Levedura de fissão como plataforma para triagens de drogas antibacterianas direcionadas a proteínas do citoesqueleto bacteriano

Resumo

A levedura de fissão é usada aqui como um hospedeiro heterólogo para expressar proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, como proteínas de fusão translacional com GFP para visualizar sua polimerização. Além disso, os compostos que afetam a polimerização são identificados por imagens usando um microscópio de fluorescência.

Resumo

Proteínas bacterianas do citoesqueleto, como FtsZ e MreB, desempenham funções essenciais, como divisão celular e manutenção da forma celular. Além disso, FtsZ e MreB surgiram como alvos importantes para novas descobertas de antimicrobianos. Vários ensaios foram desenvolvidos para identificar compostos direcionados à ligação de nucleotídeos e polimerização dessas proteínas do citoesqueleto, focados principalmente em FtsZ. Além disso, muitos dos ensaios são trabalhosos ou caros, e verificar se essas proteínas são o alvo celular da droga geralmente requer vários métodos. Finalmente, a toxicidade das drogas para as células eucarióticas também representa um problema. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em células de etapa única para descobrir novas moléculas direcionadas ao citoesqueleto bacteriano e minimizar os golpes que podem ser potencialmente tóxicos para as células eucarióticas. A levedura de fissão é passível de peneiras de alto rendimento baseadas em microscopia, e uma peneira visual pode identificar facilmente qualquer molécula que altere a polimerização de FtsZ ou MreB. Nosso ensaio utiliza a placa padrão de 96 poços e depende da capacidade das proteínas bacterianas do citoesqueleto de polimerizar em uma célula eucariótica, como a levedura de fissão. Embora os protocolos descritos aqui sejam para levedura de fissão e utilizem FtsZ de Staphylococcus aureus e MreB de Escherichia coli, eles são facilmente adaptáveis a outras proteínas bacterianas do citoesqueleto que se montam prontamente em polímeros em qualquer hospedeiro de expressão eucariótica. O método aqui descrito deve ajudar a facilitar a descoberta de novos antimicrobianos direcionados às proteínas bacterianas do citoesqueleto.

Introdução

A resistência generalizada a quase todos os antibióticos atualmente empregados para combater infecções bacterianas criou uma necessidade imediata de novas categorias de antibióticos. Um relatório de 2019 indicou que as infecções resistentes a antibióticos resultaram na perda de 1,27 milhão de vidas, contribuindo para uma contagem geral de 4,95 milhões de mortes ao considerar complicações de infecções bacterianas resistentes¹. Embora ainda seja eficaz na prática clínica, o arsenal atual de antibióticos visa predominantemente um espectro estreito de processos celulares, concentrando-se principalmente na parede celular, DNA e síntese de proteínas. Ao longo do último meio século, menos de 30 proteínas foram exploradas comercialmente como alvos para o desenvolvimento de novos antibacterianos ^2,3. Essa gama limitada de alvos viáveis cria restrições significativas para a descoberta de novos antibióticos ou seus derivados para combater bactérias resistentes a antibióticos. Assim, para superar o problema emergente de resistência aos antibióticos, há a necessidade do desenvolvimento de novos antibióticos com novos alvos e mecanismos de ação.

Idealmente, um alvo antibacteriano deve ser um componente essencial do crescimento celular bacteriano, ser conservado em todas as espécies filogeneticamente diversas, mostrar menos homologia eucariótica e ser acessível a antibióticos⁴. Desde a descoberta das proteínas bacterianas do citoesqueleto envolvidas na divisão celular e na manutenção da forma celular, elas surgiram como um ponto focal promissor para o desenvolvimento de compostos antibacterianos⁵. Essas proteínas são essenciais para a viabilidade bacteriana e desempenham um papel fundamental na manutenção da forma celular (MreB, CreS), divisão (FtsZ, FtsA) e segregação de DNA (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), semelhante ao citoesqueleto em células eucarióticas. Notavelmente, FtsZ exibe um nível notavelmente alto de conservação em uma ampla gama de organismos procarióticos, enquanto MreB é encontrado em quase todas as bactérias em forma de bastonete. Essa ampla distribuição e relevância na viabilidade celular tornam essas proteínas um alvo fascinante na pesquisa de antibióticos ^5,6,7.

É crucial adotar uma abordagem multifacetada que combine observações in vivo, interações in vitro e experimentos enzimáticos para validar completamente as proteínas do citoesqueleto bacteriano como o alvo primário de um inibidor potencial⁷. Procedimentos trabalhosos ou implicações substanciais de custo sobrecarregam muitos ensaios disponíveis para esse fim. Esses são obstáculos notáveis para sua utilização generalizada na triagem de compostos de chumbo que podem afetar o citoesqueleto bacteriano. Dentre estes, a microscopia se destaca como um método excepcionalmente eficiente e rápido para avaliar a eficácia dos compostos, examinando diretamente as mudanças na morfologia celular. No entanto, a heteroassociação da proteína-alvo com outros complexos do citoesqueleto, efeitos indiretos devido à ligação fora do alvo e alterações no potencial de membrana, dificuldade em penetrar na célula com eficiência e presença de bombas de efluxo, especialmente em bactérias Gram-negativas, tornam coletivamente complexo identificar a causa precisa da deformação celular bacteriana ^8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, ou levedura de fissão, como é comumente conhecida, é um organismo eucariótico unicelular em forma de bastonete. A levedura de fissão é amplamente utilizada como organismo modelo em biologia celular e molecular devido à extraordinária conservação em processos celulares, como o ciclo e divisão celular, organização celular e replicação cromossômica com eucariotos superiores, incluindo humanos^11,12. Além disso, Errington e colegas expressaram uma proteína citoesquelética bacteriana localizada em pólo DivIVA em levedura de fissão para demonstrar que DivIVA se acumulou em superfícies curvadas negativamente¹³. Mais uma vez, Balasubramanian e seu grupo estabeleceram pela primeira vez a levedura de fissão como um sistema de modelo celular para trazer novos insights sobre o mecanismo, montagem e dinamicidade da proteína do citoesqueleto de actina de E. coli, como MreB¹⁴ e homólogo de tubulina FtsZ¹⁵. Eles também demonstram a capacidade do A22 de impedir eficientemente a polimerização do MreB por meio de microscopia de epifluorescência quando expresso em levedura¹⁴. Depois disso, outros grupos também empregaram com sucesso leveduras de fissão para estudar as propriedades de montagem das proteínas FtsZ1 e FtsZ2 do cloroplasto¹⁶. Mais recentemente, estabelecemos uma prova de conceito da viabilidade do uso de levedura de fissão como uma plataforma celular para rastrear especificamente inibidores do citoesqueleto bacteriano, conduzindo uma avaliação abrangente do impacto de três inibidores de FtsZ conhecidos - proteínas sanguinarina, berberina e PC190723-on FtsZ derivadas de duas bactérias patogênicas, a saber, Staphylococcus aureus e Helicobacter pylori¹⁷. Além disso, este ensaio baseado em células de etapa única é fundamental para minimizar o risco de identificação de compostos que podem ser potencialmente tóxicos para células eucarióticas.

Neste relatório, utilizando o sistema de levedura de fissão, propomos um fluxo de trabalho sistemático usando a placa padrão de 96 poços para triagem semiautomatizada e quantificação do efeito de inibidores de pequenas moléculas direcionados a FtsZ de Staphylococcus aureus e MreB de Escherichia coli. Aqui, configuramos e otimizamos o fluxo de trabalho semiautomatizado usando os inibidores estabelecidos PC190723 e A22 que visam especificamente FtsZ e MreB, respectivamente. Este fluxo de trabalho usa um microscópio de epifluorescência equipado com uma platina motorizada de alta precisão e aquisição automatizada de imagens em uma placa padrão de 96 poços para melhorar a padronização atual. Portanto, ele pode ser aplicado a telas de médio e alto rendimento de bibliotecas químicas sintéticas e contorna alguns dos desafios listados acima.

Protocolo

1. Expressão de proteínas citoesqueléticas bacterianas marcadas com GFP em S. pombe

NOTA: Consulte a Tabela 1 para obter informações sobre todos os plasmídeos e cepas usados aqui. Consulte a Tabela 2 para todas as composições de mídia.

1. Realize a clonagem de E. coli MreB com uma fusão GFP N-terminal (GFP-MreB) e S. aureus FtsZ carregando uma GFP C-terminal (SaFtsZ-GFP) no vetor de expressão de S. pombe, pREP42 com um promotor repressível de tiamina de força média, nmt41^18,19 conforme descrito anteriormente^14,15. Manter, amplificar e isolar os plasmídeos das estirpes de E. coli (DH10β) conforme descrito em^20,21.
   NOTA: Outras cepas de E. coli , como DH5α, XL1Blue, TOP10, etc. ou outras células competentes comercialmente disponíveis usadas rotineiramente para clonagem molecular também podem ser usadas.
2. Transformação dos plasmídeos pREP42-GFP-EcMreB e pREP42-SaFtsZ-GFP em S. pombe
   1. Transforme os plasmídeos pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) e pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) em cepa de S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) usando o método de acetato de lítio²², conforme mencionado nas etapas abaixo.
   2. Dia 1 - Cultura primária: Inocule um loop cheio de cultura de S. pombe recém-listrada em 3 mL de extrato de levedura autoclavado e caldo de suplementos (YES). Incubá-lo num agitador orbital a 30 °C durante a noite (O/N).
   3. Dia 2:
      1. Cultura secundária: Adicione cerca de 500 μL de cultura primária a 30 mL de caldo YES autoclavado. Incubar a 30 °C durante 3 - 4 h com agitação até que o OD₆₀₀ atinja 0,4 - 0,6.
         NOTA: Para cada transformação, 30 mL são usados.
      2. Pellet a cultura de 30 mL a 2.500 x g por 6-8 min em temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e lavar as células com 50 ml de água destilada estéril (D/W). Derrube novamente e descarte o sobrenadante. Ressuspenda as células em 1 mL de D/W estéril e transfira-o para um tubo de centrífuga de 2 mL. Centrifugue como acima e descarte o sobrenadante.
      3. Adicione 1 mL de acetato de lítio 0,1 M, solução de Tris-EDTA (LiAc-TE) e centrifugue como acima. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de LiAc-TE 0,1 M. Centrifugue e descarte o sobrenadante, deixando 100 μL de solução para trás.
      4. Adicione 10 a 20 μg de DNA transportador (DNA de esperma de salmão; desnaturado e resfriado rapidamente em gelo) e 2 a 3 μg do DNA do plasmídeo, que precisa ser transformado. Misture delicadamente. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
      5. Adicionar 260 μL de 40% de PEG/LiAc-TE; misture delicadamente. Incubar durante 60 min no shaker ou num termomixer a 30 °C com uma mistura suave. Adicione 43 μL de DMSO; misture delicadamente.
      6. Choque térmico a 42 °C por 10 min no termomisturador. Pellet a 2.500 x g por 6-8 min e descarte o sobrenadante. Lave o pellet 1x com 1 mL de D/W estéril.
      7. Pellet, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 μL de D / W estéril. Placa 100 μL em placas de meio mínimo de Edimburgo (EMM) contendo 5 μg / mL de tiamina (para reprimir o promotor nmt41 ) e suplementos de aminoácidos adenina (0,225 mg / mL), histidina (0,225 mg / mL) e leucina (0,225 mg / mL), mas sem uracila (marcador de seleção para plasmídeo pREP42).
         NOTA: Alternativamente, placa 70 μL e 130 μL em duas placas diferentes. Dois volumes diferentes (70 μL e 130 μL) são semeados para obter colônias isoladas em pelo menos uma das placas, dependendo das eficiências de transformação, que podem variar de experimento para experimento.
      8. Incubar as placas a 30 °C durante 2-3 dias até que as colónias apareçam. Misture uma única colônia com 100 μL de D / W estéril e espalhe em uma placa EMM nova contendo tiamina, mas sem uracila, conforme descrito acima.
      9. Incubar a 30 °C durante 2-3 dias até aparecer um relvado completo. Raspe o gramado crescido de células usando uma alça inoculante e ressuspenda-o para 1 mL de meio YES contendo 30% de glicerol em um frasco criogênico.
      10. Congelar rapidamente o frasco criogênico em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C para preservar os estoques de levedura congelados.
3. Expressão de proteínas do citoesqueleto bacteriano em levedura de fissão
   1. Listre assepticamente um adesivo do estoque de glicerol em uma placa específica de levedura fresca para obter cultura suficiente para novos experimentos.
      NOTA: No caso do pREP42, usamos uma placa de ágar EMM (meio mínimo) contendo adenina, histidina e leucina (como usando a cepa de S. pombe (h- leu1-32 ura4-D18)) sem uracila (uracila presente no pREP42 como marcador de seleção). Adicionamos 15 a 20 μM de tiamina às placas de ágar (já que o pREP42 possui o promotor nmt41 repressível de tiamina) para reprimir a expressão do gene de interesse ao crescer na placa.
   2. Inocule uma pequena alça do inóculo do adesivo listrado em 5 mL de meio EMM específico para levedura sem tiamina e incube-o por 10 a 12 h a 30 ° C.
      NOTA: A expressão de FtsZ e MreB de diferentes espécies sob o promotor nmt41 no S. pombe pode variar, tipicamente de 16 a 30 h. O tempo ideal para a expressão proteica de GFP-EcMreB e SaFtsZ-GFP em S. pombe é de 20 a 24 h e 16 a 20 h a 30 °C, respectivamente, sem tiamina.

2. Tratamento de culturas de S. pombe expressando proteínas citoesqueléticas bacterianas marcadas com GFP

NOTA: Várias moléculas de medicamentos diferentes são testadas na cultura de levedura cultivada durante a noite em uma placa de 96 poços.

1. Inocule uma cultura fresca transferindo 50 μL da cultura noturna para cada poço de uma placa de 96 poços contendo 150 μL de meio EMM de levedura fresca usando o instrumento de pipetagem multicanal semiautomatizado de 96 poços.
2. Ao pipetar para dentro e para fora para uma mistura adequada usando uma pipeta multicanal semiautomatizada de 96 poços, introduza lentamente diferentes concentrações crescentes de medicamentos na cultura em crescimento, cada uma feita em triplicata, conforme representado no esquema da Figura 1.
3. Como controle positivo, use os medicamentos já conhecidos, PC190723 para (S. aureus FtsZ) e A22 (para E. coli MreB) em duplicata.
   NOTA: Como relatado anteriormente, PC190723 e A22 foram usados em uma concentração de 56,2 μM¹⁷ e 72,6 μM ^14,17, respectivamente. Enquanto isso, o tratamento A22 de SaFtsZ e PC190723 tratamento de EcMreB serviram como controles negativos, respectivamente.
4. Use DMSO como controle de solvente em três concentrações diferentes de acordo com as concentrações mais baixas e mais altas de medicamentos.
   NOTA: O solvente no qual os medicamentos são dissolvidos é usado como controle de solvente.
5. Incubar as culturas de controlo e tratadas a 30 °C durante 6-10 h (até que as células mostrem a expressão de proteínas fluorescentes bacterianas) e, em seguida, obter imagens utilizando microscopia de epifluorescência.

3. Visualização dos polímeros

1. Aplicar uma camada de 20 μL de 1 mg/ml de concanavalina A em cada alvéolo da placa de fundo opticamente transparente de 96 poços (paredes pretas para imagens de fluorescência) e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. Aspire o líquido e deixe secar ao ar por 10 min.
2. Transferir 20 μL de células da placa de cultura para cada poço respectivo e deixar descansar por 10 min. Lave a célula 3x-4x com o meio EMM estéril.
3. Com a lente objetiva a ser usada no lugar (consulte a etapa 3.6), use o modo de navegação no painel de aquisição do software de aquisição de imagem para alinhamento de placas de 96 poços e cobertura de poços. Alinhe as bordas do poço no navegador.
4. Em seguida, selecione os parâmetros de cobertura do poço, que incluem uma seleção de várias posições da região de interesse no poço, e use o controle de foco automático adaptativo com o modo sob demanda para manter a amostra em foco durante a geração de imagens.
5. Adquira imagens usando contraste de interferência diferencial (DIC) e fluorescência. Defina filtros de excitação e emissão de 475/28 nm e 525/48 nm, respectivamente, para obter imagens das proteínas bacterianas marcadas com GFP expressas em leveduras. Obtenha pilhas Z em um tamanho de passo de 0,2 μm através da espessura das células de levedura (5 μm).
6. Capture imagens usando um microscópio de epifluorescência invertida equipado com uma objetiva de imersão em óleo de 1,4 NA de 100x e uma câmera CMOS de 2.000 x 2.000 sCMOS (tamanho de pixel de 6,5 μm x 6,5 μm). Use um sistema de iluminação LED para excitação do fluoróforo.
   NOTA: Qualquer sistema de microscópio de epifluorescência que tenha uma platina motorizada para uma placa de 96 poços com posicionamento preciso de vários pontos deve ser adequado. Adquira todas as imagens celulares de controle e tratadas com drogas com um tempo de exposição semelhante (geralmente na faixa de 0,3 a 0,5 s) em um binning de 1 x 1 e iluminação de 15% a 20% para minimizar as variáveis do experimento e manter a consistência.

4. Quantificação das imagens usando ImageJ

1. Processe imagens de células e meça o número de pontos por célula e a densidade de FtsZ¹⁷. No caso de MreB, meça a densidade e a anisotropia²³ e compare entre as células controle e tratadas usando Fiji (v2.0.0-rc-69 / 1.52p) ²⁴.
2. Usando as imagens do canal DIC, primeiro contorne as células de levedura individuais usando a ferramenta de desenho à mão livre e salve como uma região de interesse (ROI) no gerenciador de ROI. Esta etapa ainda não é automatizada, mas ferramentas desenvolvidas recentemente usando aprendizado de máquina ^25,26 podem ser tentadas e incorporadas em um futuro próximo.
3. Mascarar a área externa da cela e preencher de preto conforme descrito em²⁷.
4. Use a macro de análise OPS threshold IJ1, um recurso integrado em Fiji, para contar o número de pontos²⁴.
5. Use o método otsu para limite automático e mascare as partículas segmentadas. Execute o plug-in analisar partículas usando uma macro.
6. Para medir a densidade do polímero (quantidade de citoesqueleto por unidade de área em uma célula), processe as imagens conforme descrito, incluindo as etapas de mascaramento e esqueletização^27,28. Use Lpx 2Dfilter no plug-in lpx para esqueletizar as imagens.
7. Para obter detalhes, consulte esta publicação recente¹⁷. Realize a quantificação do polímero EcMreB conforme mencionado anteriormente em²³, use anisotropia para quantificar a organização espacial usando FibrilTool²⁹ conforme descrito anteriormente²³.
   NOTA: Esses métodos de análise podem ser usados para quantificar quaisquer outras proteínas do citoesqueleto bacteriano que são tratadas ou não tratadas pelos medicamentos.

Resultados

Instalação da placa de 96 poços para a triagem de drogas
O uso de S. pombe para expressar um S. aureus FtsZ marcado com GFP C- terminal de um vetor (pREP42) contendo o promotor repressível de tiamina de força média nmt41foi previamente estabelecido¹⁷ e, da mesma forma, o MreB de E. coli marcado com GFP N-terminal também foi expresso em S. pombe¹⁴. Também mostramos que PC190723, um inibidor específico ...

Discussão

A resistência antimicrobiana (RAM) é uma séria ameaça à saúde global e há uma necessidade urgente de novos antibióticos com novos alvos. O citoesqueleto bacteriano emergiu como um alvo atraente para o desenvolvimento de novos antibióticos, com inibidores de pequenas moléculas da proteína de divisão celular FtsZ, como TXA709, já em ensaios clínicos de Fase^{I 30}. Vários métodos têm sido desenvolvidos para identificar inibidores da polimerização de FtsZ ^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023