JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Дрожжи деления используются здесь в качестве гетерологичного хозяина для экспрессии бактериальных цитоскелетных белков, таких как FtsZ и MreB, в качестве трансляционных гибридных белков с GFP для визуализации их полимеризации. Кроме того, соединения, влияющие на полимеризацию, идентифицируются с помощью визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа.

Аннотация

Бактериальные цитоскелетные белки, такие как FtsZ и MreB, выполняют важные функции, такие как деление клеток и поддержание их формы. Кроме того, FtsZ и MreB стали важными мишенями для открытия новых противомикробных препаратов. Было разработано несколько анализов для идентификации соединений, нацеленных на связывание нуклеотидов и полимеризацию этих белков цитоскелета, в первую очередь ориентированных на FtsZ. Более того, многие из анализов являются либо трудоемкими, либо дорогостоящими, и выяснение того, являются ли эти белки клеточной мишенью препарата, часто требует нескольких методов. Наконец, токсичность препаратов для эукариотических клеток также представляет проблему. Здесь мы описываем одноэтапный клеточный анализ для обнаружения новых молекул, нацеленных на бактериальный цитоскелет, и минимизации попаданий, которые могут быть потенциально токсичными для эукариотических клеток. Дрожжи деления поддаются высокопроизводительному скринингу, основанному на микроскопии, и визуальный экран может легко идентифицировать любую молекулу, которая изменяет полимеризацию FtsZ или MreB. В нашем анализе используется стандартный 96-луночный планшет, и он полагается на способность бактериальных цитоскелетных белков полимеризоваться в эукариотической клетке, такой как дрожжи деления. Хотя описанные здесь протоколы предназначены для дрожжей деления и используют FtsZ из золотистого стафилококка и MreB из кишечной палочки, они легко адаптируются к другим бактериальным белкам цитоскелета, которые легко собираются в полимеры в любых эукариотических экспрессирующих хозяевах. Описанный здесь метод должен помочь в дальнейшем открытии новых противомикробных препаратов, нацеленных на бактериальные цитоскелетные белки.

Введение

Широко распространенная устойчивость почти ко всем антибиотикам, используемым в настоящее время для борьбы с бактериальными инфекциями, создала немедленную потребность в новых категориях антибиотиков. В отчете за 2019 год указано, что устойчивые к антибиотикам инфекции привели к потере 1,27 миллиона жизней, что в общей сложности составило 4,95 миллиона смертей, если учитывать осложнения от резистентных бактериальных инфекций1. Несмотря на то, что антибиотики по-прежнему эффективны в клинической практике, они преимущественно нацелены на узкий спектр клеточных процессов, в первую очередь фокусируясь на клеточной стенке, ДНК и синтезе белка. За последние полвека менее 30 белков были коммерчески использованы в качестве мишеней для разработки новыхантибактериальных 2,3. Этот ограниченный диапазон жизнеспособных мишеней значительно ограничивает открытие новых антибиотиков или их производных для борьбы с устойчивыми к антибиотикам бактериями. Таким образом, для преодоления возникающей проблемы устойчивости к антибиотикам существует необходимость в разработке новых антибиотиков с новыми мишенями и механизмами действия.

Антибактериальная мишень в идеале должна быть важным компонентом роста бактериальных клеток, сохраняться у филогенетически разнообразных видов, демонстрировать наименьшую эукариотическую гомологию и быть доступной дляантибиотиков. С момента открытия бактериальных белков цитоскелета, участвующих в делении и поддержании клеточной формы, они стали многообещающим центром для разработкиантибактериальных соединений. Эти белки необходимы для жизнеспособности бактерий и играют ключевую роль в поддержании формы клеток (MreB, CreS), делении (FtsZ, FtsA) и сегрегации ДНК (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), сродни цитоскелету в эукариотических клетках. Примечательно, что FtsZ демонстрирует удивительно высокий уровень сохранения в широком спектре прокариотических организмов, в то время как MreB обнаружен почти во всех палочковидных бактериях. Такое широкое распространение и значимость для жизнеспособности клеток делают эти белки увлекательной мишенью в исследованиях антибиотиков 5,6,7.

Крайне важно принять многосторонний подход, который сочетает в себе наблюдения in vivo, взаимодействия in vitro и ферментативные эксперименты для тщательной проверки белков цитоскелета бактерий в качестве основной мишени потенциального ингибитора7. Трудоемкие процедуры или значительные затраты затрудняют многие доступные анализы для этой цели. Это заметные препятствия для их широкого использования в скрининге соединений свинца, которые могут повлиять на цитоскелет бактерий. Среди них микроскопия выделяется как исключительно эффективный и быстрый метод оценки эффективности соединений путем непосредственного изучения изменений в морфологии клеток. Тем не менее, гетероассоциация белка-мишени с другими комплексами цитоскелета, косвенные эффекты из-за нецелевого связывания и изменений мембранного потенциала, трудности в эффективном проникновении в клетку и наличие насосов оттока, особенно у грамотрицательных бактерий, в совокупности затрудняют точное определение причины деформации бактериальной клетки 8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, или дрожжи деления, как их обычно называют, представляют собой палочковидный одноклеточный эукариотический организм. Дрожжи деления широко используются в качестве модельного организма в клеточной и молекулярной биологии из-за необычайного сохранения в клеточных процессах, таких как клеточный цикл и деление, клеточная организация и репликация хромосом с высшими эукариотами, включая человека11,12. Кроме того, Эррингтон и коллеги экспрессировали локализованный на полюсе бактериальный цитоскелетный белок DivIVA в дрожжах деления, чтобы продемонстрировать, что DivIVA накапливается на отрицательно изогнутых поверхностях13. Опять же, Баласубраманиан и его коллеги впервые установили дрожжи деления в качестве клеточной модельной системы, чтобы по-новому взглянуть на механизм, сборку и динамику белка цитоскелета актина E. coli, такого как MreB14 и гомолог тубулина FtsZ15. Они также демонстрируют способность A22 эффективно препятствовать полимеризации MreB с помощью эпифлуоресцентной микроскопии при экспрессии в дрожжах14. После этого другие группы также успешно использовали дрожжи деления для изучения свойств сборки белков хлоропластов FtsZ1 и FtsZ216. Совсем недавно мы установили доказательство жизнеспособности использования дрожжей деления в качестве клеточной платформы для специфического скрининга бактериальных ингибиторов цитоскелета, проведя всестороннюю оценку воздействия трех известных ингибиторов FtsZ — сангвинарина, берберина и PC190723 — на белки FtsZ, полученные из двух патогенных бактерий, а именно Staphylococcus aureus и Helicobacter pylori17. Кроме того, этот одноэтапный клеточный анализ играет важную роль в минимизации риска выявления соединений, которые могут быть потенциально токсичными для эукариотических клеток.

В этом отчете, используя систему деления дрожжей, мы предлагаем систематический рабочий процесс с использованием стандартного 96-луночного планшета для полуавтоматического скрининга и количественной оценки эффекта низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на FtsZ из Staphylococcus aureus и MreB из Escherichia coli. Здесь мы настраиваем и оптимизируем полуавтоматический рабочий процесс с использованием установленных ингибиторов PC190723 и A22, которые специально нацелены на FtsZ и MreB соответственно. В этом рабочем процессе используется эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный моторизованным высокоточным столиком, и автоматический сбор изображений в стандартном 96-луночном планшете для улучшения текущей стандартизации. Следовательно, его можно применять как для средних, так и для высокопроизводительных экранов библиотек синтетических химических веществ и обходит некоторые из перечисленных выше проблем.

протокол

1. Экспрессия GFP-меченых белков бактериального цитоскелета у S. pombe

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите Таблицу 1 для получения информации обо всех плазмидах и штаммах, используемых здесь. Пожалуйста, смотрите Таблицу 2 для всех медиа-композиций.

  1. Клонирование E. coli MreB с N-концевым слиянием GFP (GFP-MreB) и S. aureus FtsZ, несущим C-концевой GFP (SaFtsZ-GFP), в вектор экспрессии S. pombe, pREP42 с тиамино-репрессируемым промотором средней силы, nmt4118,19, как описано ранее14,15. Поддерживайте, амплифицируйте и изолируйте плазмиды из штаммов E. coli (DH10β), как описано в20,21.
    Другие штаммы E. coli , такие как DH5α, XL1Blue, TOP10 и т.д., или другие коммерчески доступные компетентные клетки, обычно используемые для молекулярного клонирования, также могут быть использованы.
  2. Трансформация плазмид pREP42-GFP-EcMreB и pREP42-SaFtsZ-GFP в S. pombe
    1. Преобразовать плазмиды pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) и pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) в штамм S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) с использованием метода22 ацетата лития, как указано в следующих шагах.
    2. День 1 - Первичная культура: Инокулируйте полную петлю свежеочищенной культуры S. pombe в 3 мл автоклавного дрожжевого экстракта и бульона добавок (YES). Инкубируйте его в орбитальном шейкере при 30 °C в течение ночи (O/N).
    3. День 2:
      1. Вторичная культура: Добавьте около 500 μл первичной культуры к 30 мл автоклавного бульона YES. Выдерживают при 30 °C в течение 3 - 4 ч с встряхиванием до достижения наружного диаметра600 0,4 - 0,6.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого преобразования используется 30 мл.
      2. Гранулируйте 30 мл культуры при 2 500 х г в течение 6-8 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 50 мл стерильной дистиллированной воды (D/W). Снова вылейте гранулы и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 1 мл стерильного D/W и перенесите его в центрифужную пробирку объемом 2 мл. Центрифуга, как указано выше, и выбросьте надосадочную жидкость.
      3. Добавьте 1 мл 0,1 М ацетата лития, раствор Tris-EDTA (LiAc-TE) и центрифугу, как указано выше. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 1 мл 0,1 М LiAc-TE. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, оставив 100 μл раствора.
      4. Добавьте 10 - 20 мкг ДНК-носителя (ДНК спермы лосося; денатурированная и охлажденная на льду) и 2 - 3 мкг плазмидной ДНК, которую необходимо трансформировать. Аккуратно перемешайте. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 мин.
      5. Добавьте 260 μл 40 % PEG/LiAc-TE; Аккуратно перемешайте. Выдерживать в течение 60 минут в шейкере или термомиксере при температуре 30 °C при бережном перемешивании. Добавить 43 μл ДМСО; Аккуратно перемешайте.
      6. Тепловой шок при 42 °C в течение 10 минут в термомиксере. Гранулы при 2 500 х г в течение 6-8 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте гранулу 1 мл стерильного D/W.
      7. Гранулы, удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать гранулу в 200 мкл стерильного D/W. Планшет 100 мкл на планшетах Edinburgh minimal medium (EMM), содержащих 5 мкг/мл тиамина (для подавления промотора nmt41 ) и аминокислотных добавок аденина (0,225 мг/мл), гистидина (0,225 мг/мл) и лейцина (0,225 мг/мл), но без урацила (маркер отбора для плазмиды pREP42).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поочередно пластины 70 μL и 130 μL в двух разных планшетах. Два разных объема (70 мкл и 130 мкл) покрываются для получения изолированных колоний по крайней мере на одном из планшетов в зависимости от эффективности трансформации, которая может варьироваться от эксперимента к эксперименту.
      8. Инкубируйте планшеты при 30 °C в течение 2-3 дней до появления колоний. Смешайте одну колонию со 100 мкл стерильного D/W и разложите на свежей чашке EMM, содержащей тиамин, но без урацила, как описано выше.
      9. Выдерживают при 30 °C в течение 2-3 дней, пока не появится полноценный газон. Выросшую лужайку клеток измельчите с помощью инокуляционной петли и повторно суспендируйте в 1 мл среды YES, содержащей 30% глицерина, в криофлаконе.
      10. Мгновенно заморозьте криопробирку в жидком азоте и храните при температуре -80 °C, чтобы сохранить замороженные запасы дрожжей.
  3. Экспрессия белков цитоскелета бактерий в дрожжах деления
    1. Асептически нанесите пластырь из глицеринового бульона на свежую дрожжевую пластину, чтобы получить достаточно культуры для дальнейших экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае pREP42 мы использовали агаровую пластину EMM (минимальная среда), содержащую аденин, гистидин и лейцин (как при использовании штамма S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18)) без урацила (урацил, присутствующий в pREP42 в качестве маркера отбора). Мы добавляем 15 - 20 мкМ тиамина в агаровые пластины (так как pREP42 имеет тиаминовый репрессируемый промотор nmt41 ), чтобы подавить экспрессию интересующего гена при росте на пластине.
    2. Инокулируйте небольшую петлю инокулята из полосчатого участка в 5 мл дрожжеспецифичной среды EMM, в которой отсутствует тиамин, и инкубируйте в течение 10-12 ч при 30 °C.
      Экспрессия FtsZ и MreB у различных видов под промотором nmt41 у S. pombe может варьировать, обычно от 16 до 30 ч. Оптимальное время экспрессии белков GFP-EcMreB и SaFtsZ-GFP в S. pombe составляет 20 - 24 ч и 16 - 20 ч при 30 °С, соответственно, без тиамина.

2. Обработка культур S. pombe , экспрессирующих GFP-меченые бактериальные цитоскелетные белки

ПРИМЕЧАНИЕ: Ряд различных молекул лекарственного препарата тестируется на культуре дрожжей, выращенной за ночь, в 96-луночном планшете.

  1. Инокулировать свежую культуру путем переноса 50 мкл ночной культуры в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего 150 мкл свежей дрожжевой среды EMM, с помощью полуавтоматического 96-луночного многоканального пипетирования.
  2. Во время пипетирования внутрь и наружу для правильного смешивания с помощью полуавтоматической 96-луночной многоканальной пипетки медленно вводите различные возрастающие концентрации лекарственных препаратов в растущую культуру, каждая из которых выполняется в трех экземплярах, как показано на схеме на рисунке 1.
  3. В качестве положительного контроля используют уже известные препараты, PC190723 для (S. aureus FtsZ) и А22 (для E. coli MreB) в двух экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как сообщалось ранее, PC190723 и А22 использовали в концентрации 56,2мкМ17 и 72,6 мкМ 14,17 соответственно. Между тем, лечение A22 SaFtsZ и лечение PC190723 EcMreB служили отрицательным контролем соответственно.
  4. Используйте ДМСО в качестве растворителя в трех различных концентрациях в соответствии с самой низкой и самой высокой концентрацией лекарств.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворитель, в котором растворяются лекарственные средства, используется в качестве средства контроля растворителя.
  5. Инкубируют контрольную и обработанную культуры при 30 °С в течение 6-10 ч (до тех пор, пока клетки не проявят экспрессию бактериальных флуоресцентных белков), а затем визуализируют с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.

3. Визуализация полимеров

  1. Нанесите покрытие из 20 мкл конканавалина А 1 мг/мл на каждую лунку 96-луночного планшета с оптически прозрачным дном (с черными стенками для флуоресцентной визуализации) и инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре. Аспирируйте жидкость и дайте ей высохнуть на воздухе в течение 10 минут.
  2. Перенесите 20 μл клеток из культивального планшета в каждую соответствующую лунку и оставьте на 10 минут. Промойте ячейку 3x-4x стерильным средой EMM.
  3. Установив объектив, который будет использоваться (см. шаг 3.6), используйте режим навигатора на панели сбора данных программного обеспечения для получения изображений для выравнивания 96-луночных планшетов и покрытия лунок. Выровняйте кромки колодцев в навигаторе.
  4. Затем выберите параметры покрытия скважины, которые включают в себя многопозиционный выбор интересующей области в скважине, и используйте адаптивное управление автофокусировкой с режимом по требованию, чтобы образец оставался в фокусе во время визуализации.
  5. Получение изображений с помощью дифференциального интерференционного контраста (DIC) и флуоресценции. Установите фильтры возбуждения и излучения с длиной волны 475/28 нм и 525/48 нм соответственно для визуализации бактериальных белков, меченных GFP, экспрессируемых в дрожжах. Получение Z-стеков с шагом 0,2 мкм по толщине дрожжевых клеток (5 мкм).
  6. Получение изображений с помощью инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного 100-кратным масляным иммерсионным объективом 1,4 NA и камерой 2 000 x 2 000 sCMOS (размер пикселя 6,5 μм x 6,5 μм). Используйте светодиодную систему подсветки для возбуждения флуорофора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подойдет любая система эпифлуоресцентного микроскопа, имеющая моторизованный предметный столик для 96-луночного планшета с точным многоточечным позиционированием. Получите все изображения клеток контрольной и обработанной лекарственными препаратами с одинаковым временем экспозиции (обычно в диапазоне 0,3 - 0,5 с) при группировании 1 x 1 и освещенности 15% - 20%, чтобы свести к минимуму экспериментальные переменные и сохранить согласованность.

4. Количественная оценка изображений с помощью ImageJ

  1. Обработка изображений клеток и измерение количества пятен на ячейку и плотности для FtsZ17. В случае MreB измеряют плотность и анизотропию23 и сравнивают контрольные и обработанные клетки с помощью Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
  2. Используя изображения из канала DIC, сначала обведите отдельные дрожжевые клетки с помощью инструмента рисования от руки и сохраните как область интереса (ROI) в менеджере ROI. Этот шаг еще не автоматизирован, но недавно разработанные инструменты с использованием машинного обучения25,26 могут быть опробованы и внедрены в ближайшем будущем.
  3. Замаскируйте внешнюю область ячейки и залейте ее черным цветом, как описано впункте 27.
  4. Используйте макрос анализа порога OPS IJ1, встроенную функцию на Фиджи, чтобы подсчитать количество пятен24.
  5. Используйте метод оцу для автоматического порогирования и маскируйте сегментированные частицы. Запустите плагин для анализа частиц с помощью макроса.
  6. Для измерения плотности полимера (количества цитоскелета на единицу площади в клетке) обрабатывают изображения, как описано, включая стадии маскирования и скелетирования27,28. Используйте Lpx 2Dfilter в плагине lpx для скелетирования изображений.
  7. Для получения подробной информации ознакомьтесь с этой недавней публикацией17. Выполните количественное определение полимера EcMreB, как ранее упоминалось впункте 23, используйте анизотропию для количественного определения пространственной организации с помощью инструмента FibrilTool29 , как описано ранеев пункте 23.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти методы анализа могут быть использованы для количественного определения любых других бактериальных белков цитоскелета, которые обрабатываются или не обрабатываются препаратами.

Результаты

Установка 96-луночного планшета для скрининга лекарств
Использование S. pombe для экспрессии C-концевого GFP-меченного S. aureus FtsZ из вектора (pREP42), содержащего тиаминовый репрессируемый промотор nmt41средней концентрации, было установлено ранее17, и аналогич...

Обсуждение

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой серьезную глобальную угрозу здоровью, и существует острая потребность в новых антибиотиках с новыми мишенями. Бактериальный цитоскелет стал привлекательной мишенью для разработки новых антибиотиков, с низкомолекул...

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

SMP, SR и AKS признают стипендии, полученные от Национального института научного образования и исследований, Департамент атомной энергии. RS признает внутреннюю финансовую поддержку со стороны Департамента атомной энергии, и эта работа поддерживается за счет исследовательского гранта RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) от Департамента биотехнологии (DBT). Авторы также выражают признательность В. Бадиринатху Конкималле за его комментарии, предложения и обсуждения на протяжении всей разработки протокола.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. BlackThermo Scientific™160376
96-well plateCorning  CLS3370
A22 HydrochlorideSigma SML0471Dissolved in DMSO
AdenineFormediumTMDOC0229225 mg/L of media 
Concanavalin A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)FormediumTMPMD0210See below for composition
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position sliderEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L of media 
Leica DMi8 inverted fluorescence microscopeLeica MicrosystemsGerman company
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L of media 
Lithium acetate Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)Sigma 202398
ThiamineSigmaT4625Filter sterilised
Tris-HydrochlorideMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) AgarFormediumTMPCM0410See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) BrothFormediumTMPCM0310See below for composition
Yeast (S. pombe) media 
Yeast extract + supplements (YES)
Compositiong/L
Yeast extract5
Dextrose30
Agar17
Adenine0.05
L-Histidine0.05
L-Leucine0.05
L-Lysine HCl0.05
Uracil0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
Compositiong/Lconcentration
potassium hydrogen phthallate 314.7mM
Na2HPO4 2.215.5 mM
NH4Cl 593.5 mM
glucose2% (w/v) or 20 g/L 111 mM
Salts (stock x 50)20 mL/L (v/v)
Vitamins (stock x 1000)1 mL/L (v/v)
Minerals (Stock x 10,000)0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) 52.50.26 M
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) 0.0007354.99 mM
50 g/l KCl (0.67 M) 500.67 M
2 g/l Na2SO4 (14.l mM)214.1 mM
Vitamins x 1000 1 g/l pantothenic acid 14.20 mM
10 g/l nicotinic acid 1081.2 mM
10 g/l inositol 1055.5 mM
10 mg/l biotin 0.0140.8 µM
Minerals x 10,000 boric acid580.9 mM
MnSO4  423.7 mM
ZnSO4.7H2O413.9 mM
FeCl2.6H2O  27.40 mM
molybdic acid 0.42.47 mM
KI 16.02 mM
CuSO4.5H2O 0.41.60 mM
citric acid 1047.6 mM
Strains/ Plasmids
StrainsDescriptionReference
CCD190Escherichia coli DH10β Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023

Ссылки

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  2. Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
  3. Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
  4. Sanchez, S., Demain, A. L. . Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).
  5. Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
  6. Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
  7. Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
  8. Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
  9. Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
  10. Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
  11. Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
  12. Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
  13. Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
  14. Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
  15. Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
  16. TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
  17. Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
  18. Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
  19. Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  22. Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  23. Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
  26. Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
  27. Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
  28. Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
  29. Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
  30. Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
  31. Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
  32. Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
  33. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  34. Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
  35. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  36. Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
  37. Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

206

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены