La levadura de fisión como plataforma para el cribado de fármacos antibacterianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano

Resumen

La levadura de fisión se utiliza aquí como huésped heterólogo para expresar proteínas citoesqueléticas bacterianas como FtsZ y MreB como proteínas de fusión traduccional con GFP para visualizar su polimerización. Además, los compuestos que afectan a la polimerización se identifican mediante imágenes con un microscopio de fluorescencia.

Resumen

Las proteínas del citoesqueleto bacteriano, como FtsZ y MreB, realizan funciones esenciales como la división celular y el mantenimiento de la forma celular. Además, FtsZ y MreB se han convertido en objetivos importantes para el descubrimiento de nuevos antimicrobianos. Se han desarrollado varios ensayos para identificar compuestos dirigidos a la unión de nucleótidos y la polimerización de estas proteínas del citoesqueleto, centrándose principalmente en FtsZ. Además, muchos de los ensayos son laboriosos o costosos, y determinar si estas proteínas son el objetivo celular del fármaco a menudo requiere múltiples métodos. Por último, la toxicidad de los fármacos para las células eucariotas también plantea un problema. Aquí, describimos un ensayo basado en células de un solo paso para descubrir nuevas moléculas dirigidas al citoesqueleto bacteriano y minimizar los impactos que podrían ser potencialmente tóxicos para las células eucariotas. La levadura de fisión es susceptible a cribados de alto rendimiento basados en microscopía, y una criba visual puede identificar fácilmente cualquier molécula que altere la polimerización de FtsZ o MreB. Nuestro ensayo utiliza la placa estándar de 96 pocillos y se basa en la capacidad de las proteínas del citoesqueleto bacteriano para polimerizar en una célula eucariota como la levadura de fisión. Si bien los protocolos descritos aquí son para levaduras de fisión y utilizan FtsZ de Staphylococcus aureus y MreB de Escherichia coli, son fácilmente adaptables a otras proteínas del citoesqueleto bacteriano que se ensamblan fácilmente en polímeros en cualquier huésped de expresión eucariota. El método descrito aquí debería ayudar a facilitar el descubrimiento de nuevos antimicrobianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano.

Introducción

La resistencia generalizada a casi todos los antibióticos que se emplean actualmente para combatir las infecciones bacterianas ha creado una necesidad inmediata de nuevas categorías de antibióticos. Un informe de 2019 indicó que las infecciones resistentes a los antibióticos provocaron la pérdida de 1,27 millones de vidas, lo que contribuyó a un recuento total de 4,95 millones de muertes si se consideran las complicaciones de las infecciones bacterianas resistentes¹. Aunque sigue siendo eficaz en la práctica clínica, el arsenal actual de antibióticos se dirige principalmente a un espectro estrecho de procesos celulares, centrándose principalmente en la pared celular, el ADN y la síntesis de proteínas. En el último medio siglo, menos de 30 proteínas han sido explotadas comercialmente como dianas para el desarrollo de nuevos antibacterianos ^2,3. Esta gama limitada de objetivos viables crea limitaciones significativas para descubrir nuevos antibióticos o sus derivados para combatir las bacterias resistentes a los antibióticos. Por lo tanto, para superar el problema emergente de la resistencia a los antibióticos, es necesario desarrollar nuevos antibióticos con nuevas dianas y mecanismos de acción.

Idealmente, un objetivo antibacteriano debería ser un componente esencial del crecimiento de las células bacterianas, conservarse en todas las especies filogenéticamente diversas, mostrar la menor homología eucariota y ser accesible a los^{antibióticos.} Desde el descubrimiento de las proteínas del citoesqueleto bacteriano implicadas en la división celular y el mantenimiento de la forma celular, se han convertido en un prometedor punto focal para el^{desarrollo de compuestos} antibacterianos. Estas proteínas son esenciales para la viabilidad bacteriana y desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la forma celular (MreB, CreS), la división (FtsZ, FtsA) y la segregación del ADN (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), similar al citoesqueleto de las células eucariotas. En particular, FtsZ exhibe un nivel notablemente alto de conservación en una amplia gama de organismos procariotas, mientras que MreB se encuentra en casi todas las bacterias en forma de bastoncillo. Esta amplia distribución y relevancia en la viabilidad celular hacen de estas proteínas un objetivo fascinante en la investigación de antibióticos ^5,6,7.

Es crucial adoptar un enfoque múltiple que combine observaciones in vivo, interacciones in vitro y experimentos enzimáticos para validar exhaustivamente las proteínas del citoesqueleto bacteriano como el objetivo principal de un inhibidor potencial⁷. Los procedimientos laboriosos o las implicaciones de costos sustanciales obstaculizan muchos ensayos disponibles para este propósito. Estos son obstáculos notables para su utilización generalizada en el cribado de compuestos principales que podrían afectar al citoesqueleto bacteriano. Entre ellos, la microscopía destaca como un método excepcionalmente eficiente y rápido para evaluar la eficacia de los compuestos mediante el examen directo de los cambios en la morfología celular. Sin embargo, la heteroasociación de la proteína diana con otros complejos de citoesqueletos, los efectos indirectos debidos a la unión fuera del objetivo y los cambios en el potencial de membrana, la dificultad para penetrar en la célula de manera eficiente y la presencia de bombas de eflujo, especialmente en bacterias Gram-negativas, hacen que sea colectivamente complejo identificar la causa precisa de la deformación de las células bacterianas ^8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, o levadura de fisión como se le conoce comúnmente, es un organismo eucariota unicelular en forma de bastón. La levadura de fisión es ampliamente utilizada como organismo modelo en biología celular y molecular debido a la extraordinaria conservación en procesos celulares como el ciclo celular y la división, la organización celular y la replicación cromosómica con eucariotas superiores, incluyendo humanos^11,12. Además, Errington y sus colegas expresaron una proteína del citoesqueleto bacteriano DivIVA localizada en polos en levadura de fisión para demostrar que DivIVA se acumulaba^{en superficies} curvadas negativamente. Una vez más, Balasubramanian y su grupo habían establecido por primera vez la levadura de fisión como un sistema modelo celular para aportar nuevos conocimientos sobre el mecanismo, el ensamblaje y la dinámica de la proteína del citoesqueleto de actina de E. coli como MreB¹⁴ y el homólogo de tubulina FtsZ¹⁵. También demuestran la capacidad de A22 para impedir de manera eficiente la polimerización de MreB a través de la microscopía de epifluorescencia cuando se expresa en levadura¹⁴. A continuación, otros grupos también han empleado con éxito la levadura de fisión para estudiar las propiedades de ensamblaje de las proteínas FtsZ1 y FtsZ2 del cloroplasto¹⁶. Más recientemente, hemos establecido una prueba de concepto de la viabilidad del uso de la levadura de fisión como plataforma celular para detectar específicamente inhibidores del citoesqueleto bacteriano mediante la realización de una evaluación exhaustiva del impacto de tres inhibidores conocidos de FtsZ (sanguinarina, berberina y PC190723) en las proteínas FtsZ derivadas de dos bacterias patógenas, a saber, Staphylococcus aureus y Helicobacter pylori¹⁷. Además, este ensayo basado en células de un solo paso resulta fundamental para minimizar el riesgo de identificar compuestos que pueden ser potencialmente tóxicos para las células eucariotas.

En este informe, utilizando el sistema de levadura de fisión, proponemos un flujo de trabajo sistemático utilizando la placa estándar de 96 pocillos para el cribado semiautomatizado y la cuantificación del efecto de los inhibidores de moléculas pequeñas dirigidos a FtsZ de Staphylococcus aureus y MreB de Escherichia coli. Aquí, configuramos y optimizamos el flujo de trabajo semiautomatizado utilizando los inhibidores establecidos PC190723 y A22 que se dirigen específicamente a FtsZ y MreB, respectivamente. Este flujo de trabajo utiliza un microscopio de epifluorescencia equipado con una platina motorizada de alta precisión y adquisición automatizada de imágenes en una placa estándar de 96 pocillos para mejorar la estandarización actual. Por lo tanto, se puede aplicar a pantallas de rendimiento medio y alto de bibliotecas de productos químicos sintéticos y evita algunos de los desafíos enumerados anteriormente.

Protocolo

1. Expresión de proteínas del citoesqueleto bacteriano marcadas con GFP en S. pombe

NOTA: Consulte la Tabla 1 para obtener información sobre todos los plásmidos y cepas utilizados aquí. Consulte la Tabla 2 para ver todas las composiciones de medios.

1. Realizar la clonación de E. coli MreB con una fusión de GFP N-terminal (GFP-MreB) y FtsZ de S. aureus portadora de una GFP C-terminal (SaFtsZ-GFP) en el vector de expresión de S. pombe, pREP42 con un promotor represible de tiamina de potencia media, nmt41^18,19 como se describió anteriormente^14,15. Mantener, amplificar y aislar los plásmidos de las cepas de E. coli (DH10β) como se describe en^20,21.
   NOTA: También se pueden utilizar otras cepas de E. coli como DH5α, XL1Blue, TOP10, etcétera, u otras células competentes disponibles en el mercado que se utilizan habitualmente para la clonación molecular.
2. Transformación de los plásmidos pREP42-GFP-EcMreB y pREP42-SaFtsZ-GFP en S. pombe
   1. Transforme los plásmidos pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) y pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) en la cepa de S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) utilizando el método de acetato de litio²², como se menciona en los pasos a continuación.
   2. Día 1 - Cultivo primario: Inocular un bucle de cultivo de S. pombe recién veteado en 3 ml de extracto de levadura esterilizado en autoclave y caldo de suplementos (YES). Incubar en un agitador orbital a 30 °C durante la noche (O/N).
   3. Día 2:
      1. Cultivo secundario: Añadir unos 500 μL de cultivo primario a 30 mL de caldo YES esterilizado en autoclave. Incubar a 30 °C durante 3 - 4 h agitando hasta que el diámetro exterior de₆₀₀ alcance 0,4 - 0,6.
         NOTA: Para cada transformación, se utilizan 30 mL.
      2. Granular el cultivo de 30 mL a 2.500 x g durante 6-8 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y lave las células con 50 mL de agua destilada estéril (D/W). Vuelva a pellet y deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender las células en 1 mL de D/W estéril y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 2 mL. Centrifugar como se indicó anteriormente y desechar el sobrenadante.
      3. Agregue 1 mL de acetato de litio 0.1 M, solución de Tris-EDTA (LiAc-TE) y centrifugar como se indicó anteriormente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 mL de LiAc-TE 0,1 M. Centrifugar y desechar el sobrenadante, dejando 100 μL de solución.
      4. Agregue de 10 a 20 μg de ADN portador (ADN de esperma de salmón; desnaturalizado y enfriado rápidamente en hielo) y 2 a 3 μg del ADN plásmido, que necesita ser transformado. Mezclar suavemente. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
      5. Añadir 260 μL de 40 % de PEG/LiAc-TE; mezclar suavemente. Incubar durante 60 min en el agitador o en una termobatidora a 30 °C mezclando suavemente. Añadir 43 μL de DMSO; mezclar suavemente.
      6. Choque térmico a 42 °C durante 10 min en la termobatidora. Pellet a 2.500 x g durante 6-8 min y desechar el sobrenadante. Lave el pellet 1 vez con 1 mL de D/W estéril.
      7. Pellet, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de D/W. Placa estéril de 100 μL en placas de medio mínimo (EMM) de Edimburgo que contengan 5 μg/mL de tiamina (para reprimir el promotor nmt41 ) y suplementos de aminoácidos adenina (0,225 mg/mL), histidina (0,225 mg/mL) y leucina (0,225 mg/mL) pero que carezcan de uracilo (marcador de selección para el plásmido pREP42).
         NOTA: Alternativamente, coloque 70 μL y 130 μL en dos placas diferentes. Se siembran dos volúmenes diferentes (70 μL y 130 μL) para obtener colonias aisladas en al menos una de las placas en función de las eficiencias de transformación, que pueden variar de un experimento a otro.
      8. Incubar las placas a 30 °C durante 2-3 días hasta que aparezcan las colonias. Mezclar una sola colonia con 100 μL de D/W estéril y extenderla sobre una placa EMM fresca que contenga tiamina pero que carezca de uracilo como se ha descrito anteriormente.
      9. Incubar a 30 °C durante 2-3 días hasta que aparezca un césped completo. Deseche el césped crecido de células usando un asa de inoculación y vuelva a suspenderlo en 1 ml de medio YES que contenga 30% de glicerol en un criovial.
      10. Congele rápidamente el criovial en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 °C para preservar las existencias de levadura congeladas.
3. Expresión de proteínas del citoesqueleto bacteriano en levaduras de fisión
   1. Coloque asépticamente un parche de la reserva de glicerol en una placa específica de levadura fresca para obtener suficiente cultivo para experimentos posteriores.
      NOTA: En el caso de pREP42, utilizamos una placa de agar EMM (medio mínimo) que contenía adenina, histidina y leucina (como se utilizó la cepa de S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18)) sin uracilo (uracilo presente en pREP42 como marcador de selección). Añadimos 15 - 20 μM de tiamina a las placas de agar (ya que pREP42 tiene un promotor nmt41 represible de tiamina) para reprimir la expresión del gen de interés cuando crece en la placa.
   2. Inocular un pequeño bucle del inóculo del parche veteado en 5 mL de medio EMM específico de levadura que carezca de tiamina e incubarlo durante 10 - 12 h a 30 °C.
      NOTA: La expresión de FtsZ y MreB de diferentes especies bajo el promotor nmt41 en S. pombe puede variar, típicamente de 16 a 30 h. El tiempo óptimo para la expresión proteica de GFP-EcMreB y SaFtsZ-GFP en S. pombe es de 20 a 24 h y de 16 a 20 h a 30 °C, respectivamente, sin tiamina.

2. Tratamiento de cultivos de S. pombe que expresan proteínas citoesqueléticas bacterianas marcadas con GFP

NOTA: Se prueban varias moléculas de fármacos diferentes en el cultivo de levadura cultivado durante la noche en una placa de 96 pocillos.

1. Inocular un cultivo fresco transfiriendo 50 μL del cultivo durante la noche a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contiene 150 μL de medios EMM de levadura fresca utilizando el instrumento de pipeteo multicanal semiautomatizado de 96 pocillos.
2. Mientras pipetea hacia adentro y hacia afuera para una mezcla adecuada con una pipeta multicanal semiautomática de 96 pocillos, introduzca lentamente diferentes concentraciones crecientes de fármacos en el cultivo en crecimiento, cada una realizada por triplicado como se representa en el esquema de la Figura 1.
3. Como control positivo, utilice los fármacos ya conocidos, PC190723 para (S. aureus FtsZ) y A22 (para E. coli MreB) por duplicado.
   NOTA: Como se informó anteriormente, PC190723 y A22 se utilizaron a una concentración de 56,2 μM¹⁷ y 72,6 μM ^14,17, respectivamente. Mientras tanto, el tratamiento A22 de SaFtsZ y el tratamiento PC190723 de EcMreB sirvieron como controles negativos, respectivamente.
4. Utilice DMSO como control de solventes en tres concentraciones diferentes de acuerdo con las concentraciones más bajas y más altas de medicamentos.
   NOTA: El disolvente en el que se disuelven los fármacos se utiliza como control de disolventes.
5. Incubar los cultivos control y tratados a 30 °C durante 6-10 h (hasta que las células muestren la expresión de proteínas fluorescentes bacterianas) y luego obtener imágenes mediante microscopía de epifluorescencia.

3. Visualización de los polímeros

1. Aplique una capa de 20 μL de 1 mg/mL de concanavalina A a cada pocillo de la placa inferior ópticamente transparente de 96 pocillos (de paredes negras para imágenes de fluorescencia) e incube durante 20 min a temperatura ambiente. Aspira el líquido y déjalo secar al aire durante 10 min.
2. Transfiera 20 μL de células de la placa de cultivo a cada pocillo respectivo y déjelo reposar durante 10 minutos. Lave la célula 3x-4x con los medios EMM estériles.
3. Con la lente del objetivo que se va a utilizar en su lugar (consulte el paso 3.6), utilice el modo de navegador en el panel de adquisición del software de adquisición de imágenes para la alineación de placas de 96 pocillos y la cobertura de pocillos. Alinee los bordes del pozo en el navegador.
4. A continuación, seleccione los parámetros de cobertura del pozo, que incluyen una selección de varias posiciones de la región de interés en el pocillo, y utilice el control de enfoque automático adaptativo con modo bajo demanda para mantener la muestra enfocada durante la obtención de imágenes.
5. Adquiera imágenes utilizando contraste de interferencia diferencial (DIC) y fluorescencia. Ajuste filtros de excitación y emisión de 475/28 nm y 525/48 nm, respectivamente, para obtener imágenes de las proteínas bacterianas marcadas con GFP expresadas en la levadura. Obtenga pilas Z a un tamaño de paso de 0,2 μm a través del grosor de las células de levadura (5 μm).
6. Capture imágenes utilizando un microscopio de epifluorescencia invertida equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 100x 1.4-NA y una cámara sCMOS de 2.000 x 2.000 (tamaño de píxel de 6,5 μm x 6,5 μm). Utilice un sistema de iluminación LED para la excitación del fluoróforo.
   NOTA: Cualquier sistema de microscopio de epifluorescencia que tenga una platina motorizada para una placa de 96 pocillos con posicionamiento multipunto preciso debe ser adecuado. Adquiera todas las imágenes celulares de control y tratadas con fármaco con un tiempo de exposición similar (generalmente en el rango de 0,3 a 0,5 s) a un binning de 1 x 1 y una iluminación del 15% al 20% para minimizar las variables del experimento y mantener la consistencia.

4. Cuantificación de las imágenes mediante ImageJ

1. Procese imágenes de celdas y mida el número de puntos por celda y la densidad para FtsZ¹⁷. En el caso de MreB, medir la densidad y la anisotropía²³ y comparar entre las células control y las tratadas utilizando Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)²⁴.
2. Utilizando las imágenes del canal DIC, primero delinee las células de levadura individuales con la herramienta de dibujo a mano alzada y guárdelas como una región de interés (ROI) en el administrador de ROI. Este paso aún no está automatizado, pero las herramientas desarrolladas recientemente utilizando el aprendizaje automático^25,26 podrían intentarse e incorporarse en un futuro próximo.
3. Enmascare el área exterior de la celda y rellene de negro como se describe en²⁷.
4. Utilice la macro de análisis de umbral OPS IJ1, una función incorporada en Fiyi, para contar el número de puntos²⁴.
5. Utilice el método otsu para el umbral automático y enmascare las partículas segmentadas. Ejecute el complemento de análisis de partículas mediante una macro.
6. Para medir la densidad del polímero (cantidad de citoesqueleto por unidad de área en una célula), procese las imágenes como se describe, incluidos los pasos de enmascaramiento y esqueletización^27,28. Utilice Lpx 2Dfilter en el plug-in lpx para esqueletizar las imágenes.
7. Para más detalles, consulte esta reciente publicación¹⁷. Realice la cuantificación de polímeros EcMreB como se mencionó anteriormente en²³, use la anisotropía para cuantificar la organización espacial usando FibrilTool²⁹ como se describió anteriormente²³.
   NOTA: Estos métodos de análisis se pueden utilizar para cuantificar cualquier otra proteína del citoesqueleto bacteriano que esté tratada o no con los fármacos.

Resultados

Instalación de la placa de 96 pocillos para el cribado de fármacos
Se ha establecido previamente el uso de S. pombe para expresar una FtsZ de S. aureus marcada con GFP terminal C a partir de un vector (pREP42) que contiene el promotor represible de tiamina de potencia media nmt41¹⁷ y, de manera similar, la MreB de E. coli marcada con GFP N-terminal también se expresó en S. pombe¹⁴. También hemos demostrad...

Discusión

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una grave amenaza para la salud mundial, y existe una necesidad urgente de nuevos antibióticos con nuevos objetivos. El citoesqueleto bacteriano se ha convertido en una diana atractiva para el desarrollo de nuevos antibióticos, con inhibidores de moléculas pequeñas de la proteína de división celular FtsZ, como TXA709, que ya se encuentran en ensayos clínicos de fase^{I 30}. Se han desarrollado varios métodos para identificar inhibidores de la poli...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023