Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Özet

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Özet

FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinleri, hücre bölünmesi ve hücre şeklinin korunması gibi temel işlevleri yerine getirir. Ayrıca, FtsZ ve MreB, yeni antimikrobiyal keşifler için önemli hedefler olarak ortaya çıkmıştır. Bu hücre iskeleti proteinlerinin nükleotid bağlanmasını ve polimerizasyonunu hedefleyen bileşikleri tanımlamak için, esas olarak FtsZ'ye odaklanan çeşitli testler geliştirilmiştir. Dahası, tahlillerin çoğu ya zahmetli ya da maliyet yoğundur ve bu proteinlerin ilacın hücresel hedefi olup olmadığını belirlemek genellikle birden fazla yöntem gerektirir. Son olarak, ilaçların ökaryotik hücrelere toksisitesi de bir sorun teşkil etmektedir. Burada, bakteri hücre iskeletini hedef alan yeni molekülleri keşfetmek ve ökaryotik hücreler için potansiyel olarak toksik olabilecek isabetleri en aza indirmek için tek adımlı hücre bazlı bir tahlili açıklıyoruz. Fisyon mayası, mikroskopiye dayalı yüksek verimli ekranlara uygundur ve görsel bir ekran, FtsZ veya MreB'nin polimerizasyonunu değiştiren herhangi bir molekülü kolayca tanımlayabilir. Testimiz standart 96 oyuklu plakayı kullanır ve bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin fisyon mayası gibi ökaryotik bir hücrede polimerize olma yeteneğine dayanır. Burada tarif edilen protokoller fisyon mayası için olsa da ve Staphylococcus aureus'tan FtsZ ve Escherichia coli'den MreB'yi kullanırken, herhangi bir ökaryotik ekspresyon konakçısında polimerlere kolayca birleşen diğer bakteriyel hücre iskeleti proteinlerine kolayca uyarlanabilirler. Burada açıklanan yöntem, bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan yeni antimikrobiyallerin daha fazla keşfedilmesini kolaylaştırmaya yardımcı olacaktır.

Giriş

Bakteriyel enfeksiyonlarla mücadele etmek için şu anda kullanılan hemen hemen tüm antibiyotiklere karşı yaygın direnç, yeni antibiyotik kategorileri için acil bir gereklilik yaratmıştır. 2019 tarihli bir rapor, antibiyotiğe dirençli enfeksiyonların 1,27 milyon can kaybına yol açtığını ve dirençli bakteriyel enfeksiyonlardan kaynaklanan komplikasyonlar göz önüne alındığında toplam 4,95 milyon ölüme katkıda bulunduğunu belirtti¹. Klinik uygulamada hala etkili olsa da, mevcut antibiyotik cephaneliği ağırlıklı olarak hücre duvarı, DNA ve protein sentezine odaklanan dar bir hücresel süreç spektrumunu hedeflemektedir. Son yarım yüzyıl boyunca, 30'dan az protein, yeni anti-bakteriyellerin geliştirilmesi için hedef olarak ticari olarak kullanılmıştır ^2,3. Bu sınırlı uygulanabilir hedef yelpazesi, antibiyotiğe dirençli bakterilerle mücadele için yeni antibiyotiklerin veya türevlerinin keşfedilmesinde önemli ölçüde kısıtlamalar yaratır. Bu nedenle, ortaya çıkan antibiyotik direnci sorununun üstesinden gelmek için, yeni hedefleri ve etki mekanizmaları olan yeni antibiyotiklerin geliştirilmesine ihtiyaç vardır.

Bir antibakteriyel hedef ideal olarak bakteriyel hücre büyümesinin önemli bir bileşeni olmalı, filogenetik olarak çeşitli türler boyunca korunmalı, en az ökaryotik homoloji göstermeli ve antibiyotikler için erişilebilir olmalıdır⁴. Hücre bölünmesi ve hücre şeklinin korunmasında rol oynayan bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin keşfinden bu yana, antibakteriyel bileşiklerin geliştirilmesi için umut verici bir odak noktası olarak ortaya çıkmıştır⁵. Bu proteinler bakteri canlılığı için gereklidir ve ökaryotik hücrelerdeki hücre iskeletine benzer şekilde hücre şeklinin (MreB, CreS), bölünmenin (FtsZ, FtsA) ve DNA ayrışmasının (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA) korunmasında çok önemli bir rol oynar. Özellikle, FtsZ, çok çeşitli prokaryotik organizmalarda oldukça yüksek bir koruma seviyesi sergilerken, MreB neredeyse tüm çubuk şeklindeki bakterilerde bulunur. Hücre canlılığındaki bu kadar geniş dağılım ve alaka düzeyi, bu proteinleri antibiyotik araştırmalarında büyüleyici bir hedef haline getirmektedir ^5,6,7.

Potansiyel bir inhibitörün⁷ birincil hedefi olarak bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini kapsamlı bir şekilde doğrulamak için in vivo gözlemleri, in vitro etkileşimleri ve enzimatik deneyleri birleştiren çok yönlü bir yaklaşım benimsemek çok önemlidir. Zahmetli prosedürler veya önemli maliyet etkileri, bu amaç için mevcut birçok tahlili zorunlu kılar. Bunlar, bakteri hücre iskeletini etkileyebilecek kurşun bileşiklerinin taranmasında yaygın olarak kullanılmalarının önündeki dikkate değer engellerdir. Bunlar arasında mikroskopi, hücre morfolojisindeki değişiklikleri doğrudan inceleyerek bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için son derece verimli ve hızlı bir yöntem olarak öne çıkıyor. Yine de, hedef proteinin diğer hücre iskeleti kompleksleri ile hetero-ilişkisi, hedef dışı bağlanma ve zar potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanan dolaylı etkiler, hücreye verimli bir şekilde nüfuz etmedeki zorluk ve özellikle Gram-negatif bakterilerde akış pompalarının varlığı, bakteriyel hücre deformasyonunun kesin nedenini belirlemek için toplu olarak karmaşık hale getirir ^8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe veya yaygın olarak bilinen adıyla fisyon mayası, çubuk şeklinde tek hücreli ökaryotik bir organizmadır. Fisyon mayası, hücre döngüsü ve bölünmesi, hücresel organizasyon ve insanlar da dahil olmak üzere daha yüksek ökaryotlarla kromozom replikasyonu gibi hücresel süreçlerdeki olağanüstü koruma nedeniyle hücresel ve moleküler biyolojide model organizma olarak yaygın olarak kullanılmaktadır^11,12. Ayrıca, Errington ve meslektaşları, DivIVA'nın negatif kavisli yüzeylerde biriktiğini göstermek için fisyon mayasında kutup lokalize bir bakteriyel hücre iskeleti proteini DivIVA'yı ifade ettiler¹³. Yine Balasubramanian ve grubu, MreB¹⁴ ve tubulin homologu FtsZ¹⁵ gibi E. coli aktin hücre iskeleti proteininin mekanizması, montajı ve dinamiği hakkında yeni bilgiler getirmek için hücresel bir model sistem olarak fisyon mayasını ilk kez kurmuştu. Ayrıca, A22'nin, maya^14'te eksprese edildiğinde epifloresan mikroskobu yoluyla MreB'nin polimerizasyonunu verimli bir şekilde engelleme yeteneğini de gösterirler. Bunu takiben, diğer gruplar da kloroplast FtsZ1 ve FtsZ2 proteinlerinin¹⁶ montaj özelliklerini incelemek için fisyon mayasını başarıyla kullandılar. Daha yakın zamanlarda, bilinen üç FtsZ inhibitörünün-sanguinarin, berberin ve PC190723 FtsZ proteinlerinin etkisinin kapsamlı bir değerlendirmesini yaparak, bakteriyel hücre iskeleti inhibitörlerini spesifik olarak taramak için hücresel bir platform olarak fisyon mayasının kullanımının uygulanabilirliğine dair bir kavram kanıtı oluşturduk . Ek olarak, bu tek adımlı hücre bazlı tahlil, ökaryotik hücreler için potansiyel olarak toksik olabilecek bileşikleri tanımlama riskini en aza indirmede etkili olduğunu kanıtlamaktadır.

Bu raporda, fisyon mayası sistemini kullanarak, Staphylococcus aureus'tan FtsZ'yi ve Escherichia coli'den MreB'yi hedefleyen küçük molekül inhibitörlerinin etkisinin yarı otomatik taraması ve nicelleştirilmesi için standart 96 oyuklu plakayı kullanarak sistematik bir iş akışı öneriyoruz. Burada, özellikle FtsZ ve MreB'yi hedefleyen yerleşik inhibitörler PC190723 ve A22'yi kullanarak yarı otomatik iş akışını kuruyor ve optimize ediyoruz. Bu iş akışı, mevcut standardizasyonu iyileştirmek için motorlu yüksek hassasiyetli bir aşama ve standart 96 oyuklu bir plakada otomatik görüntü toplama ile donatılmış bir epifloresan mikroskobu kullanır. Bu nedenle, sentetik kimyasal kütüphanelerin orta ve yüksek verimli ekranlarına uygulanabilir ve yukarıda listelenen zorlukların bazılarını aşar.

Protokol

1. S. pombe'de GFP etiketli bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin ekspresyonu

NOT: Burada kullanılan tüm plazmitler ve suşlar hakkında bilgi için lütfen Tablo 1'e bakın. Tüm medya kompozisyonları için lütfen Tablo 2'ye bakın.

1. E. coli MreB'nin bir N-terminal GFP füzyonu (GFP-MreB) ile klonlamasını ve S. aureus FtsZ'nin bir C-terminal GFP'yi (SaFtsZ-GFP) S. pombe ekspresyon vektörüne, pREP42'ye orta kuvvette tiamin ile bastırılabilir bir promotör ile klonlamasını gerçekleştirin, nmt41^18,19 daha önce tarif edildiği gibi^14,15. Plazmitleri 20,21'de tarif edildiği gibi E. coli suşlarından (DH10β) koruyun, amplifiye edin ve izole edin.
   NOT: DH5α, XL1Blue, TOP10 vb. gibi diğer E. coli suşları veya moleküler klonlama için rutin olarak kullanılan ticari olarak temin edilebilen diğer yetkin hücreler de kullanılabilir.
2. Plazmitler pREP42-GFP-EcMreB ve pREP42-SaFtsZ-GFP'nin S. pombe'ye dönüşümü
   1. PCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) ve pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) plazmitlerini S. pombe suşuna (h-leu1-32 ura4-D18) lityum asetat yöntemini²² kullanarak dönüştürün, aşağıdaki adımlarda belirtildiği gibi.
   2. 1. Gün - Birincil kültür: 3 mL otoklavlanmış maya özü ve takviyeleri (YES) et suyunda bir döngü dolusu taze çizgili S. pombe kültürünü aşılayın. Gece boyunca 30 °C'de (O/N) bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
   3. 2. Gün:
      1. İkincil kültür: 30 mL otoklavlanmış YES suyuna yaklaşık 500 μL birincil kültür ekleyin. 30 ° C'de 3 - 4 saat boyunca OD₆₀₀ 0,4 - 0,6'ya ulaşana kadar çalkalayarak inkübe edin.
         NOT: Her dönüşüm için 30 mL kullanılır.
      2. 30 mL kültürü oda sıcaklığında 6-8 dakika boyunca 2.500 x g'da peletleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri 50 mL steril damıtılmış su (D / W) ile yıkayın. Tekrar pelet yapın ve süpernatanı atın. Hücreleri 1 mL steril D / W içinde yeniden süspanse edin ve 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Yukarıdaki gibi santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
      3. 1 mL 0.1 M lityum asetat, Tris-EDTA (LiAc-TE) çözeltisi ekleyin ve yukarıdaki gibi santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 1 mL 0.1 M LiAc-TE içinde yeniden süspanse edin. Süpernatanı santrifüjleyin ve atın, geride 100 μL çözelti bırakın.
      4. 10 - 20 μg taşıyıcı DNA (Somon sperm DNA'sı; denatüre ve buz üzerinde flaş soğutmalı) ve dönüştürülmesi gereken 2 - 3 μg plazmit DNA'sı ekleyin. Yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
      5. 260 μL %40 PEG/LiAc-TE ekleyin; Yavaşça karıştırın. Hafifçe karıştırarak çalkalayıcıda veya bir termomikserde 30 ° C'de 60 dakika inkübe edin. 43 μL DMSO ekleyin; Yavaşça karıştırın.
      6. Termomikserde 10 dakika boyunca 42 °C'de ısı şoku. 6-8 dakika boyunca 2.500 x g'da pelet ve süpernatanı atın. Peleti 1x 1 mL steril D/W ile yıkayın.
      7. Pelet, süpernatanı atın ve peleti 200 μL steril D / W. 5 μg / mL tiamin ( nmt41 promotörünü baskılamak için) ve amino asit takviyeleri adenin (0.225 mg / mL), histidin (0.225 mg / mL) ve lösin (0.225 mg / mL) içeren Edinburgh minimal orta (EMM) plakalarında 100 μL plaka, ancak urasil (pREP42 plazmidi için seçim işaretçisi) içermez.
         NOT: Alternatif olarak, 70 μL ve 130 μL'yi iki farklı plakada plakalayın. İki farklı hacim (70 μL ve 130 μL), deneyden deneye değişebilen dönüşüm verimlerine bağlı olarak plakalardan en az biri üzerinde izole koloniler elde etmek için kaplanır.
      8. Plakaları 30 ° C'de koloniler görünene kadar 2-3 gün inkübe edin. Tek bir koloniyi 100 μL steril D / W ile karıştırın ve yukarıda tarif edildiği gibi tiamin içeren ancak urasil içermeyen taze bir EMM plakasına yayın.
      9. Tam bir çim görünene kadar 30 ° C'de 2-3 gün inkübe edin. Büyüyen hücre çimlerini bir aşılama halkası kullanarak kazıyın ve bir kriyo-şişede% 30 gliserol içeren 1 mL YES ortamına yeniden süspanse edin.
      10. Kriyo-şişeyi sıvı nitrojen içinde dondurun ve donmuş maya stoklarını korumak için -80 ° C'de saklayın.
3. Fisyon mayasında bakteriyel hücre iskeleti proteinlerinin ekspresyonu
   1. Daha fazla deney için yeterli kültür elde etmek için gliserol stoğundan taze mayaya özgü bir plaka üzerine aseptik olarak bir yama çizin.
      NOT: pREP42 durumunda, adenin, histidin ve lösin içeren bir EMM agar plakası (minimal ortam) kullandık ( S. pombe suşu (h-leu1-32 ura4-D18)) urasil olmadan (urasil pREP42'de bir seçim belirteci olarak bulunur). Plaka üzerinde büyürken ilgilenilen genin ekspresyonunu baskılamak için agar plakalarına (pREP42 tiamin bastırılabilir nmt41 promotörüne sahip olduğundan) 15 - 20 μM tiamin ekleriz.
   2. Çizgili yamadan küçük bir halka dolusu aşılamayı tiamin içermeyen 5 mL mayaya özgü EMM ortamına aşılayın ve 30 ° C'de 10-12 saat inkübe edin.
      NOT: S. pombe'deki nmt41 promotörü altındaki farklı türlerden FtsZ ve MreB'nin ekspresyonu, tipik olarak 16 ila 30 saat arasında değişebilir. S. pombe'de GFP-EcMreB ve SaFtsZ-GFP'nin protein ekspresyonu için en uygun zaman, tiamin olmadan 30 ° C'de sırasıyla 20 - 24 saat ve 16 - 20 saattir.

2. GFP etiketli bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese eden S. pombe kültürlerinin tedavisi

NOT: Bir dizi farklı ilaç molekülü, 96 oyuklu bir plakada gece boyunca yetiştirilen maya kültürü üzerinde test edilir.

1. Yarı otomatik, 96 kuyulu çok kanallı pipetleme cihazını kullanarak 150 μL taze maya EMM ortamı içeren 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 μL gece boyunca kültür aktararak taze bir kültürü aşılayın.
2. Yarı otomatik, 96 oyuklu çok kanallı bir pipet kullanarak uygun karıştırma için içeri ve dışarı pipetleme yaparken, her biri Şekil 1'deki şemada gösterildiği gibi üç nüsha halinde yapılan farklı artan konsantrasyonlarda ilaçları büyüyen kültüre yavaşça ekleyin.
3. Pozitif bir kontrol olarak, (S. aureus FtsZ) ve A22 ( E. coli MreB için) için PC190723 bilinen ilaçları iki kez kullanın.
   NOT: Daha önce bildirildiği gibi, PC190723 ve A22 sırasıyla 56.2 μM¹⁷ ve 72.6 μM ^14,17 konsantrasyonda kullanılmıştır. Bu arada, SaFtsZ'nin A22 tedavisi ve EcMreB'nin PC190723 tedavisi sırasıyla negatif kontroller olarak görev yaptı.
4. DMSO'yu en düşük ve en yüksek ilaç konsantrasyonlarına göre üç farklı konsantrasyonda çözücü kontrolü olarak kullanın.
   NOT: İlaçların çözündürüldüğü çözücü, çözücü kontrolü olarak kullanılır.
5. Kontrol ve muamele edilmiş kültürleri 30 ° C'de 6-10 saat inkübe edin (hücreler bakteriyel floresan proteinlerinin ekspresyonunu gösterene kadar) ve ardından epifloresan mikroskobu kullanarak görüntüleyin.

3. Polimerlerin görselleştirilmesi

1. Optik olarak şeffaf alt 96 oyuklu plakanın (floresan görüntüleme için siyah duvarlı) her bir oyuğuna 20 μL 1 mg / mL concanavalin A kaplaması uygulayın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Sıvıyı aspire edin ve 10 dakika kurumaya bırakın.
2. Kültür plakasından 20 μL hücreyi her bir kuyucuğa aktarın ve 10 dakika bekletin. Hücreyi steril EMM ortamı ile 3x-4x yıkayın.
3. Kullanılacak objektif lens yerindeyken (bkz. adım 3.6), 96 oyuklu plaka hizalaması ve kuyu kapsama alanı için görüntü elde etme yazılımının alım panelindeki gezgin modunu kullanın. Navigatörün iyi kenarlarını hizalayın.
4. Ardından, kuyudaki ilgili bölgenin çok konumlu seçimini içeren kuyu kapsama parametrelerini seçin ve görüntüleme sırasında numuneyi odakta tutmak için isteğe bağlı modla uyarlanabilir otomatik odaklama kontrolünü kullanın.
5. Diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve floresan kullanarak görüntüler elde edin. Mayada eksprese edilen GFP etiketli bakteri proteinlerini görüntülemek için sırasıyla 475/28 nm ve 525/48 nm'lik uyarma ve emisyon filtrelerini ayarlayın. Maya hücrelerinin kalınlığı (5 μm) boyunca 0.2 μm'lik bir adım boyutunda Z-yığınları elde edin.
6. 100x, 1.4-NA yağa daldırma objektifi ve 2.000 x 2.000 sCMOS kamera (6,5 μm x 6,5 μm piksel boyutu) ile donatılmış ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu kullanarak görüntü yakalayın. Floroforun uyarılması için bir LED aydınlatma sistemi kullanın.
   NOT: Hassas çok noktalı konumlandırmaya sahip 96 oyuklu bir plaka için motorlu bir aşamaya sahip herhangi bir epifloresan mikroskop sistemi uygun olmalıdır. Deney değişkenlerini en aza indirmek ve tutarlılığı korumak için 1 x 1'lik bir gruplamada benzer bir maruz kalma süresinde (genellikle 0,3 - 0,5 s aralığında) ve %15 - 20'lik bir aydınlatmada kontrol ve ilaçla tedavi edilen tüm hücre görüntülerini elde edin.

4. ImageJ kullanılarak görüntülerin nicelleştirilmesi

1. Hücre görüntülerini işleyin ve FtsZ¹⁷ için hücre başına nokta sayısını ve yoğunluğu ölçün. MreB durumunda, yoğunluğu ve anizotropiyi²³ ölçün ve Fiji (v2.0.0-rc-69 / 1.52p)²⁴ kullanarak kontrol ve tedavi edilen hücreler arasında karşılaştırın.
2. DIC kanalındaki görüntüleri kullanarak, önce serbest çizim aracını kullanarak tek tek maya hücrelerini ana hatlarıyla belirtin ve ROI yöneticisinde bir ilgi alanı (ROI) olarak kaydedin. Bu adım henüz otomatikleştirilmemiştir, ancak makine öğrenimi^25,26 kullanılarak yakın zamanda geliştirilen araçlar yakın gelecekte denenebilir ve dahil edilebilir.
3. Hücrenin dış alanını maskeleyin ve^27'de anlatıldığı gibi siyah doldurun.
4. ^{Nokta sayısını 24} saymak için Fiji'de yerleşik bir özellik olan OPS eşiği IJ1 analiz makrosunu kullanın.
5. Otomatik eşikleme için otsu yöntemini kullanın ve segmentlere ayrılmış parçacıkları maskeleyin. Eklentiyi çalıştırın ve bir makro kullanarak parçacıkları analiz edin.
6. Polimer yoğunluğunu (bir hücredeki birim alan başına düşen hücre iskeleti miktarı) ölçmek için, maskeleme ve iskeletleştirme adımları^27,28 dahil olmak üzere görüntüleri açıklandığı gibi işleyin. Görüntüleri iskeletleştirmek için lpx eklentisinde Lpx 2Dfilter kullanın.
7. Ayrıntılar için, bu son yayına^{bakın 17}. Daha önce 23'te belirtildiği gibi EcMreB polimer miktar tayini gerçekleştirin^{, daha önce 23'te} açıklandığı gibi FibrilTool²⁹ kullanarak uzamsal organizasyonu ölçmek için anizotropi kullanın.
   NOT: Bu analiz yöntemleri, ilaçlar tarafından tedavi edilen veya tedavi edilmeyen diğer bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini ölçmek için kullanılabilir.

Sonuçlar

İlaçların taranması için 96 oyuklu plakanın kurulması
Orta kuvvetli tiamin bastırılabilir promotör nmt41içeren bir vektörden (pREP42) S. aureus FtsZ etiketli bir C-terminal GFP'yi ifade etmek için S. pombe'nin kullanımı daha önce kurulmuştur¹⁷ ve benzer şekilde, N-terminal GFP ile etiketlenmiş E. coli MreB de S. pombe^14'te ifade edilmiştir. Ayrıca, SaFtsZ'nin spesifik bir inhibitörü olan...

Tartışmalar

Antimikrobiyal direnç (AMR) ciddi bir küresel sağlık tehdididir ve yeni hedefleri olan yeni antibiyotiklere acil ihtiyaç vardır. Bakteri hücre iskeleti, halihazırda Faz-I klinik çalışmalarda³⁰ olan TXA709 gibi hücre bölünmesi proteini FtsZ'nin küçük moleküllü inhibitörleri ile yeni antibiyotikler geliştirmek için çekici bir hedef olarak ortaya çıkmıştır. FtsZ polimerizasyonunun inhibitörlerini tanımlamak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir^<...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023