JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تستخدم خميرة الانشطار هنا كمضيف غير متجانس للتعبير عن البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية مثل FtsZ و MreB كبروتينات اندماج متعدية مع GFP لتصور بلمرتها. أيضا ، يتم تحديد المركبات التي تؤثر على البلمرة عن طريق التصوير باستخدام المجهر الفلوري.

Abstract

تؤدي البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية مثل FtsZ و MreB وظائف أساسية مثل انقسام الخلايا والحفاظ على شكل الخلية. علاوة على ذلك ، برزت FtsZ و MreB كأهداف مهمة لاكتشاف مضادات الميكروبات الجديدة. تم تطوير العديد من المقايسات لتحديد المركبات التي تستهدف ربط النوكليوتيدات وبلمرة هذه البروتينات الهيكلية الخلوية ، والتي تركز بشكل أساسي على FtsZ. علاوة على ذلك ، فإن العديد من الفحوصات إما شاقة أو كثيفة التكلفة ، والتأكد مما إذا كانت هذه البروتينات هي الهدف الخلوي للدواء غالبا ما يتطلب طرقا متعددة. أخيرا ، تشكل سمية الأدوية للخلايا حقيقية النواة مشكلة أيضا. هنا ، نصف مقايسة قائمة على الخلية من خطوة واحدة لاكتشاف جزيئات جديدة تستهدف الهيكل الخلوي البكتيري وتقليل الضربات التي قد تكون سامة للخلايا حقيقية النواة. خميرة الانشطار قابلة للشاشات عالية الإنتاجية القائمة على الفحص المجهري ، ويمكن للشاشة المرئية التعرف بسهولة على أي جزيء يغير بلمرة FtsZ أو MreB. يستخدم الفحص الخاص بنا الصفيحة القياسية المكونة من 96 بئرا ويعتمد على قدرة البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية على البلمرة في خلية حقيقية النواة مثل خميرة الانشطار. في حين أن البروتوكولات الموصوفة هنا مخصصة لخميرة الانشطار وتستخدم FtsZ من المكورات العنقودية الذهبية و MreB من الإشريكية القولونية ، إلا أنها قابلة للتكيف بسهولة مع البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية الأخرى التي تتجمع بسهولة في البوليمرات في أي مضيفات تعبير حقيقية النواة. يجب أن تساعد الطريقة الموصوفة هنا في تسهيل اكتشاف المزيد من مضادات الميكروبات الجديدة التي تستهدف البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية.

Introduction

خلقت المقاومة الواسعة النطاق لجميع المضادات الحيوية المستخدمة حاليا لمكافحة الالتهابات البكتيرية ضرورة فورية لفئات جديدة من المضادات الحيوية. أشار تقرير صدر عام 2019 إلى أن العدوى المقاومة للمضادات الحيوية أدت إلى فقدان 1.27 مليون شخص ، مما ساهم في حصيلة إجمالية بلغت 4.95 مليون حالة وفاة عند النظر في مضاعفات العدوى البكتيرية المقاومة1. في حين أن الترسانة الحالية من المضادات الحيوية لا تزال فعالة في الممارسة السريرية ، إلا أنها تستهدف في الغالب طيفا ضيقا من العمليات الخلوية ، مع التركيز بشكل أساسي على جدار الخلية والحمض النووي وتخليق البروتين. على مدى نصف القرن الماضي ، تم استغلال أقل من 30 بروتينا تجاريا كأهداف لتطوير مضادات جديدة للبكتيريا 2,3. هذا النطاق المحدود من الأهداف القابلة للتطبيق يخلق قيودا كبيرة على اكتشاف مضادات حيوية جديدة أو مشتقاتها لمكافحة البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. وبالتالي ، للتغلب على مشكلة مقاومة المضادات الحيوية الناشئة ، هناك حاجة لتطوير مضادات حيوية جديدة ذات أهداف وآليات عمل جديدة.

يجب أن يكون الهدف المضاد للبكتيريا بشكل مثالي مكونا أساسيا لنمو الخلايا البكتيرية ، وأن يتم حفظه في جميع أنحاء الأنواع المتنوعة من الناحية التطورية ، وأن يظهر أقل تماثل حقيقي النواة ، وأن يكون في متناول المضادات الحيوية4. منذ اكتشاف البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية المشاركة في انقسام الخلايا والحفاظ على شكل الخلية ، ظهرت كنقطة محورية واعدة لتطوير المركبات المضادة للبكتيريا5. هذه البروتينات ضرورية لحيوية البكتيريا وتلعب دورا محوريا في الحفاظ على شكل الخلية (MreB ، CreS) ، والانقسام (FtsZ ، FtsA) ، وفصل الحمض النووي (ParM ، TubZ ، PhuZ ، AlfA) ، على غرار الهيكل الخلوي في الخلايا حقيقية النواة. والجدير بالذكر أن FtsZ يظهر مستوى عاليا بشكل ملحوظ من الحفظ عبر مجموعة واسعة من الكائنات بدائية النواة ، بينما يوجد MreB في جميع البكتيريا على شكل قضيب تقريبا. هذا التوزيع الواسع والأهمية في صلاحية الخلية يجعل هذه البروتينات هدفا رائعا في أبحاث المضادات الحيوية5،6،7.

من الأهمية بمكان اعتماد نهج متعدد الجوانب يجمع بين الملاحظات في الجسم الحي والتفاعلات في المختبر والتجارب الأنزيمية للتحقق بدقة من صحة بروتينات الهيكل الخلوي البكتيري كهدف أساسي لمثبط محتمل7. الإجراءات الشاقة أو الآثار المترتبة على التكلفة الكبيرة تثقل كاهل العديد من المقايسات المتاحة لهذا الغرض. هذه عقبات ملحوظة أمام استخدامها على نطاق واسع في فحص مركبات الرصاص التي يمكن أن تؤثر على الهيكل الخلوي البكتيري. من بين هذه ، يبرز الفحص المجهري كطريقة فعالة وسريعة بشكل استثنائي لتقييم فعالية المركبات من خلال الفحص المباشر للتغيرات في مورفولوجيا الخلية. ومع ذلك ، فإن الارتباط غير المتجانس للبروتين المستهدف مع مجمعات الهيكل الخلوي الأخرى ، والآثار غير المباشرة بسبب الارتباط خارج الهدف والتغيرات في إمكانات الغشاء ، وصعوبة اختراق الخلية بكفاءة ، ووجود مضخات التدفق ، خاصة في البكتيريا سالبة الجرام ، تجعل الأمر معقدا بشكل جماعي لتحديد السبب الدقيق لتشوه الخلايا البكتيرية8،9،10.

فطرية الفصام بومب، أو خميرة الانشطار كما هو معروف، كائن حقيقي النواة وحيد الخلية على شكل قضيب. تستخدم خميرة الانشطار على نطاق واسع ككائن نموذجي في البيولوجيا الخلوية والجزيئية بسبب الحفظ الاستثنائي في العمليات الخلوية مثل دورة الخلية والانقسام ، والتنظيم الخلوي ، وتكرار الكروموسوم مع حقيقيات النوى الأعلى ، بما في ذلك البشر11,12. علاوة على ذلك ، أعرب Errington وزملاؤه عن بروتين هيكلي خلوي بكتيري موضعي في القطب DivIVA في خميرة الانشطار لإثبات أن DivIVA تراكمت على الأسطح المنحنية سلبا13. مرة أخرى ، أنشأ Balasubramanian والمجموعة لأول مرة خميرة الانشطار كنظام نموذج خلوي لجلب رؤى جديدة حول آلية وتجميع وديناميكية بروتين الهيكل الخلوي E. coli actin مثل MreB14 و tubulin homolog FtsZ15. كما أنها توضح قدرة A22 على إعاقة بلمرة MreB بكفاءة من خلال الفحص المجهري epifluorescence عند التعبير عنها في الخميرة14. بعد ذلك ، نجحت مجموعات أخرى أيضا في استخدام خميرة الانشطار لدراسة خصائص تجميع بروتينات البلاستيدة الخضراء FtsZ1 و FtsZ216. في الآونة الأخيرة ، أنشأنا دليلا على مفهوم جدوى استخدام خميرة الانشطار كمنصة خلوية لفحص مثبطات الهيكل الخلوي البكتيري على وجه التحديد من خلال إجراء تقييم شامل لتأثير ثلاثة مثبطات FtsZ معروفة - سانجوينارين ، بربارين ، وبروتينات FtsZ PC190723 مشتقة من اثنين من البكتيريا المسببة للأمراض ، وهما المكورات العنقودية الذهبية وهيليكوباكتر بيلوري17. بالإضافة إلى ذلك ، يثبت هذا الفحص القائم على الخلية أحادي الخطوة أنه فعال في تقليل مخاطر تحديد المركبات التي قد تكون سامة للخلايا حقيقية النواة.

في هذا التقرير ، باستخدام نظام الخميرة الانشطارية ، نقترح سير عمل منهجي باستخدام لوحة 96 بئرا القياسية للفحص شبه الآلي والقياس الكمي لتأثير مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تستهدف FtsZ من المكورات العنقودية الذهبية و MreB من الإشريكية القولونية. هنا ، قمنا بإعداد وتحسين سير العمل شبه الآلي باستخدام مثبطات PC190723 و A22 التي تستهدف على وجه التحديد FtsZ و MreB ، على التوالي. يستخدم سير العمل هذا مجهرا فوق فلوري مزودا بمرحلة عالية الدقة مزودة بمحرك والحصول الآلي على الصور في لوحة قياسية ذات 96 بئرا لتحسين التوحيد الحالي. وبالتالي ، يمكن تطبيقه على الشاشات المتوسطة والعالية الإنتاجية للمكتبات الكيميائية الاصطناعية والتحايل على بعض التحديات المذكورة أعلاه.

Protocol

1. التعبير عن بروتينات الهيكل الخلوي البكتيرية الموسومة ب GFP في S. pombe

ملاحظة: يرجى الاطلاع على الجدول 1 للحصول على معلومات حول جميع البلازميدات والسلالات المستخدمة هنا. يرجى الاطلاع على الجدول 2 للاطلاع على جميع التراكيب الإعلامية.

  1. إجراء استنساخ الإشريكية القولونية MreB مع اندماج GFP N-TERMINAL (GFP-MREB) و S. aureus FtsZ يحمل GFP (SaFtsZ-GFP) في ناقل تعبير S. pombe ، pREP42 مع محفز متوسط القوة قابل للقمع الثيامين ، nmt4118,19 كما هو موضح سابقا14,15. الحفاظ على البلازميدات وتضخيمها وعزلها من سلالات الإشريكية القولونية (DH10β) كما هو موضح في20،21.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام سلالات الإشريكية القولونية الأخرى مثل DH5α و XL1Blue و TOP10 وما إلى ذلك أو غيرها من الخلايا المختصة المتاحة تجاريا والتي تستخدم بشكل روتيني للاستنساخ الجزيئي.
  2. تحويل البلازميدات pREP42-GFP-EcMreB و pREP42-SaFtsZ-GFP إلى S. pombe
    1. تحويل البلازميدات pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) و pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) إلى سلالة S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) باستخدام طريقة أسيتات الليثيوم22 ، كما هو مذكور في الخطوات التالية.
    2. اليوم 1 - الثقافة الأولية: قم بتلقيح حلقة من ثقافة S. pombe المخططة حديثا في 3 مل من مرق مستخلص الخميرة المعقم والمكملات الغذائية (YES). احتضانه في شاكر مداري عند 30 درجة مئوية طوال الليل (O / N).
    3. يوم 2:
      1. الثقافة الثانوية: أضف حوالي 500 ميكرولتر من المستزرع الأولي إلى 30 مل من مرق نعم المعقم. احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعات مع الهز حتى يصل OD600 إلى 0.4 - 0.6.
        ملاحظة: لكل تحويل ، يتم استخدام 30 مل.
      2. قم بتجميع 30 مل عند 2500 × جم لمدة 6-8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية واغسل الخلايا ب 50 مل من الماء المقطر المعقم (D / W). بيليه لأسفل مرة أخرى وتجاهل طاف. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من D / W المعقم وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2 مل. أجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه وتجاهل طاف.
      3. أضف 1 مل من أسيتات الليثيوم 0.1 متر ومحلول Tris-EDTA (LiAc-TE) وأجهزة الطرد المركزي على النحو الوارد أعلاه. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليقها في 1 مل من 0.1 متر LiAc-TE. أجهزة الطرد المركزي والتخلص من المواد الطافية ، تاركة وراءها 100 ميكرولتر من المحلول.
      4. أضف 10 - 20 ميكروغرام من الحمض النووي الناقل (الحمض النووي للحيوانات المنوية من سمك السلمون ؛ مشوهة ومبرد على الجليد) و 2-3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد ، والذي يحتاج إلى تحويل. تخلط بلطف. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
      5. أضف 260 ميكرولتر من 40٪ PEG / LiAc-TE ؛ تخلط بلطف. احتضانها لمدة 60 دقيقة في الخلاط أو خلاط حراري على حرارة 30 درجة مئوية مع خلط لطيف. إضافة 43 ميكرولتر من DMSO ؛ تخلط بلطف.
      6. صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في الخلاط الحراري. حبيبات عند 2500 × جم لمدة 6-8 دقائق وتخلص من المادة الطافية. اغسل الحبيبات 1x ب 1 مل من D / W المعقم.
      7. بيليه ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من D / W. لوحة معقمة 100 ميكرولتر على ألواح إدنبرة المتوسطة الدنيا (EMM) التي تحتوي على 5 ميكروغرام / مل من الثيامين (لقمع مروج nmt41 ) ومكملات الأحماض الأمينية الأدينين (0.225 مجم / مل) ، الهستيدين (0.225 مجم / مل) والليوسين (0.225 مجم / مل) ولكنها تفتقر إلى اليوراسيل (علامة اختيار لبلازميد pREP42).
        ملاحظة: بالتناوب ، لوحة 70 ميكرولتر و 130 ميكرولتر في لوحين مختلفين. يتم طلاء حجمين مختلفين (70 ميكرولتر و 130 ميكرولتر) للحصول على مستعمرات معزولة على واحدة على الأقل من الألواح اعتمادا على كفاءات التحويل ، والتي يمكن أن تختلف من تجربة إلى أخرى.
      8. احتضان الألواح على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى تظهر المستعمرات. امزج مستعمرة واحدة مع 100 ميكرولتر من D / W المعقم وانتشر على لوحة EMM جديدة تحتوي على الثيامين ولكنها تفتقر إلى اليوراسيل كما هو موضح أعلاه.
      9. احتضان في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام حتى يظهر العشب الكامل. تخلص من العشب المزروع من الخلايا باستخدام حلقة تلقيح وأعد تعليقه إلى 1 مل من وسائط YES التي تحتوي على 30٪ من الجلسرين في قارورة بالتبريد.
      10. قم بتجميد قارورة التبريد في النيتروجين السائل وتخزينها في -80 درجة مئوية للحفاظ على مخزون الخميرة المجمدة.
  3. التعبير عن بروتينات الهيكل الخلوي البكتيري في خميرة الانشطار
    1. قم بخط رقعة من مرق الجلسرين على طبق طازج خاص بالخميرة للحصول على ثقافة كافية لمزيد من التجارب.
      ملاحظة: في حالة pREP42 ، استخدمنا لوحة أجار EMM (الحد الأدنى من الوسائط) التي تحتوي على الأدينين والهيستيدين والليوسين (كما هو الحال باستخدام سلالة S. pombe (h- leu1-32 ura4-D18)) بدون اليوراسيل (اليوراسيل موجود في pREP42 كعلامة اختيار). نضيف 15 - 20 ميكرومتر من الثيامين إلى ألواح الآجار (حيث يحتوي pREP42 على محفز nmt41 قابل للقمع من الثيامين) لقمع التعبير عن الجين محل الاهتمام عند النمو على اللوحة.
    2. قم بتلقيح حلقة صغيرة من اللقاح من الرقعة المخططة إلى 5 مل من وسائط EMM الخاصة بالخميرة التي تفتقر إلى الثيامين واحتضانها لمدة 10-12 ساعة عند 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن أن يختلف تعبير FtsZ و MreB من أنواع مختلفة تحت مروج nmt41 في S. pombe ، عادة من 16 إلى 30 ساعة. الوقت الأمثل للتعبير البروتيني ل GFP-EcMreB و SaFtsZ-GFP في S. pombe هو 20 - 24 ساعة و 16 - 20 ساعة عند 30 درجة مئوية ، على التوالي ، بدون ثيامين.

2. علاج مزارع S. pombe التي تعبر عن البروتينات الهيكلية الخلوية البكتيرية الموسومة ب GFP

ملاحظة: يتم اختبار عدد من جزيئات الأدوية المختلفة على مزرعة الخميرة المزروعة بين عشية وضحاها في لوحة 96 بئرا.

  1. قم بتلقيح مزرعة جديدة عن طريق نقل 50 ميكرولتر من الاستزراع الليلي إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا تحتوي على 150 ميكرولتر من وسائط EMM للخميرة الطازجة باستخدام أداة سحب السحب متعددة القنوات شبه الآلية ذات 96 بئرا.
  2. أثناء السحب للداخل والخارج للخلط المناسب باستخدام ماصة شبه آلية متعددة القنوات ذات 96 بئرا ، أدخل ببطء تركيزات متزايدة مختلفة من الأدوية في الثقافة المتنامية ، كل منها يتم في ثلاث نسخ كما هو موضح في الرسم التخطيطي في الشكل 1.
  3. كعنصر تحكم إيجابي ، استخدم الأدوية المعروفة بالفعل ، PC190723 ل (S. aureus FtsZ) و A22 (ل E. coli MreB) في نسختين.
    ملاحظة: كما ذكر سابقا، استخدم PC190723 وA22 بتركيز 56.2 ميكرومتر17 و72.6 ميكرومتر14,17 على التوالي. وفي الوقت نفسه ، كان علاج A22 ل SaFtsZ والعلاج PC190723 ل EcMreB بمثابة ضوابط سلبية ، على التوالي.
  4. استخدم DMSO كعنصر تحكم في المذيبات بثلاثة تركيزات مختلفة وفقا لأدنى وأعلى تركيزات الأدوية.
    ملاحظة: يستخدم المذيب الذي تذوب فيه الأدوية كعنصر تحكم في المذيبات.
  5. احتضان المزارع الضابطة والمعالجة عند 30 درجة مئوية لمدة 6-10 ساعات (حتى تظهر الخلايا تعبير البروتينات الفلورية البكتيرية) ثم قم بالتصوير باستخدام المجهر فوق الفلوري.

3. تصور البوليمرات

  1. ضع طبقة من 20 ميكرولتر من 1 مجم / مل كونكانافالين أ على كل بئر من الصفيحة السفلية ذات 96 بئرا الشفافة بصريا (ذات جدران سوداء للتصوير الفلوري) واحتضانها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح السائل واتركه يجف في الهواء لمدة 10 دقائق.
  2. انقل 20 ميكرولتر من الخلايا من لوحة الاستزراع إلى كل بئر واتركها لمدة 10 دقائق. اغسل الخلية 3x-4x باستخدام وسائط EMM المعقمة.
  3. مع استخدام العدسة الشيئية في مكانها (انظر الخطوة 3.6) ، استخدم وضع المتصفح في لوحة الالتقاط الخاصة ببرنامج الحصول على الصور لمحاذاة لوحة 96 بئرا وتغطية البئر. قم بمحاذاة حواف البئر على الملاح.
  4. بعد ذلك ، حدد معلمات تغطية البئر ، والتي تتضمن اختيارا متعدد المواضع للمنطقة محل الاهتمام في البئر ، واستخدم التحكم في التركيز البؤري التلقائي التكيفي مع وضع عند الطلب للحفاظ على العينة في التركيز أثناء التصوير.
  5. التقط الصور باستخدام تباين التداخل التفاضلي (DIC) والتألق. اضبط مرشحات الإثارة والانبعاث 475/28 نانومتر و 525/48 نانومتر ، على التوالي لتصوير البروتينات البكتيرية الموسومة ب GFP المعبر عنها في الخميرة. احصل على مداخن Z بحجم خطوة 0.2 ميكرومتر من خلال سمك خلايا الخميرة (5 ميكرومتر).
  6. التقط الصور باستخدام مجهر فوق فلوري مقلوب مزود بهدف غمر الزيت 100x و 1.4-NA وكاميرا 2000 × 2000 sCMOS (حجم بكسل 6.5 ميكرومتر × 6.5 ميكرومتر). استخدم نظام إضاءة LED لإثارة الفلوروفور.
    ملاحظة: يجب أن يكون أي نظام مجهر فوق فلوري يحتوي على مرحلة آلية للوحة 96 بئرا مع تحديد المواقع الدقيق متعدد النقاط مناسبا. الحصول على جميع صور الخلية للتحكم والمعالجة بالعقاقير مع وقت تعرض مماثل (عادة في حدود 0.3 - 0.5 ثانية) عند تجميع 1 × 1 والإضاءة بنسبة 15٪ - 20٪ لتقليل متغيرات التجربة والحفاظ على الاتساق.

4. القياس الكمي للصور باستخدام ImageJ

  1. معالجة صور الخلية وقياس عدد البقع لكل خلية وكثافتها ل FtsZ17. في حالة MreB ، قم بقياس الكثافة وتباين الخواص23 وقارن بين الخلايا الضابطة والمعالجة باستخدام فيجي (v2.0.0-rc-69 / 1.52p) 24.
  2. باستخدام الصور من قناة DIC ، حدد أولا خلايا الخميرة الفردية باستخدام أداة الرسم اليدوي واحفظها كمنطقة اهتمام (ROI) في مدير عائد الاستثمار. هذه الخطوة ليست مؤتمتة بعد ، ولكن الأدوات التي تم تطويرها مؤخرا باستخدام التعلم الآلي25,26 يمكن تجربتها ودمجها في المستقبل القريب.
  3. قم بإخفاء المنطقة الخارجية للخلية واملأها باللون الأسود كما هو موضح في27.
  4. استخدم ماكرو تحليل عتبة OPS IJ1 ، وهي ميزة مضمنة في فيجي ، لحساب عدد النقاط24.
  5. استخدم طريقة otsu للعتبة التلقائية وإخفاء الجسيمات المجزأة. قم بتشغيل جسيمات تحليل المكون الإضافي باستخدام ماكرو.
  6. لقياس كثافة البوليمر (كمية الهيكل الخلوي لكل وحدة مساحة في الخلية) ، قم بمعالجة الصور كما هو موضح ، بما في ذلك خطوات التقنيع والهيكل العظمي27,28. استخدم مرشح Lpx 2Dfilter في المكون الإضافي lpx لهيكلة الصور.
  7. لمزيد من التفاصيل ، تحقق من هذا المنشور الأخير17. قم بإجراء القياس الكمي للبوليمر EcMreB كما هو مذكور سابقا في23 ، استخدم تباين الخواص لتحديد التنظيم المكاني باستخدام FibrilTool29 كما هو موضح سابقا23.
    ملاحظة: يمكن استخدام طرق التحليل هذه لتحديد أي بروتينات هيكلية خلوية بكتيرية أخرى يتم علاجها أو عدم معالجتها بواسطة الأدوية.

النتائج

إعداد لوحة 96 بئرا لفحص المخدرات
تم استخدام S. pombe للتعبير عن C- نهائيا GFP الموسوم S. aureus FtsZ من ناقل (pREP42) يحتوي على مروج الثيامين القابل للقمع متوسط القوة nmt41تم تحديده سابقا17 وبالمثل ، تم التعبير عن E. coli MreB الموسوم ب N- terminal GFP أيضا في S. pombe1...

Discussion

تشكل مقاومة مضادات الميكروبات تهديدا صحيا عالميا خطيرا، وهناك حاجة ملحة إلى مضادات حيوية جديدة ذات أهداف جديدة. برز الهيكل الخلوي البكتيري كهدف جذاب لتطوير مضادات حيوية جديدة ، مع مثبطات جزيئية صغيرة لبروتين انقسام الخلايا FtsZ ، مثل TXA709 ، بالفعل في المرحلة الأولى من التجارب السريرية

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تعترف SMP و SR و AKS بالزمالات التي تلقتها من المعهد الوطني لتعليم العلوم والبحوث ، قسم الطاقة الذرية. يقر قطاع الأبحاث بدعم التمويل الداخلي من وزارة الطاقة الذرية ، ويتم دعم هذا العمل من خلال منحة بحثية إلى RS (BT / PR42977 / MED/29/1603/2022) من قسم التكنولوجيا الحيوية (DBT). كما يعترف المؤلفون ب V Badireenath Konkimalla لتعليقاته واقتراحاته ومناقشاته طوال فترة تطوير البروتوكول.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. BlackThermo Scientific™160376
96-well plateCorning  CLS3370
A22 HydrochlorideSigma SML0471Dissolved in DMSO
AdenineFormediumTMDOC0229225 mg/L of media 
Concanavalin A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)FormediumTMPMD0210See below for composition
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position sliderEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L of media 
Leica DMi8 inverted fluorescence microscopeLeica MicrosystemsGerman company
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L of media 
Lithium acetate Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)Sigma 202398
ThiamineSigmaT4625Filter sterilised
Tris-HydrochlorideMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) AgarFormediumTMPCM0410See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) BrothFormediumTMPCM0310See below for composition
Yeast (S. pombe) media 
Yeast extract + supplements (YES)
Compositiong/L
Yeast extract5
Dextrose30
Agar17
Adenine0.05
L-Histidine0.05
L-Leucine0.05
L-Lysine HCl0.05
Uracil0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
Compositiong/Lconcentration
potassium hydrogen phthallate 314.7mM
Na2HPO4 2.215.5 mM
NH4Cl 593.5 mM
glucose2% (w/v) or 20 g/L 111 mM
Salts (stock x 50)20 mL/L (v/v)
Vitamins (stock x 1000)1 mL/L (v/v)
Minerals (Stock x 10,000)0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) 52.50.26 M
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) 0.0007354.99 mM
50 g/l KCl (0.67 M) 500.67 M
2 g/l Na2SO4 (14.l mM)214.1 mM
Vitamins x 1000 1 g/l pantothenic acid 14.20 mM
10 g/l nicotinic acid 1081.2 mM
10 g/l inositol 1055.5 mM
10 mg/l biotin 0.0140.8 µM
Minerals x 10,000 boric acid580.9 mM
MnSO4  423.7 mM
ZnSO4.7H2O413.9 mM
FeCl2.6H2O  27.40 mM
molybdic acid 0.42.47 mM
KI 16.02 mM
CuSO4.5H2O 0.41.60 mM
citric acid 1047.6 mM
Strains/ Plasmids
StrainsDescriptionReference
CCD190Escherichia coli DH10β Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023

References

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  2. Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
  3. Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
  4. Sanchez, S., Demain, A. L. . Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).
  5. Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
  6. Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
  7. Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
  8. Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
  9. Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
  10. Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
  11. Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
  12. Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
  13. Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
  14. Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
  15. Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
  16. TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
  17. Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
  18. Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
  19. Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  22. Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  23. Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
  26. Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
  27. Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
  28. Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
  29. Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
  30. Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
  31. Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
  32. Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
  33. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  34. Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
  35. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  36. Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
  37. Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

206

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved