JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שמרי ביקוע משמשים כאן כפונדקאי הטרולוגי לביטוי חלבוני שלד ציטו-שלד חיידקיים כגון FtsZ ו-MreB כחלבוני היתוך תרגומיים עם GFP כדי להמחיש את הפילמור שלהם. כמו כן, תרכובות המשפיעות על פילמור מזוהות על ידי הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

חלבוני שלד חיידקיים כגון FtsZ ו- MreB מבצעים פונקציות חיוניות כגון חלוקת תאים ושמירה על צורת התא. יתר על כן, FtsZ ו-MreB התגלו כמטרות חשובות לגילוי אנטי-מיקרוביאלי חדש. מספר בדיקות פותחו כדי לזהות תרכובות המכוונות לקשירת נוקלאוטידים ופילמור של חלבונים ציטו-שלד אלה, בעיקר בהתמקדות ב- FtsZ. יתר על כן, רבים מהבדיקות הן מייגעות או עתירות עלויות, וכדי לברר אם חלבונים אלה הם המטרה התאית של התרופה נדרשים לעתים קרובות שיטות מרובות. לבסוף, גם רעילות התרופות לתאים אאוקריוטים מהווה בעיה. במאמר זה אנו מתארים בדיקה חד-שלבית המבוססת על תאים כדי לגלות מולקולות חדשות המכוונות לשלד ציטוקלטון חיידקי ולמזער פגיעות שעלולות להיות רעילות לתאים איקריוטים. שמרי ביקוע מקובלים על מסכים בעלי תפוקה גבוהה המבוססים על מיקרוסקופיה, ומסך חזותי יכול לזהות בקלות כל מולקולה שמשנה את פילמור FtsZ או MreB. הבדיקה שלנו משתמשת בלוח 96 בארות סטנדרטי ומסתמכת על היכולת של חלבוני השלד הציטו-שלד החיידקיים להתפלמר בתא אאוקריוטי כגון שמרי הביקוע. בעוד שהפרוטוקולים המתוארים כאן הם עבור שמרי ביקוע ומשתמשים ב-FtsZ מ-Staphylococcus aureus וב-MreB מ-Escherichia coli, הם ניתנים להתאמה בקלות לחלבונים ציטו-שלדיים חיידקיים אחרים שמתאספים בקלות לפולימרים בכל פונדקאי ביטוי אאוקריוטי. השיטה המתוארת כאן אמורה לסייע בגילוי נוסף של חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים המכוונים לחלבוני שלד חיידקיים.

Introduction

העמידות הנרחבת כמעט לכל האנטיביוטיקות המשמשות כיום למאבק בזיהומים חיידקיים יצרה צורך מיידי בקטגוריות חדשות של אנטיביוטיקה. דו"ח משנת 2019 הצביע על כך שזיהומים עמידים לאנטיביוטיקה גרמו לאובדן חייהם של 1.27 מיליון בני אדם, מה שתרם למספר כולל של 4.95 מיליון מקרי מוות כאשר לוקחים בחשבון סיבוכים של זיהומים חיידקיים עמידים1. בעוד שהוא עדיין יעיל בפרקטיקה הקלינית, ארסנל האנטיביוטיקה הנוכחי מכוון בעיקר לספקטרום צר של תהליכים תאיים, בעיקר התמקדות בדופן התא, דנ"א וסינתזה של חלבונים. במהלך חצי המאה האחרונה, פחות מ -30 חלבונים נוצלו באופן מסחרי כמטרות לפיתוח אנטי בקטריאלים חדשים 2,3. טווח מוגבל זה של מטרות בנות קיימא יוצר באופן משמעותי מגבלות לגילוי אנטיביוטיקה חדשה או נגזרותיה למאבק בחיידקים עמידים לאנטיביוטיקה. לכן, כדי להתגבר על בעיית העמידות לאנטיביוטיקה המתהווה, יש צורך בפיתוח אנטיביוטיקה חדשה עם מטרות ומנגנוני פעולה חדשים.

מטרה אנטיבקטריאלית צריכה באופן אידיאלי להיות מרכיב חיוני בצמיחת תאי חיידקים, להישמר בכל המינים המגוונים מבחינה פילוגנטית, להראות הכי פחות הומולוגיה אאוקריוטית, ולהיות נגישה לאנטיביוטיקה4. מאז גילוי חלבוני השלד הציטו-שלד החיידקיים המעורבים בחלוקת התא ובתחזוקת צורת התא, הם התגלו כמוקד מבטיח לפיתוח תרכובות אנטיבקטריאליות5. חלבונים אלה חיוניים לקיום חיידקים וממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על צורת התא (MreB, CreS), חלוקה (FtsZ, FtsA) והפרדת דנ"א (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), בדומה לשלד הציטוקריוטי בתאים איקריוטיים. יש לציין כי FtsZ מציג רמה גבוהה להפליא של שימור על פני מגוון רחב של אורגניזמים פרוקריוטים, בעוד MreB נמצא כמעט בכל החיידקים בצורת מוט. תפוצה כה רחבה ורלוונטיות בכדאיות התא הופכות חלבונים אלה למטרה מרתקת במחקר אנטיביוטי 5,6,7.

חיוני לאמץ גישה רב-זרועית המשלבת תצפיות in vivo, אינטראקציות במבחנה וניסויים אנזימטיים כדי לאמת ביסודיות חלבוני שלד חיידקי כמטרה העיקרית של מעכב פוטנציאלי7. הליכים מייגעים או השלכות עלות משמעותיות מכבידים על בדיקות זמינות רבות למטרה זו. אלה הם מכשולים בולטים לשימוש נרחב שלהם בסינון תרכובות עופרת שעלולות להשפיע על שלד החיידק. בין אלה, מיקרוסקופיה בולטת כשיטה יעילה ומהירה במיוחד להערכת יעילותן של תרכובות על ידי בחינה ישירה של שינויים במורפולוגיה של התא. עם זאת, האסוציאציה ההטרו-אסוציאטיבית של חלבון המטרה עם קומפלקסים ציטו-שלד אחרים, השפעות עקיפות הנובעות מקישור מחוץ למטרה ושינויים בפוטנציאל הממברנה, קושי לחדור לתא ביעילות, ונוכחות של משאבות אפלוקס, במיוחד בחיידקים גראם-שליליים, הופכים את איתור הגורם המדויק לעיוות תאי חיידקים 8,9,10 למורכב באופן קולקטיבי.

Schizosaccharomyces pombe, או שמרי ביקוע כפי שהם ידועים בדרך כלל, הוא אורגניזם איקריוטי חד-תאי בצורת מוט. שמרי ביקוע נמצאים בשימוש נרחב כאורגניזם מודל בביולוגיה תאית ומולקולרית בשל השימור יוצא הדופן בתהליכים תאיים כגון מחזור התא וחלוקתו, ארגון התא ושכפול כרומוזומים עם איקריוטים גבוהים יותר, כולל בני אדם11,12. יתר על כן, ארינגטון ועמיתיו ביטאו חלבון ציטו-שלד חיידקי מקומי בקוטב DivIVA בשמרי ביקוע כדי להדגים כי DivIVA הצטבר על משטחים מעוקלים שליליים13. שוב, Balasubramanian והקבוצה ביססו לראשונה שמרי ביקוע כמערכת מודל תאי כדי להביא תובנות חדשות על המנגנון, ההרכבה והדינמיקה של חלבון E. coli actin cytoskeleton כמו MreB14 ו tubulin homolog FtsZ15. הם גם מדגימים את היכולת של A22 לעכב ביעילות את פילמור MreB באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי כאשר הוא מבוטא בשמרים14. בעקבות זאת, קבוצות אחרות השתמשו בהצלחה גם בשמרי ביקוע כדי לחקור את תכונות ההרכבה של חלבוני כלורופלסט FtsZ1 ו-FtsZ216. לאחרונה, ביססנו הוכחת היתכנות לכדאיות השימוש בשמרי ביקוע כפלטפורמה תאית לסינון ספציפי של מעכבי שלד ציטו-שלד חיידקי על ידי ביצוע הערכה מקיפה של ההשפעה של שלושה מעכבי FtsZ ידועים - סנגווינרין, ברברין וחלבוני FtsZ PC190723 שמקורם בשני חיידקים פתוגניים, כלומר סטפילוקוקוס זהוב והליקובקטר פילורי17. בנוסף, בדיקה חד-שלבית זו המבוססת על תאים מוכיחה את עצמה כחיונית במזעור הסיכון לזיהוי תרכובות שעלולות להיות רעילות לתאים איקריוטים.

בדו"ח זה, תוך שימוש במערכת שמרי הביקוע, אנו מציעים זרימת עבודה שיטתית באמצעות צלחת סטנדרטית של 96 בארות לסינון וכימות חצי-אוטומטיים של ההשפעה של מעכבי מולקולות קטנות המכוונים ל-FtsZ מ-Staphylococcus aureus ול-MreB מ-Escherichia coli. כאן, אנו מגדירים וממטבים את זרימת העבודה החצי-אוטומטית באמצעות המעכבים המבוססים PC190723 ו- A22 המכוונים ספציפית ל- FtsZ ו- MreB, בהתאמה. תהליך עבודה זה משתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד בשלב ממונע בדיוק גבוה וברכישת תמונה אוטומטית בלוח סטנדרטי של 96 בארות כדי לשפר את התקינה הנוכחית. לפיכך, ניתן ליישם אותו על מסכים בעלי תפוקה בינונית וגבוהה של ספריות כימיות סינתטיות ולעקוף חלק מהאתגרים המפורטים לעיל.

Protocol

1. ביטוי חלבוני שלד חיידקי המתויגים GFP ב-S. pombe

הערה: ראה טבלה 1 למידע על כל הפלסמידים והזנים המשמשים כאן. ראה טבלה 2 עבור כל הרכבי המדיה.

  1. בצע שיבוט של E. coli MreB עם היתוך Gfp N-terminal (GFP-MreB) ו- S. aureus FtsZ הנושא GFP מסוף C (SaFtsZ-GFP) לתוך וקטור ביטוי S. pombe, pREP42 עם מקדם דיכוי תיאמין בעוצמה בינונית, nmt4118,19 כפי שתואר קודם לכן14,15. לשמור, להגביר ולבודד את הפלסמידים מזני E. coli (DH10β) כמתוארב-20,21.
    הערה: ניתן להשתמש גם בזני E. coli אחרים כגון DH5α, XL1Blue, TOP10 וכו 'או תאים מוסמכים אחרים הזמינים מסחרית המשמשים באופן שגרתי לשיבוט מולקולרי.
  2. הפיכת פלסמידים pREP42-GFP-EcMreB ו-pREP42-SaFtsZ-GFP ל-S. pombe
    1. הפוך את הפלסמידים pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) ו- pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) לזן S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) באמצעות שיטת ליתיום אצטט22, כפי שהוזכר בשלבים הבאים.
    2. יום 1 - תרבית ראשונית: יש לחסן לולאה של תרבית S. pombe טרייה ב-3 מ"ל של תמצית שמרים אוטוקלאביים ותוספי מזון (YES). לדגור אותו בשייקר מסלולית ב 30 ° C במשך הלילה (O/N).
    3. יום 2:
      1. תרבית משנית: להוסיף כ 500 μL של תרבית ראשונית ל 30 מ"ל של מרק YES autoclaved. לדגור ב 30 ° C במשך 3 - 4 שעות עם רעד OD600 מגיע 0.4 - 0.6.
        הערה: עבור כל טרנספורמציה, 30 מ"ל משמש.
      2. גלולה את תרבית 30 מ"ל ב 2,500 x גרם במשך 6-8 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את התאים ב-50 מ"ל מים מזוקקים סטריליים (D/W). הפילו שוב והשליכו את הסופר-נטנט. להשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של D / W סטרילי ולהעביר אותו לצינור צנטריפוגה 2 מ"ל. צנטריפוגה כנ"ל ולהשליך סופרנטנט.
      3. הוסף 1 מ"ל של 0.1 M ליתיום אצטט, תמיסת Tris-EDTA (LiAc-TE) וצנטריפוגה כאמור לעיל. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש ב-1 מ"ל של 0.1 M LiAc-TE. צנטריפוגה והשלכת סופרנטנט, תוך השארת 100 מיקרוליטר של תמיסה מאחור.
      4. הוסף 10 - 20 מיקרוגרם של DNA נשא (DNA זרע סלמון; מפורק הבזק מקורר על קרח) ו 2 - 3 מיקרוגרם של DNA פלסמיד, אשר צריך להיות מותנה. מערבבים בעדינות. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
      5. הוסף 260 μL של 40% PEG/LiAc-TE; מערבבים בעדינות. יש לדגור במשך 60 דקות בשייקר או בתרמומיקסר בטמפרטורה של 30°C בערבוב עדין. הוסף 43 μL של DMSO; מערבבים בעדינות.
      6. יש לחמם ב-42°C למשך 10 דקות ב-thermomixer. גלולה ב 2,500 x גרם במשך 6-8 דקות ולהשליך supernatant. לשטוף את הגלולה 1x עם 1 מ"ל של D / W סטרילי.
      7. כדור, להשליך supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה ב 200 μL של D/W סטרילי. צלחת 100 μL על לוחות אדינבורו בינוני מינימלי (EMM) המכילים 5 מיקרוגרם / מ"ל תיאמין (כדי לדכא מקדם nmt41 ) ותוספי חומצות אמינו אדנין (0.225 מ"ג / מ"ל), היסטידין (0.225 מ"ג / מ"ל) ולאוצין (0.225 מ"ג / מ"ל) אך חסר אורציל (סמן בחירה עבור פלסמיד pREP42).
        הערה: לחלופין, צלחת 70 μL ו 130 μL בשני לוחות שונים. שני נפחים שונים (70 μL ו-130 μL) מצופים כדי לקבל מושבות מבודדות על לפחות אחד מהלוחות בהתאם ליעילות הטרנספורמציה, שיכולה להשתנות מניסוי לניסוי.
      8. לדגור על הצלחות ב 30 ° C במשך 2-3 ימים עד מושבות מופיעות. מערבבים מושבה אחת עם 100 μL של D/W סטרילי ופורסים על צלחת EMM טרייה המכילה תיאמין אך חסר אורציל כמתואר לעיל.
      9. יש לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים עד לקבלת מדשאה שלמה. יש לגרד את מדשא התאים הגדל באמצעות לולאת חיסון ולהשהות אותה מחדש ל-1 מ"ל של מדיה YES המכילה 30% גליצרול בבקבוקון קריו.
      10. יש להקפיא את בקבוקון ההקפאה בחנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C כדי לשמר את מלאי השמרים הקפואים.
  3. ביטוי חלבוני שלד חיידקי בשמרי ביקוע
    1. פזרו כתם מציר הגליצרול על צלחת ספציפית לשמרים טריים כדי לקבל מספיק תרבית לניסויים נוספים.
      הערה: במקרה של pREP42, השתמשנו בצלחת אגר EMM (מדיה מינימלית) המכילה אדנין, היסטידין ולאוצין (כמו שימוש בזן S. pombe (h- leu1-32 ura4-D18)) ללא אורציל (אורציל קיים ב- pREP42 כסמן בחירה). אנו מוסיפים 15 - 20 מיקרומטר תיאמין ללוחות אגר (כמו pREP42 יש מקדם nmt41 מדכא תיאמין) כדי לדכא את הביטוי של הגן של עניין כאשר גדל על הצלחת.
    2. יש לחסן לולאה קטנה של האינקולום מהמדבקה המפוספסת לתוך 5 מ"ל של מדיה EMM ספציפית לשמרים ללא תיאמין ולדגור עליו במשך 10 - 12 שעות ב 30 מעלות צלזיוס.
      הערה: הביטוי של FtsZ ו-MreB ממינים שונים תחת מקדם nmt41 בפומבה S. יכול להשתנות, בדרך כלל בין 16 ל-30 שעות. הזמן האופטימלי לביטוי חלבון של GFP-EcMreB ו- SaFtsZ-GFP ב- S. pombe הוא 20 - 24 שעות ו- 16 - 20 שעות ב- 30 מעלות צלזיוס, בהתאמה, ללא תיאמין.

2. טיפול בתרביות S. pombe המבטאות חלבוני שלד חיידקיים מתויגים GFP

הערה: מספר מולקולות תרופה שונות נבדקות על תרבית שמרים שגדלה בלילה בצלחת של 96 בארות.

  1. חסן תרבית טרייה על ידי העברת 50 μL של תרבית הלילה לכל באר של צלחת 96 בארות המכילה 150 μL של מדיה EMM שמרים טריים באמצעות מכשיר צנרת חצי אוטומטי, 96 בארות רב ערוצי.
  2. תוך כדי ערבוב נכון פנימה והחוצה באמצעות פיפטה חצי-אוטומטית, רב-ערוצית בת 96 בארות, הכניסו לאט לאט ריכוזים הולכים וגדלים שונים של סמים לתרבות הגידול, שכל אחד מהם נעשה בטריפליקט כפי שמיוצג בסכמה באיור 1.
  3. כבקרה חיובית, השתמש בתרופות הידועות כבר, PC190723 עבור (S. aureus FtsZ) ו- A22 (עבור E. coli MreB) בכפילות.
    הערה: כפי שדווח בעבר, PC190723 ו- A22 שימשו בריכוז של 56.2 מיקרומטר17 ו- 72.6 מיקרומטר 14,17, בהתאמה. בינתיים, טיפול A22 ב- SaFtsZ וטיפול PC190723 ב- EcMreB שימשו כבקרות שליליות, בהתאמה.
  4. השתמש DMSO כבקרת ממס בשלושה ריכוזים שונים על פי הריכוזים הנמוכים והגבוהים ביותר של תרופות.
    הערה: הממס שבו תרופות מומסות משמש כבקרת ממס.
  5. לדגור על תרביות הבקרה והמטופלות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 6-10 שעות (עד שהתאים יראו ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים חיידקיים) ולאחר מכן לדגור באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

3. הדמיה של הפולימרים

  1. יש למרוח ציפוי של 20 μL של 1 מ"ג/מ"ל concanavalin A על כל באר של צלחת 96 בארות תחתונה שקופה אופטית (דופן שחורה להדמיית פלואורסצנטיות) ולדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשאוף נוזל ולתת לו להתייבש באוויר במשך 10 דקות.
  2. מעבירים 20 μL של תאים מצלחת התרבית לכל באר בהתאמה ומניחים לשבת במשך 10 דקות. שטפו את התא 3x-4x עם מדיית EMM סטרילית.
  3. כאשר עדשת האובייקט לשימוש במקום (ראה שלב 3.6), השתמש במצב הנווט בלוח הרכישה של תוכנת רכישת התמונה ליישור לוחות של 96 בארות וכיסוי היטב. יישר היטב קצוות על הנווט.
  4. לאחר מכן, בחר את פרמטרי כיסוי הבאר, הכוללים בחירה מרובת מיקומים של אזור העניין בבאר, והשתמש בבקרת מיקוד אוטומטי אדפטיבית עם מצב לפי דרישה כדי לשמור על הדגימה בפוקוס במהלך ההדמיה.
  5. קבל תמונות באמצעות ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) ופלואורסצנטיות. הגדר מסנני עירור ופליטה של 475/28 ננומטר ו- 525/48 ננומטר, בהתאמה, כדי לצלם את חלבוני החיידקים המתויגים ב- GFP המבוטאים בשמרים. קבל ערימות Z בגודל צעד של 0.2 מיקרומטר דרך עובי תאי השמרים (5 מיקרומטר).
  6. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך המצויד ביעד טבילת שמן 100x, 1.4-NA ומצלמת sCMOS בגודל 2,000 x 2,000 (גודל פיקסל 6.5 מיקרומטר x 6.5 מיקרומטר). השתמש במערכת תאורת LED לעירור של פלואורופור.
    הערה: כל מערכת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי שיש לה במה ממונעת עבור צלחת 96 בארות עם מיקום מדויק רב נקודתי צריכה להיות מתאימה. לרכוש את כל תמונות התא של בקרה וטיפול תרופתי עם זמן חשיפה דומה (בדרך כלל בטווח של 0.3 - 0.5 שניות) בקישור של 1 x 1 והארה ב 15% - 20% כדי למזער את משתני הניסוי ולשמור על עקביות.

4. כימות התמונות באמצעות ImageJ

  1. עבד תמונות תא ומדוד את מספר הכתמים לתא ואת צפיפותו עבור FtsZ17. במקרה של MreB, למדוד צפיפות ואנאיזוטרופיה23 ולהשוות בין תאי ביקורת ומטופלים באמצעות פיג'י (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
  2. באמצעות התמונות מערוץ DIC, תחילה שרטט את תאי השמרים הבודדים באמצעות כלי הציור ביד חופשית ושמור כאזור עניין (ROI) במנהל החזר ההשקעה. שלב זה עדיין אינו אוטומטי, אך ניתן לנסות ולשלב כלים שפותחו לאחרונה באמצעות למידת מכונה25,26 בעתיד הקרוב.
  3. יש להסוות את האזור החיצוני של התא ולמלא אותו בשחור כמתואר בסעיף27.
  4. השתמש במאקרו OPS threshold IJ1 analyzese, תכונה מוכללת בפיג'י, כדי לספור את מספר המקומות24.
  5. השתמש בשיטת otsu לסף אוטומטי והסוו את החלקיקים המקוטעים. הפעל את תוסף ניתוח החלקיקים באמצעות מאקרו.
  6. למדידת צפיפות פולימר (כמות שלד ציטו-שלד ליחידת שטח בתא), יש לעבד תמונות כמתואר, כולל שלבי מיסוך ושלד27,28. השתמש ב- Lpx 2Dfilter בתוסף lpx כדי ליצור שלד של התמונות.
  7. לקבלת פרטים, עיין בפרסום האחרון17. בצע כימות פולימר EcMreB כפי שהוזכר קודם לכן ב23, השתמש באנאיזוטרופיה כדי לכמת ארגון מרחבי באמצעות FibrilTool29 כפי שתואר קודם לכן23.
    הערה: שיטות ניתוח אלה יכולות לשמש לכימות כל חלבוני שלד חיידקיים אחרים אשר מטופלים או לא מטופלים על ידי התרופות.

תוצאות

הגדרת צלחת 96 בארות להקרנת סמים
השימוש ב-S. pombe כדי לבטא C-terminally GFP המתויג S. aureus FtsZ מתוך וקטור (pREP42) המכיל את מקדם התיאמין בעל החוזק הבינוני nmt41נקבע בעבר17 ובאופן דומה, E. coli MreB המתויג עם N- terminal GFP בוטא גם ב-S. pombe14. הראינו גם כי PC190723, מעכב ס?...

Discussion

עמידות מיקרוביאלית (AMR) היא איום בריאותי עולמי רציני, ויש צורך דחוף באנטיביוטיקה חדשה עם מטרות חדשות. שלד הציטו-שלד החיידקי התגלה כיעד אטרקטיבי לפיתוח אנטיביוטיקה חדשה, עם מעכבי מולקולות קטנות של חלבון חלוקת התא FtsZ, כגון TXA709, שכבר נמצא בשלב I של ניסויים קליניים30. מספר שיטות פותח...

Disclosures

כל המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

SMP, SR ו-AKS מכירים במלגות שהתקבלו מהמכון הלאומי לחינוך מדעי ומחקר, המחלקה לאנרגיה אטומית. RS מכירה בתמיכה במימון פנימי מהמחלקה לאנרגיה אטומית, ועבודה זו נתמכת באמצעות מענק מחקר ל-RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) מהמחלקה לביוטכנולוגיה (DBT). המחברים גם מודים ל- V Badireenath Konkimalla על הערותיו, הצעותיו ודיוניו לאורך פיתוח הפרוטוקול.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. BlackThermo Scientific™160376
96-well plateCorning  CLS3370
A22 HydrochlorideSigma SML0471Dissolved in DMSO
AdenineFormediumTMDOC0229225 mg/L of media 
Concanavalin A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)FormediumTMPMD0210See below for composition
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position sliderEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L of media 
Leica DMi8 inverted fluorescence microscopeLeica MicrosystemsGerman company
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L of media 
Lithium acetate Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)Sigma 202398
ThiamineSigmaT4625Filter sterilised
Tris-HydrochlorideMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) AgarFormediumTMPCM0410See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) BrothFormediumTMPCM0310See below for composition
Yeast (S. pombe) media 
Yeast extract + supplements (YES)
Compositiong/L
Yeast extract5
Dextrose30
Agar17
Adenine0.05
L-Histidine0.05
L-Leucine0.05
L-Lysine HCl0.05
Uracil0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
Compositiong/Lconcentration
potassium hydrogen phthallate 314.7mM
Na2HPO4 2.215.5 mM
NH4Cl 593.5 mM
glucose2% (w/v) or 20 g/L 111 mM
Salts (stock x 50)20 mL/L (v/v)
Vitamins (stock x 1000)1 mL/L (v/v)
Minerals (Stock x 10,000)0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) 52.50.26 M
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) 0.0007354.99 mM
50 g/l KCl (0.67 M) 500.67 M
2 g/l Na2SO4 (14.l mM)214.1 mM
Vitamins x 1000 1 g/l pantothenic acid 14.20 mM
10 g/l nicotinic acid 1081.2 mM
10 g/l inositol 1055.5 mM
10 mg/l biotin 0.0140.8 µM
Minerals x 10,000 boric acid580.9 mM
MnSO4  423.7 mM
ZnSO4.7H2O413.9 mM
FeCl2.6H2O  27.40 mM
molybdic acid 0.42.47 mM
KI 16.02 mM
CuSO4.5H2O 0.41.60 mM
citric acid 1047.6 mM
Strains/ Plasmids
StrainsDescriptionReference
CCD190Escherichia coli DH10β Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023

References

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  2. Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
  3. Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
  4. Sanchez, S., Demain, A. L. . Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).
  5. Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
  6. Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
  7. Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
  8. Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
  9. Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
  10. Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
  11. Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
  12. Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
  13. Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
  14. Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
  15. Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
  16. TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
  17. Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
  18. Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
  19. Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  22. Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  23. Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
  26. Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
  27. Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
  28. Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
  29. Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
  30. Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
  31. Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
  32. Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
  33. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  34. Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
  35. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  36. Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
  37. Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

206

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved