных культур. Этот метод превосходит по эффективности традиционные протоколы трансфекции, обеспечивая значительно более высокие показатели выживаемости и улучшенную эффективность доставки генов среди целевых клеток.
Все эксперименты, проводимые на животных, были предварительно одобрены Этическим комитетом Университета Валенсии и одобрены Conselleria de Agricultura, Ganadería y Pesca, Generalitat Valenciana (Испания).
1. Первичная культура нейросфер
Таблица 1: Решения для питательных сред. Описана рецептура контрольной среды. Делается предварительно смешанный раствор гормональной смеси. Исходные гормональные растворы могут быть приготовлены заранее в соответствии с указаниями и храниться при температуре -20 °C. Перед культивированием клеток добавьте в контрольную среду EGF и bFGF для получения полной среды. Для каждого компонента предоставляются спецификации хранения, запасы и рабочие концентрации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
2. Экспансия культур нейросферы
Таблица 2: Тарелки и колбы, используемые для культивирования. Приведены размеры и объемы наиболее часто используемых высевающих пластин и колб. Таблица включает в себя диаметр, площадь роста и объем среды, используемые для каждого сосуда, а также пример количества NSC, которые должны быть засеяны в условиях расширения (10 000 ячеек/см2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
3. Нуклеофекция культур нейросферы
Оптимальные условия культивирования позволяют выделять и расширять НСК взрослого человека, полученных из СВЗ, in vitro
Культуры НСК, полученные из взрослого СВЗ, послужили ценным методом in vitro для исследования молекулярных механизмов и нишевых сигналов, регулирующих НСК в их специфическом микроокружении. Анализ нейросферы, описанный в этой рукописи, был использован для изучения количества NSC у взрослого SVZ. Ткань SVZ была выделена из мозга 3-месячных мышей, диссоциирована и культивирована в полной среде NSC с добавлением EGF и bFGF или каждого из них по отдельности. После 10 дней in vitro (DIV) общее количество первичных сфер, образовавшихся в этих трех различных условиях культивирования, было количественно определено с помощью фазово-контрастной микроскопии (рис. 2A, B). Примечательно, что наши результаты показывают, что присутствие EGF приводило к максимальному образованию первичных сфер, что очевидно из уменьшенного количества первичных сфер, наблюдаемого в культурах только с bFGF (рис. 2A, B). Для оценки способности НСК к самообновлению в различных условиях среды клетки подвергали субкультивированию и осаждению с низкой плотностью (5 клеток/мкл) в средах с добавлением вышеупомянутых комбинаций митогенов. Количественное определение вторичных сфер показало, что НСК СВЗ нуждаются по крайней мере в EGF для эффективного самообновления, и что комбинация EGF и bFGF улучшает способность клеток к самообновлению (рис. 2B). Кроме того, для детального анализа динамики роста в различных средах было зарегистрировано количество засеянных и полученных клеток на протяжении 7 пассажей. Кривые роста, полученные при различных средах, подтвердили, что культуры, дополненные только EGF или в комбинации с bFGF, продемонстрировали улучшенную динамику роста по сравнению с культурами, только дополненными bFGF (рис. 2C). В совокупности эти результаты подтверждают, что одновременное использование как EGF, так и bFGF повышает урожайность культивирования NSC in vitro.
Для того чтобы исследовать количество НСК в СВЗ в разных постнатальных возрастах и оценить влияние старения мышей на эффективность культуры нейросферы, была проанализирована ткань СВЗ у мышей в возрасте от 1 до 12 месяцев. Примечательно, что наши результаты показали значительное снижение количества первичных сфер с увеличением возраста, демонстрируя максимальную эффективность в количестве сфер в возрасте от 2 до 4 месяцев (Рисунок 2D). Кроме того, для оценки способности НСК к к самообновлению во время субкультивирования НСК от мышей в возрасте от 2 до 4 месяцев подкультивировали и высевали с клональной плотностью (5 клеток/мкл) в полной среде. Количественная оценка количества вторичных сфер в последующих проходах показала значительное снижение эффективности культивирования по сравнению с проходами (рисунок 2E). На основании всех этих наблюдений рекомендуется проведение анализов самообновления во время ранних пассажей для дальнейшей оптимизации условий культивирования НСК.
Нуклеофекция является высокоэффективным методом манипулирования экспрессией генов у взрослых НСК
Учитывая, что НСК не поддаются простой трансфекции для манипулирования экспрессией генов, здесь мы представляем протокол нуклеофекции с более высокой скоростью успешной доставки генов без необходимости использования вирусной трансдукции. После вскрытия и культивирования отдельных СВЗ у мышей в возрасте от 2 до 4 месяцев НСК подвергали нуклеофекции плазмидой, несущей GFP, как описано (рис. 3A). Обнаружение GFP-положительных клеток через 2 дня после нуклеофекции показало эффективность в диапазоне от 30% до 50%, что согласуется с предыдущей литературой28. Для выделения успешно функционирующих НСК клетки сортировали с помощью FACS на основе интенсивности флуоресценции GFP через 3–5 дней после нуклеофекции (рис. 3A-C). Примерно 40% клеток, проанализированных до FACS, продемонстрировали высокий уровень флуоресценции GFP и впоследствии были отобраны путем сортировки (рис. 3C). Повторный посев отсортированных GFP+ NSC показал, что все клетки были GFP-положительными, что подтверждает валидацию метода выделения клеток на основе нуклеофекции (рисунок 3D). Примечательно, что нуклеофектированные НСК сохраняли жизнеспособность в течение последующих пассажей, подтверждая возможность нуклеофекции для взрослых НСК. Эти результаты подчеркивают эффективность комбинации нуклеофекции и FACS для создания чистой культуры модифицированных НСК.
В качестве примера модуляции генов у взрослых НСК использовалось ослабление генов с помощью нуклеофекции короткой шпильки (sh) РНК. В частности, shRNA, нацеленная на ген малого ядерного рибонуклеопротеина полипептида N (Snrpn), несущего репортер CAG-GFP (shSNRPN), была nucleofected в культурах NSC, полученных от 2-месячных мышей. Подавление Snrpn было подтверждено с помощью количественной ПЦР и иммуноцитохимии в клетках, нуклеофектированных плазмидой shSNRPN, но не в контрольной плазмиде shSCRAMBLE (рис. 3E, F)29. Чтобы выяснить влияние подавления Snrpn на способность НСК к самообновлению, был проведен анализ низкой плотности в нуклеофectированных клетках (рис. 3F, G). Количественное определение вторичных нейросфер в нуклеофектированных культурах показало повышенную способность нейросферы к образованию при подавлении Snrpn (рис. 3G). Этот анализ подчеркивает способность нуклеофекции манипулировать экспрессией генов во взрослых НСК и, в частности, определяет роль Snrpn в поддержании стволовости у взрослых НСК.
Рисунок 1: Подробное описание вскрытия СВЗ. (А) После удаления мозга мыши, весь мозг переносится с помощью DPBS на силиконовую прокладку для вскрытия. (Б) OB и мозжечок удаляются из мозга с помощью скальпеля. (В) Мозг разделяется на два полушария для проведения раздельного вскрытия. (D) Мозг открывается по линии мозолистого тела, отделяя кору и полосатое тело от гиппокампа, перегородки и промежуточного мозга, тем самым обнажая боковые желудочки. (Э-Ж) Гиппокамп, перегородка и промежуточный мозг удаляются вслед за вентральной границей желудочков. (Г-И) Ткань за ростральным и каудальным концами СВЗ и корой удаляется вслед за мозолистым телом. (Дж-К) Ткань наклоняется таким образом, что СВЗ обращена вбок, что позволяет удалить ткань полосатого тела под СВЗ. (L) Получается тонкий кусочек ткани, содержащий СВЗ. Черными пунктирными линиями обозначено место среза. Черными пунктирными линиями обозначено расположение СВЗ на каждом шаге. Сокращения: OB = обонятельная луковица; CB = мозжечок. Масштабная линейка в A-H: 5 мм; в I-L: 3 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Оба митогена EGF и bFGF необходимы для оптимального культивирования и расширения НСК in vitro. (A) Фазово-контрастные микроскопические изображения первичных и вторичных культур нейросферы в среде НСК с добавлением EGF и bFGF или каждого митогена в отдельности. (B) Количество первичных сфер, полученных на мышь и на лунку в зависимости от митогенного состава питательной среды: без митогенов (серый, n=9), EGF+bFGF (синий, n=33), только EGF (зеленый, n=20) или только bFGF (розовый, n=19; левая панель). Количество вторичных нейросфер, образующихся при низкой плотности (5 клеток/мкл) на лунку в зависимости от митогенного состава питательной среды): нет митогенов (серый, n=11), bFGF (розовый, n=18), EGF (зеленый, n=18) или EGF+bFGF (синий, n=37; правая панель). Использовался критерий Краскела-Уоллиса с апостериорным анализом Данна. (C) Кривые роста, показывающие общее количество клеток, образовавшихся после 8 пассажей в различных культурах нейросферы в соответствии с митогенами, присутствующими в культуральной среде: bFGF (розовый, n=5), EGF (зеленый, n=5) или EGF+bFGF (синий, n=10). Использовался линейный регрессионный анализ. (D) Количество первичных нейросфер, полученных от отдельных мышей, препарированных и дезагрегированных от животных на различных постнатальных стадиях развития. Использовался линейный регрессионный анализ. n указан в скобках. (E) Количество вторичных нейросфер, образующихся при низкой плотности (5 клеток/мкл) в результате последующих пассажей in vitro для оценки их способности к самообновлению. Был использован критерий Краскела-Уоллиса, в который включены значения p: *: p<0,05; **: p<0.01; : р<0,001; : p<0.0001. Н.Ш.: Незначительный. Полосы погрешностей представляют собой SEM. Масштабная линейка в A составляет 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схема процесса нуклеофекции и отбор клеток нуклеофекции на основе FACS. (A) Обзор процесса нуклеофекции и отбора клеток нуклеофected клеток на основе FACS. 1) Раствор плазмидной ДНК соединяют с раствором нуклеофекции и добавляют в клетки. Затем эту смесь переносят в кювету для нуклеофекции. 2) Кювета, содержащая ДНК и клетки, вставляется в нуклеофектор, где применяется электрошок. Для культур нейросферы, выделенных из взрослого СВЗ, рекомендуется использовать программу А-031 НСК. 3) После нуклеофекции клетки переносятся в колбу, содержащую полноценную среду с добавлением EGF и bFGF. 4) Клетки сортируются с помощью FACS на основе экспрессии репортера, содержащегося в плазмидной ДНК. 5) Отсортированные клетки подвергают дальнейшей культивации для последующих экспериментов. (B) Стратегия отбора на основе FACS и гейтирование для нуклеофектированных НСК. Сначала отбираются живые клетки на основе высокого FSC-A и высокого SSC-A (левый график), а затем удаляются клеточные дублеты и триплеты путем анализа параметров FSC-A в сравнении FSC-H (правый график). (C) FACS-гейтинг для нуклеофectированных клеток на основе их экспрессии GFP (SSC-A в сравнении с флуоресценцией FITC-A). (D) Фазово-контрастная микроскопия и флуоресцентные изображения GFP нуклеофectированных НСК до (n=3) и после (n=4) отбора FACS (левая панель). Процент нуклеофекцированных клеток GFP+ отображается до и после выбора FACS (правая панель). Был использован t-критерий. (Д) Количественная ПЦР (кПЦР) анализ экспрессии Snrpn в пролиферирующих НСК, нуклеофектированных Snrpn-специфичной шРНК (n=4). В качестве контроля проводилась нуклеофекция с помощью СКРЕМБЛ шРНК (n=4). Был использован t-критерий. (F) Иммуноцитохимические изображения, показывающие SNRPN (красным) в НСК через 7 дней после нуклеофекции шРНК (внешние панели). DAPI использовался для противодействия окрашиванию ДНК. Репрезентативные изображения, изображающие нейросферы, полученные из НСК в условиях shSNRPN и shSCRAMBLE (средние панели). (G) Количественная оценка количества нейросфер, образующихся в культурах НСК после нуклеофекции с помощью shSNRPN (n=8) или shSCRAMBLE (n=8). Был использован t-критерий. Включены значения p: *: p<0,05; **: p<0.01; : р<0,001; : p<0.0001. Н.Ш.: Незначительный. Шкала в D, 10 мкм; в F, 100 μm (изображения с большим увеличением в F, 7 μm). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Из-за отсутствия окончательных маркеров для идентификации популяции НСК in vivo, анализ НСК был основан в первую очередь на наблюдении за поведением клеток, выделенных из нейрогенных ниш, в условиях ex vivo . Новаторская работа Рейнольдса и Вайса заложила основу для создания точных условий культивирования, позволяющих выделять и расширять отдельные клетки из молодой взрослой (2-месячной) мышиной ткани SVZ в неадгезивных условиях. Эти клетки обычно размножаются в бессывороточной среде, содержащей EGF и bFGF, условиях, которые полностью препятствуют дифференцировке в нейроны и глию, способствуя пролиферации. Действительно, вэтих условиях культивирования большинство клеток умирает в течение первых дней в культуре, но небольшая часть начинает делиться и в первую очередь образует плавающиенейросферы. Ферментативная диссоциация и субкультура этих клеточных агрегатов способствуют размножению культур, демонстрируя способность этих культур к самообновлению.
Примечательно, что культуры нейросферы демонстрируют потенциал экспансии при добавлении только EGF, в то время как НСК, выращенные в среде, содержащей только bFGF, не демонстрируют длительной пролиферацииклеток30. Оба доказательства указывают на то, что EGF является основным самообновляющимся митогеном НСК. Тем не менее, присутствие как EGF, так и bFGF в культуральной среде улучшает способность к самообновлению НСК31, а также способствует балансировке потенциала дифференцировки в астроциты, нейроны и олигодендроциты 32,33,34,35. Кроме того, использование определенной смеси гормонов и факторов вместо коммерческих альтернатив для дополнения среды обеспечивает высокое качество и воспроизводимость культур НСК. В этих условиях культуры NSC мышей могут сохраняться в качестве стабильных клеточных линий, не подвергаясь иммортизации. Тем не менее, в нейросферных культурах вызывает озабоченность способность пролиферативных клеточных популяций претерпевать генетические трансформации, минуя механизмы регуляции клеточного цикла и приводя к иммортализованному фенотипу. Таким образом, несмотря на то, что культуры нейросферы обладают высокой способностью к расширению, культуры за пределами 10 пассажей in vitro обычно отбраковываются для исследований, поскольку они могут подвергаться репликативному старению, и могут появиться клетки с аномальным содержанием хромосом или нерегулярной динамикой роста. Кроме того, необходимо постоянно контролировать использование долговременных культур нейросферы. Культуры нейросферы также дают возможность исследовать их характеристики и потенциал в контролируемой среде, обеспечивая более точную и настраиваемую настройку, которую можно модулировать и контролировать более точно, чем in vivo. С помощью клоногенного или популяционного анализа in vitro можно количественно оценить способности этих клеток к самообновлению и пролиферации, что облегчает идентификацию основных механизмов, управляющих этими свойствами.
Тем не менее, несмотря на большой список преимуществ работы с НСК in vitro, характер этого протокола культивирования и деликатность НСК представляют собой проблему в этой области. Например, количество первичных нейросфер, образующихся во время типичного вскрытия, может значительно варьироваться в зависимости от мастерства и точности экспериментатора. Результаты исследования первичной нейросферы иллюстрируют эту изменчивость в количестве первичных нейросфер, полученных из СВЗ двухмесячных мышей, в диапазоне от 500 до 3000 нейросфер. Различные факторы могут способствовать этой изменчивости. Во-первых, точность диссекции сводит к минимуму нежелательную паренхиматозную ткань, которая препятствует образованию первичной сферы. Во-вторых, получение небольших кусочков ткани SVZ обеспечивает эффективное ферментативное сбраживание и растирание, тем самым уменьшая потерю клеток. Это подчеркивает необходимость достаточной предварительной практики протокола вскрытия и тонко настроенной разработки процессинга тканей во время создания культур нейросферы.
Еще одно ограничение этих культур заключается в том, что нейросферы могут содержать как НСК, так и клетки-предшественники, что затрудняет дифференциацию этих двух популяций в первичных культурах. В то время как различные маркеры, такие как GFAP, Nestin, Musashi и SOX2, экспрессируются NSCs8, ни один из них не был связан исключительно с NSCs. Новые методы FACS, основанные на экспрессии антигена клеточной поверхности, позволили выделить NSC и их потомство. Эти исследования показали, что предшественники, усиливающие транзит, не способны образовывать нейросферы при прохождении 25,36. Таким образом, в то время как отношения между клетками SVZ и клетками, инициирующими нейросферу, требуют дальнейшего уточнения 18,19,20,21,22,23, способность нейросфер к последовательному прохождению в течение длительного периода времени может отражать присутствие НСК в культурах.
Эта система культивирования нейросферы послужила надежной моделью для исследования влияния сигнальных путей и экспрессии генов на поддержание способности НСК к самообновлению in vitro 15,29. Один из подходов к изучению этих аспектов включает в себя трансфекцию НСК для либо сверхэкспрессии, либо подавления определенных генов. Это может быть достигнуто с помощью различных методов, в том числе вирусных и невирусных. В то время как вирусные векторы часто достигают высокой эффективности переноса генов, они имеют важные ограничения, такие как высокие требования к безопасности и трудоемкое производство векторов. И наоборот, классические методы трансфекции, такие как липофекция и электропорация, достигают очень низких показателей трансфекции, что делает их неосуществимыми для трудно трансфицируемых клеток. Технология нуклеофекции предлагает удобный для пользователя подход, сочетая решения для нуклеофекции, специфичные для типа клетки, с уникальными электрическими параметрами для каждого типа клеток37,38. Это обеспечивает перенос ДНК непосредственно в ядро клетки39, что позволяет встраивать ДНК независимым от клеточного цикла образом. Следовательно, нуклеофекция становится жизнеспособным методом для трансфекции труднотрансфицируемых клеток, таких как НСК мышей28,40.
Одним из ограничений этого метода является то, что для каждой нуклеофекции рекомендуется и необходимо минимум 2 x 106 клеток, хотя в оптимальных условиях можно использовать меньшее количество клеток на одну нуклеофекцию (т.е. 5 × 105 клеток). Еще одним недостатком метода является то, что качество и концентрация ДНК, используемой для нуклеофекции, существенно влияют на эффективность переноса генов. Использование подготовленной ДНК, не содержащей эндотоксинов, настоятельно рекомендуется для предотвращения повышенной смертности клеток из-за присутствия эндотоксинов. Кроме того, использование более 6 мкг общей ДНК для нуклеофекции может существенно снизить как эффективность переноса генов, так и жизнеспособность клеток. Наконец, введение электрического импульса также имеет решающее значение для выживания нуклеофectированных клеток.
В этой работе мы продемонстрировали манипулирование экспрессией гена Snrpn с помощью стратегии, включающей подавление его экспрессии с помощью эписомальных плазмид. Эти плазмиды не интегрированы в геном клеток, и поскольку НСК продолжают размножаться in vitro, введенная ДНК впоследствии разбавляется по мере деления клеток и, таким образом, теряет эффект генетической манипуляции. Таким образом, эта стратегия ценна для изучения эффекта острого изменения в течение короткого периода времени или для рождения клеток in vitro. Существуют некоторые альтернативы для оценки более длительного эффекта возмущения генов. Например, можно использовать интегративную систему, такую как piggyBAC на основе транспозонов. Эта система состоит из введения желаемой кодирующей последовательности, содержащейся в плазмиде, фланкированной транспонируемыми последовательностями, и совместного нуклеофекта клеток с плазмидой, содержащей последовательность фермента транспозазы41. В качестве альтернативы можно использовать транспозоны или системы CRISPR/Cas.
Дальнейшее развитие технологий трансфекции станет важным шагом на пути к высокопроизводительным анализам для оценки роли различных генов в физиологии взрослого нервного стволового клетки. В сочетании со все более сложными методами очистки и экспансии, эти исследования позволят понять биологию взрослых НСК in vitro и сравнить биологические различия между плавающими нейросферами и НСК in vivo.
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Эта работа была поддержана грантами от Ministerio de Ciencia e Innovación и Agencia Estatal de Investigación (MCIN/AEI) (PID2019-110045GB-I00; PID2022-142734OB-I00 и EUR2023-143479) в SRF. EJV (FPU20/00795) и DSL (FPU22/03797) финансируются испанской стипендиальной программой Formación de Profesorado Universitario (FPU). LLC (PRE2020-094137) и JDM (PREP2022-000680) финансируются в рамках испанской программы стипендий Formación de Personal Investigador (FPI). CMM (CIACIF/2022/366) финансируется Женералитатом Валенсии. MIL (CPI-22-481) финансируется стипендией Programa INVESTIGO (Next Generation EU). Финансирование в открытом доступе предоставлено Ministerio de Ciencia e Innovación.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm pore-filter bottles (250 mL) | VWR | 514-0330P | |
0.22 μm pore-filter bottles (500 mL) | VWR | 514-0332P | |
12-well plate | LabClinics | PLC30012 | |
15 mL tube | Fisher | 10738771 | |
24-well plate | LabClinics | PLC30024 | |
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | BioWest | L0180-100 | |
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
48-well plate | ThermoFisher | 150687 | |
6-well plate | LabClinics | PLC30006 | |
96-well plate | Labclinics | PLC30096 | |
Accutase solution | Sigma | A6964-100ML | Referred as enzymatic solution |
Amaxa Mouse Neural Stem Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPG-1004 | |
Amaxa Nucleofector Iib | Lonza | 10700807 | |
Antibiotic/Antimitotic (A/A) | Sigma | A5955 | |
Apo-t-Transferrine | Sigma | T2252-1G | |
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | |
Blasticidin | Sigma | 203350 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25MG | |
Cell strainer 40 μm | LabClinics | PLC93040 | |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTPs) | NZYTech | MB08701 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
Dulbecco’s Phosphate Saline Buffer (DPBS) | Gibco | 14080-055 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) F12 1:1 | Gibco | 11320-074 | |
E. coli DH5α Competent Cells | ThermoFisher | EC0112 | |
Earles's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | |
Epidermal Growth Factor - Human recombinant (EGF) | Gibco | 53003-018 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E-6511 | |
Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
Fine Scissors Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase | Promega | M7805 | Kit includes reagents for PCR |
Heparin | Sigma | H-3149 | |
Insuline | Sigma | I6634 | |
LB agar (Lennox) | LabKem | AGLB-00P-500 | |
LB broth (Lennox) | LabKem | LBBR-00P-500 | |
L-Cysteine | Sigma | C-8277 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
Neubauer chamber | Blaubrand | BR718620 | |
Nuclease free water | Labbox | WATR-00A-10K | |
NZYMaxiprep Endotoxin Free Kit | NZYTech | MB39901 | |
Papain Lyophilized | Worthington | LS003119 | |
Progesterone | Sigma | P-6149 | |
Putrescine | Sigma | P-7505 | |
Scalpel | Fine Science Tools | 10316-14 | |
shSCRAMBLE | Mission (Sigma) | SHC003 | |
shSNRPN | Mission (Sigma) | TRCN0000109285 | |
Sodium Selenite | Sigma | S-9133 | |
Spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
Sterile PES Syringe Filters (0.22 μm pore-filter) | Epica | SFPE-22E-050 | |
T12.5 cm2 Flask | Biofil | TCF012025 | |
T25 cm2 Flask | LabClinics | PLC70025 | |
T75 cm2 Flask | LabClinics | PLC70075 | |
Tweezers | Fine Science Tools | 91150-20 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены