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要約

ここでは、分裂酵母を異種宿主として利用し、FtsZやMreBなどの細菌細胞骨格タンパク質をGFPとの翻訳融合タンパク質として発現させ、それらの重合を可視化します。また、重合に影響を与える化合物は、蛍光顕微鏡を用いたイメージングによって同定されます。

要約

FtsZやMreBなどの細菌の細胞骨格タンパク質は、細胞分裂や細胞形状の維持など、本質的な機能を果たしています。さらに、FtsZとMreBは、新規抗菌薬発見の重要な標的として浮上しています。これらの細胞骨格タンパク質のヌクレオチド結合と重合を標的とする化合物を同定するために、主にFtsZに焦点を当てたいくつかのアッセイが開発されています。さらに、アッセイの多くは手間がかかるか、費用がかかるため、これらのタンパク質が薬物の細胞標的であるかどうかを確認するには、多くの場合、複数の方法が必要です。最後に、真核細胞に対する薬物の毒性も問題を引き起こします。ここでは、細菌の細胞骨格を標的とする新しい分子を発見し、真核細胞に潜在的に毒性がある可能性のあるヒットを最小限に抑えるためのシングルステップの細胞ベースのアッセイについて説明します。分裂酵母は、顕微鏡法に基づくハイスループットスクリーニングに適しており、視覚的スクリーニングにより、FtsZまたはMreBの重合を変化させる分子を容易に同定できます。私たちのアッセイは、標準的な96ウェルプレートを利用し、分裂酵母などの真核細胞で重合する細菌の細胞骨格タンパク質の能力に依存しています。ここに記載されているプロトコルは分裂酵母用であり、 黄色ブドウ球菌 由来のFtsZおよび 大腸菌由来のMreBを利用していますが、真核生物の発現宿主でポリマーに容易に集合する他の細菌細胞骨格タンパク質に容易に適応できます。ここで説明する方法は、細菌の細胞骨格タンパク質を標的とする新規抗菌薬のさらなる発見を促進するのに役立つはずです。

概要

細菌感染症と戦うために現在採用されているほぼすべての抗生物質に対する広範な耐性により、新しいカテゴリーの抗生物質がすぐに必要になりました。2019年の報告によると、抗生物質耐性感染症は127万人の命を落とし、耐性菌感染症による合併症を考慮すると、全体で495万人が死亡したとのことです1。臨床診療では依然として有効ですが、現在の抗生物質は、主に細胞壁、DNA、およびタンパク質合成に焦点を当てた、狭い範囲の細胞プロセスを主に標的としています。過去半世紀にわたって、新しい抗菌薬の開発の標的として商業的に利用されたタンパク質は30未満です2,3。このように、実行可能な標的の範囲が限られているため、抗生物質耐性菌と戦うための新しい抗生物質やその誘導体の発見に大きな制約が生じます。したがって、新たな抗生物質耐性の問題を克服するためには、新しい標的と作用機序を持つ新しい抗生物質の開発が必要です。

抗菌標的は、理想的には細菌細胞増殖の必須成分であり、系統発生的に多様な種全体で保存され、真核生物の相同性が最も低く、抗生物質へのアクセスが可能である必要があります4。細胞分裂や細胞形状維持に関与する細菌の細胞骨格タンパク質が発見されて以来、抗菌化合物の開発に有望な焦点として浮上しています5。これらのタンパク質は、細菌の生存能力に不可欠であり、真核細胞の細胞骨格と同様に、細胞の形状(MreB、CreS)、分裂(FtsZ、FtsA)、およびDNA分離(ParM、TubZ、PhuZ、AlfA)の維持に極めて重要な役割を果たします。特に、FtsZは広範囲の原核生物にわたって著しく高いレベルの保存性を示し、MreBはほぼすべての棒状細菌に見られます。このような幅広い分布と細胞生存率の関連性により、これらのタンパク質は抗生物質研究において魅力的な標的となっています5,6,7。

in vivo観察、in vitro相互作用、および酵素実験を組み合わせた多面的なアプローチを採用して、潜在的な阻害剤の主要な標的として細菌の細胞骨格タンパク質を徹底的に検証することが重要です7。面倒な手順や実質的なコストへの影響は、この目的のために利用可能な多くのアッセイを妨げます。これらは、細菌の細胞骨格に影響を与える可能性のあるリード化合物のスクリーニングにおける広範な利用に対する顕著な障害です。中でも顕微鏡法は、細胞形態の変化を直接調べることで化合物の有効性を評価するための非常に効率的かつ迅速な方法として際立っています。しかし、標的タンパク質と他の細胞骨格複合体とのヘテロ会合、オフターゲット結合および膜電位の変化による間接的な影響、細胞への効率的な浸透の困難さ、および特にグラム陰性菌における排出ポンプの存在により、細菌細胞の変形の正確な原因を特定することは集合的に複雑になります8,9,10。

Schizosaccharomyces pombe、または一般に知られている分裂酵母は、棒状の単細胞真核生物です。分裂酵母は、細胞周期と分裂、細胞組織化、ヒトを含む高等真核生物との染色体複製などの細胞プロセスにおける並外れた保存により、細胞生物学および分子生物学のモデル生物として広く使用されています11,12。さらに、Erringtonらは、極に局在する細菌細胞骨格タンパク質DivIVAを分裂酵母で発現させ、DivIVAが負の曲面に蓄積することを実証しました13。ここでも、Balasubramanianらは、MreB14やチューブリン相同体FtsZ15のような大腸菌アクチン細胞骨格タンパク質のメカニズム、アセンブリ、およびダイナミクスに新たな洞察をもたらすために、細胞モデルシステムとして分裂酵母を最初に確立しました。また、酵母14で発現した場合、落射蛍光顕微鏡でMreBの重合を効率的に妨げるA22の能力も実証されています。これに続いて、他のグループも分裂酵母を使用して、葉緑体FtsZ1およびFtsZ2タンパク質の集合特性を研究することに成功しました16。最近では、2つの病原菌、すなわち黄色ブドウ球菌とヘリコバクターピロリに由来する3つの既知のFtsZ阻害剤(サンギナリン、ベルベリン、およびPC190723オンFtsZタンパク質)の影響を包括的に評価することにより、細菌細胞骨格阻害剤を特異的にスクリーニングするための細胞プラットフォームとしての分裂酵母の使用の実行可能性の概念実証を確立しました17.さらに、このシングルステップの細胞ベースのアッセイは、真核細胞に潜在的に毒性がある可能性のある化合物を特定するリスクを最小限に抑えるのに役立つことが証明されています。

本報告では、分裂酵母システムを利用して、 黄色ブドウ球菌 由来のFtsZおよび 大腸菌由来のMreBを標的とする低分子阻害剤の効果を半自動スクリーニングおよび定量するための標準的な96ウェルプレートを用いた体系的なワークフローを提案します。ここでは、FtsZとMreBをそれぞれ特異的に標的とする確立された阻害剤PC190723とA22を使用して、半自動ワークフローを設定し、最適化します。このワークフローでは、電動式高精度ステージを備えた落射蛍光顕微鏡と、標準的な96ウェルプレートでの自動画像取得を使用して、現在の標準化を改善しています。したがって、合成化学ライブラリーのミディアムスループットおよびハイスループットスクリーニングに適用でき、上記の課題のいくつかを回避できます。

プロトコル

1. S. pombeにおけるGFPタグ付き細菌細胞骨格タンパク質の発現

注:ここで使用したすべてのプラスミドおよび株に関する情報については、 表1 を参照してください。すべての培地組成については、 表2 を参照してください。

  1. N末端GFP融合体(GFP-MreB)を有する大腸菌MreBおよびC末端GFP(SaFtsZ-GFP)をS.pombe発現ベクターに運ぶ黄色ブドウ球菌FtsZ、中強度チアミン抑制性プロモーターを有するpREP42、nmt4118,19のクローニングを、前述の14,15と同様に行う。20,21に記載されているように、大腸菌株(DH10β)からプラスミドを維持、増幅、および単離します。
    注:DH5α、XL1Blue、TOP10などの他の 大腸菌 株、または分子クローニングに日常的に使用されている他の市販のコンピテントセルも使用できます。
  2. プラスミドpREP42-GFP-EcMreBおよびpREP42-SaFtsZ-GFPのS. pombeへの変換
    1. 以下の手順で述べるように、プラスミドpCCD3(pREP42-GFP-EcMreB)およびpCCD713(pREP42-SaFtsZ-GFP)を酢酸リチウム法22を用いてS.pombe株(h-leu1-32 ura4-D18)に変換する。
    2. 1日目 - 初代培養:縞模様の新鮮な S. pombe 培養液をループ状に、オートクレーブ滅菌した酵母エキスとサプリメント(YES)ブロス3mLに接種します。オービタルシェーカーで30°Cで一晩インキュベートします(O / N)。
    3. 2日目:
      1. 二次培養:約500 μLの一次培養物を30 mLのオートクレーブYESブロスに加えます。OD600 が0.4〜0.6に達するまで振とうしながら、30°Cで3〜4時間インキュベートします。
        注:各形質転換には、30 mLが使用されます。
      2. 30mLの培養液を2,500 x g で室温で6〜8分間ペレット化します。上清を捨て、50 mLの滅菌蒸留水(D / W)で細胞を洗浄します。再びペレットを下に置き、上清を捨てます。細胞を1 mLの滅菌D/Wに再懸濁し、2 mLの遠心チューブに移します。上記のように遠心分離し、上清を捨てます。
      3. 0.1 M酢酸リチウム1 mL、Tris-EDTA(LiAc-TE)溶液を加え、上記のように遠心分離します。上清を捨て、0.1 M LiAc-TE 1 mLに再懸濁します。上清を遠心分離して捨て、100 μLの溶液を残します。
      4. 10〜20μgのキャリアDNA(サーモン精子DNA、変性させて氷上で瞬間冷却)と、形質転換が必要なプラスミドDNAを2〜3μg加えます。やさしく混ぜます。室温で10分間インキュベートします。
      5. 260 μLの40%PEG/LiAc-TEを加えます。穏やかに混ぜます。シェーカーまたはサーモミキサーで30°Cで60分間インキュベートし、穏やかに混合します。43μLのDMSOを加えます。穏やかに混ぜます。
      6. サーモミキサーで42°Cで10分間のヒートショック。2,500 x g で6〜8分間ペレット化し、上清を捨てます。ペレットを1mLの滅菌D/Wで1回洗浄します。
      7. 5 μg/mL のチアミン ( nmt41 プロモーターを抑制するため) とアミノ酸サプリメントのアデニン (0.225 mg/mL)、ヒスチジン (0.225 mg/mL)、ヒスチジン (0.225 mg/mL)、ロイシン (0.225 mg/mL) を含むがウラシル (pREP42 プラスミドの選択マーカー) を欠いているエジンバラ最小培地 (EMM) プレート 100 μL に 100 μL の滅菌 D/W プレート 100 μL を再懸濁します。
        注:交互に、70μLと130μLを2つの異なるプレートでプレートします。2つの異なる容量(70 μLおよび130 μL)を播種して、実験ごとに異なる形質転換効率に応じて、少なくとも1つのプレート上に単離コロニーを取得します。
      8. プレートを30°Cで2〜3日間、コロニーが現れるまでインキュベートします。単一のコロニーを100μLの滅菌D / Wと混合し、上記のようにチアミンを含むがウラシルを含まない新しいEMMプレートに広げます。
      9. 完全な芝生が現れるまで、30°Cで2〜3日間インキュベートします。接種ループを使用して細胞の成長した芝生をスクラップし、クライオバイアルに30%グリセロールを含む1mLのYES培地に再懸濁します。
      10. クライオバイアルを液体窒素で急速凍結し、-80°Cで保存して、凍結酵母菌を保存します。
  3. 分裂酵母における細菌細胞骨格タンパク質の発現
    1. グリセロールストックから新鮮な酵母特異的プレートにパッチを無菌的に縞模様にして、さらなる実験に十分な培養物を得る。
      注:pREP42の場合、アデニン、ヒスチジン、ロイシンを含むEMM寒天プレート(最小培地)を使用しました( S.ポンベ 株(h-leu1-32 ura4-D18)を使用)ウラシルなし(選択マーカーとしてpREP42に存在するウラシル)。15〜20μMのチアミンを寒天プレートに添加し(pREP42にはチアミン抑制性 nmt41 プロモーターがあるため)、プレート上で増殖する際に目的遺伝子の発現を抑制します。
    2. 縞模様のパッチから少量のループ状の接種物をチアミンを欠く5 mLの酵母特異的EMM培地に接種し、30°Cで10〜12時間インキュベートします。
      注:S. pombeのnmt41プロモーターの下での異なる種からのFtsZおよびMreBの発現は、典型的には16〜30時間で変化し得る。S. pombeにおけるGFP-EcMreBおよびSaFtsZ-GFPのタンパク質発現の最適時間は、チアミンなしで、30°Cでそれぞれ20〜24時間および16〜20時間です。

2. GFPタグ付き細菌細胞骨格タンパク質を発現させた S. pombe 培養物の処理

注:多くの異なる薬物分子が、96ウェルプレートで一晩成長した酵母培養でテストされます。

  1. 半自動の96ウェルマルチチャンネルピペッティング装置を使用して、150 μLの新鮮酵母EMM培地を含む96ウェルプレートの各ウェルに50 μLの一晩培養物を移し、新鮮培養液を接種します。
  2. 半自動の96ウェルマルチチャンネルピペットを使用して適切な混合のためにピペッティングしながら、 図1の概略図に示すように、それぞれ3回に分けて、異なる濃度の薬物を増殖培養物にゆっくりと導入します。
  3. ポジティブコントロールとして、(黄色ブドウ球菌 FtsZ)とA22( 大腸菌 MreB)のPC190723、すでに知られている薬物を重複して使用します。
    注:以前に報告されたように、PC190723およびA22は、それぞれ56.2μM17および72.6μM14,17の濃度で使用された。一方、SaFtsZのA22処理とEcMreBのPC190723処理は、それぞれネガティブコントロールとして機能しました。
  4. DMSOは、薬物の最低濃度と最高濃度に応じて3つの異なる濃度で溶媒コントロールとして使用してください。
    注:薬剤が溶解する溶媒は、溶媒コントロールとして使用されます。
  5. コントロールおよび処理した培養物を30°Cで6〜10時間インキュベートし(細胞が細菌の蛍光タンパク質の発現を示すまで)、次いで落射蛍光顕微鏡を用いてイメージングする。

3. ポリマーの可視化

  1. 光学的に透明な底部の96ウェルプレート(蛍光イメージング用に黒壁)の各ウェルに1 mg/mLコンカナバリンAの20 μLのコーティングを塗布し、室温で20分間インキュベートします。液体を吸引し、10分間自然乾燥させます。
  2. 培養プレートから20μLの細胞をそれぞれのウェルに移し、10分間放置します。滅菌EMM培地で細胞を3x〜4x洗浄します。
  3. 対物レンズを所定の位置で使用すると(ステップ3.6を参照)、画像取得ソフトウェアの画像取得パネルでナビゲーターモードを使用して、96ウェルプレートの位置合わせとウェルカバレッジを実現します。ナビゲーターのウェルエッジを位置合わせします。
  4. 次に、ウェル内の関心領域のマルチポジション選択を含むウェルカバレッジパラメータを選択し、オンデマンドモードで適応型オートフォーカス制御を使用して、イメージング中にサンプルに焦点を合わせ続けます。
  5. 微分干渉コントラスト(DIC)と蛍光を使用して画像を取得します。励起フィルターをそれぞれ475/28 nmおよび525/48 nmに設定して、酵母で発現するGFPタグ付き細菌タンパク質をイメージングします。酵母細胞の厚さ(5μm)を通して0.2μmのステップサイズでZスタックを取得します。
  6. 100倍、1.4-NAの油浸対物レンズと2,000 x 2,000 sCMOSカメラ(6.5 μm x 6.5 μmピクセルサイズ)を備えた倒立落射蛍光顕微鏡を使用して画像をキャプチャします。蛍光色素の励起にはLED照明システムを使用してください。
    注:正確な多点位置決めを備えた96ウェルプレート用の電動ステージを備えた落射蛍光顕微鏡システムが適しています。実験変数を最小限に抑え、一貫性を維持するために、1 x 1のビニングと15%〜20%の照明で、同様の露光時間(通常は0.3〜0.5秒の範囲)で、対照および薬物処理のすべての細胞画像を取得します。

4. ImageJによる画像の定量化

  1. 細胞画像を処理し、FtsZ17の細胞あたりのスポット数と密度を測定します。MreBの場合、密度と異方性を測定し23 、フィジー(v2.0.0-rc-69 / 1.52p)24を使用して対照細胞と処理細胞を比較します。
  2. DIC チャンネルの画像を使用して、まずフリーハンド描画ツールを使用して個々の酵母細胞の輪郭を描き、ROI マネージャーに関心領域 (ROI) として保存します。このステップはまだ自動化されていませんが、機械学習を使用して最近開発されたツール25,26が近い将来に試みられ、組み込まれる可能性があります。
  3. セルの外側の領域をマスクし、27の説明に従って黒く塗りつぶします。
  4. フィジーの組み込み機能であるOPSしきい値IJ1分析マクロを使用して、スポット数をカウントします24。
  5. 自動しきい値処理には otsu メソッドを使用して、セグメント化されたパーティクルをマスクします。マクロを使用してプラグインの粒子解析を実行します。
  6. ポリマー密度(細胞内の単位面積当たりの細胞骨格の量)を測定するために、マスキングおよびスケルトン化ステップ27、28を含む、記載されたように画像を処理する。lpx プラグインで Lpx 2Dfilter を使用して、画像をスケルトン化します。
  7. 詳細については、この最近の出版物17を確認してください。23で前述したようにEcMreBポリマー定量を行い、異方性を利用して、前述した23のようにFibrilTool29を用いて空間構成を定量化する。
    注:これらの分析方法は、薬物によって処理された、または未処理の他の細菌細胞骨格タンパク質を定量化するために使用できます。

結果

薬物スクリーニング用の96ウェルプレートのセットアップ
中強度チアミン抑制性プロモーターnmt41を含有するベクター(pREP42)からC末端GFPタグ付き黄色ブドウ球菌FtsZを発現させるS.pombeの使用は以前に確立されており17、同様に、N末端GFPでタグ付けされた大腸菌MreBもS.pombeで発現していた14。また、SaFtsZの特異的...

ディスカッション

薬剤耐性(AMR)は世界的に深刻な健康上の脅威であり、新たな標的を持つ新たな抗菌薬が急務となっています。細菌の細胞骨格は、新しい抗生物質を開発するための魅力的な標的として浮上しており、TXA709などの細胞分裂タンパク質FtsZの低分子阻害剤はすでに第I相臨床試験中です30。FtsZ重合の阻害剤を同定するために、いくつかの方法が開発されている7...

開示事項

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

SMP、SR、AKSは、国立科学教育研究所の原子力部門から受けたフェローシップを認めています。RSは、原子力省からの学内資金援助を認めており、この研究は、バイオテクノロジー省(DBT)からRSへの研究助成金(BT/PR42977/MED/29/1603/2022)を通じて支援されています。著者らはまた、議定書の開発全体にわたる彼のコメント、提案、および議論に対してV Badireenath Konkimallaに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. BlackThermo Scientific™160376
96-well plateCorning  CLS3370
A22 HydrochlorideSigma SML0471Dissolved in DMSO
AdenineFormediumTMDOC0229225 mg/L of media 
Concanavalin A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)FormediumTMPMD0210See below for composition
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position sliderEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L of media 
Leica DMi8 inverted fluorescence microscopeLeica MicrosystemsGerman company
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L of media 
Lithium acetate Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)Sigma 202398
ThiamineSigmaT4625Filter sterilised
Tris-HydrochlorideMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) AgarFormediumTMPCM0410See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) BrothFormediumTMPCM0310See below for composition
Yeast (S. pombe) media 
Yeast extract + supplements (YES)
Compositiong/L
Yeast extract5
Dextrose30
Agar17
Adenine0.05
L-Histidine0.05
L-Leucine0.05
L-Lysine HCl0.05
Uracil0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
Compositiong/Lconcentration
potassium hydrogen phthallate 314.7mM
Na2HPO4 2.215.5 mM
NH4Cl 593.5 mM
glucose2% (w/v) or 20 g/L 111 mM
Salts (stock x 50)20 mL/L (v/v)
Vitamins (stock x 1000)1 mL/L (v/v)
Minerals (Stock x 10,000)0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) 52.50.26 M
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) 0.0007354.99 mM
50 g/l KCl (0.67 M) 500.67 M
2 g/l Na2SO4 (14.l mM)214.1 mM
Vitamins x 1000 1 g/l pantothenic acid 14.20 mM
10 g/l nicotinic acid 1081.2 mM
10 g/l inositol 1055.5 mM
10 mg/l biotin 0.0140.8 µM
Minerals x 10,000 boric acid580.9 mM
MnSO4  423.7 mM
ZnSO4.7H2O413.9 mM
FeCl2.6H2O  27.40 mM
molybdic acid 0.42.47 mM
KI 16.02 mM
CuSO4.5H2O 0.41.60 mM
citric acid 1047.6 mM
Strains/ Plasmids
StrainsDescriptionReference
CCD190Escherichia coli DH10β Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023

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