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요약

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

초록

FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질은 세포 분열 및 세포 형태 유지와 같은 필수 기능을 수행합니다. 또한 FtsZ와 MreB는 새로운 항균제 발견을 위한 중요한 표적으로 부상했습니다. 이러한 세포골격 단백질의 뉴클레오티드 결합 및 중합을 표적으로 하는 화합물을 식별하기 위해 여러 분석법이 개발되었으며, 주로 FtsZ에 초점을 맞추고 있습니다. 더욱이, 많은 분석법은 힘들거나 비용이 많이 들며, 이러한 단백질이 약물의 세포 표적인지 여부를 확인하려면 여러 가지 방법이 필요한 경우가 많습니다. 마지막으로, 진핵 세포에 대한 약물의 독성도 문제를 제기합니다. 여기에서는 박테리아 세포골격을 표적으로 하는 새로운 분자를 발견하고 진핵 세포에 잠재적으로 독성이 있을 수 있는 공격을 최소화하기 위한 단일 단계 세포 기반 분석에 대해 설명합니다. 핵분열 효모는 현미경을 기반으로 한 고처리량 스크리닝에 적합하며, 육안 스크리닝은 FtsZ 또는 MreB의 중합을 변경하는 모든 분자를 쉽게 식별할 수 있습니다. 당사의 분석은 표준 96웰 플레이트를 사용하며 분열 효모와 같은 진핵 세포에서 중합하는 박테리아 세포골격 단백질의 능력에 의존합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 핵분열 효모에 대한 것이며 황색포도상구균 의 FtsZ와 대장균의 MreB를 활용하지만, 모든 진핵생물 발현 호스트에서 고분자로 쉽게 조립되는 다른 박테리아 세포골격 단백질에 쉽게 적용할 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 새로운 항균제의 추가 발견을 촉진하는 데 도움이 될 것입니다.

서문

현재 세균 감염을 퇴치하기 위해 사용되는 거의 모든 항생제에 대한 광범위한 내성으로 인해 새로운 범주의 항생제가 즉시 필요하게 되었습니다. 2019년 보고서에 따르면 항생제 내성 감염으로 인해 127만 명이 목숨을 잃었으며, 내성 세균 감염으로 인한 합병증을 고려할 때 총 495만 명이 사망한 것으로 집계되었습니다1. 임상에서는 여전히 효과적이지만, 현재 사용되는 항생제는 주로 세포벽, DNA 및 단백질 합성에 초점을 맞춘 좁은 범위의 세포 과정을 표적으로 합니다. 지난 반세기 동안 새로운 항균제 2,3 개발의 대상으로 상업적으로 이용된 단백질은 30개 미만입니다. 이처럼 실행 가능한 표적의 범위가 제한되어 있기 때문에 항생제 내성 박테리아와 싸우기 위한 새로운 항생제 또는 그 유도체를 발견하는 데 상당한 제약이 있습니다. 따라서 새로운 항생제 내성 문제를 극복하기 위해서는 새로운 표적과 작용 기전을 가진 새로운 항생제의 개발이 필요합니다.

항균 표적은 이상적으로 박테리아 세포 성장의 필수 구성 요소여야 하고, 계통 발생학적으로 다양한 종 전체에 걸쳐 보존되어야 하며, 진핵생물 상동성이 가장 적어야 하고, 항생제에 접근할 수 있어야 한다4. 세포 분열 및 세포 형태 유지에 관여하는 세균성 세포골격 단백질의 발견 이후, 항균 화합물 개발을 위한 유망한 초점으로 부상했다5. 이 단백질은 박테리아의 생존력에 필수적이며 진핵 세포의 세포골격과 유사한 세포 모양(MreB, CreS), 분열(FtsZ, FtsA) 및 DNA 분리(ParM, TubZ, PhuZ, AlfA)를 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 특히, FtsZ는 광범위한 원핵 생물에서 매우 높은 수준의 보존을 보이는 반면, MreB는 거의 모든 막대 모양의 박테리아에서 발견됩니다. 세포 생존력에 대한 이러한 광범위한 분포와 관련성으로 인해 이러한 단백질은 항생제 연구에서 매력적인 표적이 됩니다 5,6,7.

in vivo 관찰, in vitro 상호작용 및 효소 실험을 결합한 다각적인 접근법을 채택하여 잠재적 억제제의 주요 표적인 박테리아 세포골격 단백질을 철저히 검증하는 것이 중요합니다7. 번거로운 절차나 상당한 비용 문제로 인해 이러한 목적을 위해 사용 가능한 많은 분석법이 어려움을 겪고 있습니다. 이는 박테리아 세포골격에 영향을 미칠 수 있는 납 화합물을 스크리닝하는 데 널리 사용되는 데 주목할 만한 장애물입니다. 이 중 현미경 검사는 세포 형태의 변화를 직접 검사하여 화합물의 효과를 평가하는 매우 효율적이고 신속한 방법으로 두드러집니다. 그러나 표적 단백질과 다른 세포골격 복합체의 이종 연관성, off-target 결합 및 막 전위의 변화로 인한 간접 효과, 세포에 효율적으로 침투하기 어려운 점, 특히 그람 음성 박테리아에서 유출 펌프의 존재로 인해 박테리아 세포 변형의 정확한 원인을 정확히 찾아내는 것이 총체적으로 복잡합니다 8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe 또는 일반적으로 알려진 핵분열 효모는 막대 모양의 단세포 진핵 생물입니다. 핵분열 효모는 세포주기 및 분열, 세포 조직 및 염색체 복제와 같은 세포 과정의 탁월한 보존으로 인해 세포 및 분자 생물학에서 모델 유기체로 널리 사용됩니다11,12. 더욱이, Errington과 동료들은 핵분열 효모에서 극 국소화된 박테리아 세포골격 단백질 DivIVA를 발현하여 DivIVA가 음의 곡면13에 축적되었음을 입증했다. 다시 말하지만, Balasubramanian과 그의 연구는 MreB14 및 tubulin homolog FtsZ15와 같은 E. coli actin cytoskeleton 단백질의 메커니즘, 조립 및 역학에 대한 새로운 통찰력을 제공하기 위해 세포 모델 시스템으로 핵분열 효모를 처음으로 확립했습니다. 또한 효모14에서 발현될 때 에피형광 현미경을 통해 MreB의 중합을 효율적으로 방해하는 A22의 능력을 보여줍니다. 그 후, 다른 그룹들도 엽록체 FtsZ1 및 FtsZ2 단백질의 조립 특성을 연구하기 위해 핵분열 효모를 성공적으로 사용하였다16. 보다 최근에는 황색포도상구균 및 헬리코박터 파일로리 17에서 유래한 알려진 세 가지 FtsZ 억제제(sanguinarine, berberine 및 PC190723-on FtsZ protein)의 영향에 대한 포괄적인 평가를 수행하여 박테리아 세포골격 억제제를 특이적으로 스크리닝하기 위한 세포 플랫폼으로서의 핵분열 효모 사용의 실행 가능성에 대한 개념 증명을 확립했습니다. 또한 이 단일 단계 세포 기반 분석은 진핵 세포에 잠재적으로 독성이 있을 수 있는 화합물을 식별하는 위험을 최소화하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 입증되었습니다.

이 보고서에서는 핵분열 효모 시스템을 활용하여 황색포도 상구균의 FtsZ와 대장균의 MreB를 표적으로 하는 저분자 억제제의 효과에 대한 반자동 스크리닝 및 정량화를 위해 표준 96웰 플레이트를 사용하는 체계적인 워크플로우를 제안합니다. 여기에서는 각각 FtsZ와 MreB를 특이적으로 표적으로 하는 확립된 억제제인 PC190723 및 A22를 사용하여 반자동 워크플로우를 설정하고 최적화합니다. 이 워크플로우는 전동식 고정밀 스테이지가 장착된 에피형광 현미경을 사용하고 표준 96웰 플레이트에서 자동 이미지 획득을 통해 현재의 표준화를 개선합니다. 따라서 합성 화학 라이브러리의 중간 및 고처리량 스크리닝에 적용할 수 있으며 위에 나열된 몇 가지 문제를 피할 수 있습니다.

프로토콜

1. S. pombe에서 GFP 표지된 세균 세포골격 단백질의 발현

NOTE: 여기에 사용된 모든 plasmids 및 strain에 대한 정보는 표 1 을 참조하십시오. 모든 미디어 구성에 대해서는 표 2 를 참조하십시오.

  1. N-말단 GFP 융합(GFP-MreB) 및 C-말단 GFP(SaFtsZ-GFP)를 운반하는 S. aureus FtsZ를 S. pombe 발현 벡터, pREP42에 앞서 설명한 바와 같이 중간 강도의 티아민-억제성 프로모터, nmt4118,19로 클로닝을 수행합니다14,15. 20,21에 설명된 대로 E. coli 균주(DH10β)에서 플라스미드를 유지, 증폭 및 분리합니다.
    참고: DH5α, XL1Blue, TOP10 등과 같은 다른 대장균 균주 또는 분자 클로닝에 일상적으로 사용되는 기타 상업적으로 이용 가능한 세포도 사용할 수 있습니다.
  2. 플라스미드 pREP42-GFP-EcMreB 및 pREP42-SaFtsZ-GFP를 S. pombe로 형질전환
    1. 아래 단계에서 언급한 바와 같이 리튬 아세테이트 방법22를 사용하여 플라스미드 pCCD3(pREP42-GFP-EcMreB) 및 pCCD713(pREP42-SaFtsZ-GFP)을 S. pombe 균주(h-leu1-32 ura4-D18)로 형질전환시킵니다.
    2. 1일차 - 1차 배양: 고압멸균 효모 추출물 및 보충제(YES) 육수 3mL에 갓 줄무늬가 있는 S. pombe 배양액을 한 루프 가득 접종합니다. 30°C의 오비탈 셰이커에서 하룻밤(O/N)으로 배양합니다.
    3. 2일차:
      1. 2차 배양: 약 500μL의 1차 배양액을 30mL의 오토클레이브 YES 육수에 추가합니다. 30 °C에서 3 - 4 시간 동안 OD600 이 0.4 - 0.6이 될 때까지 흔들어 배양합니다.
        참고: 각 변환에 대해 30mL가 사용됩니다.
      2. 30mL 배양액을 2,500 x g 에서 실온에서 6-8분 동안 펠렛합니다. 상층액을 버리고 50mL의 멸균 증류수(D/W)로 세포를 세척합니다. 다시 펠릿을 아래로 내리고 상층액을 버립니다. 1mL의 멸균 D/W에 세포를 재현탁시키고 2mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 위와 같이 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
      3. 위와 같이 0.1M 아세트산 리튬 1mL, Tris-EDTA(LiAc-TE) 용액을 넣고 원심분리합니다. 상층액을 버리고 0.1M LiAc-TE의 1mL에 재현탁합니다. 상층액을 원심분리하고 버리고 100μL의 용액을 남깁니다.
      4. 10 - 20 μg의 캐리어 DNA(연어 정자 DNA, 얼음에서 변성 및 급속 냉각)와 형질전환이 필요한 플라스미드 DNA 2 - 3 μg을 추가합니다. 부드럽게 섞는다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
      5. 260 μL의 40 % PEG / LiAc-TE를 첨가하십시오. 부드럽게 섞는다. 셰이커 또는 30°C의 열교환기에서 부드럽게 섞으면서 60분 동안 배양합니다. 43 μL의 DMSO를 추가하십시오. 부드럽게 섞는다.
      6. 열교환기에서 42°C에서 10분 동안 열 충격을 가합니다. 2,500 x g 에서 6-8분 동안 펠릿하고 상층액을 버립니다. 멸균 D/W 1mL로 펠릿을 1번 세척합니다.
      7. 펠렛, 상층액을 버리고 펠릿을 200 μL의 멸균 D/W. 플레이트 100 μL에 재현탁시킵니다. 5 μg/mL 티아민( nmt41 프로모터를 억제하기 위해) 및 아미노산 보충제 아데닌(0.225 mg/mL), 히스티딘(0.225 mg/mL) 및 류신(0.225 mg/mL)이 포함되어 있지만 우라실(pREP42 플라스미드에 대한 선택 마커)이 부족합니다.
        참고: 또는 두 개의 다른 플레이트에 70μL 및 130μL를 플레이트합니다. 두 개의 서로 다른 부피(70 μL 및 130 μL)를 도금하여 형질전환 효율에 따라 플레이트 중 하나 이상에서 분리된 콜로니를 얻을 수 있으며, 이는 실험마다 다를 수 있습니다.
      8. 콜로니가 나타날 때까지 30 °C에서 2-3 일 동안 플레이트를 배양합니다. 단일 콜로니를 100μL의 멸균 D/W와 혼합하고 위에서 설명한 대로 티아민이 포함되어 있지만 우라실이 없는 새 EMM 플레이트에 펴 바릅니다.
      9. 완전한 잔디가 나타날 때까지 30 °C에서 2-3 일 동안 배양하십시오. 접종 루프를 사용하여 자란 세포의 잔디를 긁어내고 크라이오 바이알에 30% 글리세롤을 함유한 1mL의 YES 배지에 재현탁시킵니다.
      10. cryo-vial을 액체 질소에 급속 냉동하고 -80°C에서 보관하여 냉동 효모 스톡을 보존합니다.
  3. 핵분열 효모에서 박테리아 세포골격 단백질의 발현
    1. 글리세롤 스톡의 패치를 새로운 효모 특정 플레이트에 무균 줄무늬로 줄무늬를 만들어 추가 실험을 위한 충분한 배양을 얻습니다.
      참고: pREP42의 경우, 우라실(pREP42에 선택 마커로 존재하는 우라실) 없이 아데닌, 히스티딘 및 류신( S. pombe 균주(h-leu1-32 ura4-D18) 사용)을 포함하는 EMM 한천 플레이트(최소 매체)를 사용했습니다. 우리는 한천 플레이트에 15 - 20 μM 티아민을 첨가합니다 (pREP42는 티아민 억제성 nmt41 프로모터를 가지고 있기 때문에). 플레이트에서 자랄 때 관심 유전자의 발현을 억제합니다.
    2. 줄무늬 패치에서 접종액의 작은 고리를 티아민이 부족한 5mL의 효모 특이적 EMM 배지에 접종하고 30 °C에서 10 - 12 시간 동안 배양합니다.
      참고: S. pombe의 nmt41 프로모터 하에서 다른 종에서 FtsZ 및 MreB의 발현은 일반적으로 16 내지 30 h까지 다양할 수 있습니다. S. pombe에서 GFP-EcMreB 및 SaFtsZ-GFP의 단백질 발현을 위한 최적의 시간은 티아민 없이 30 °C에서 각각 20 - 24 시간 및 16 - 20 시간입니다.

2. GFP 표지된 세균성 세포골격 단백질을 발현하는 S. pombe 배양물의 처리

참고: 다양한 약물 분자를 96웰 플레이트에서 하룻밤 동안 배양한 효모 배양액에서 테스트합니다.

  1. 반자동 96웰 멀티채널 피펫팅 기기를 사용하여 150μL의 신선한 효모 EMM 배지가 들어 있는 96웰 플레이트의 각 웰에 50μL의 야간 배양액을 옮겨 신선한 배양액을 접종합니다.
  2. 반자동 96웰 멀티채널 피펫을 사용하여 적절한 혼합을 위해 피펫팅을 하고 빼는 동안, 그림 1의 회로도에 표시된 것처럼 각각 세 번에 걸쳐 수행되는 다양한 농도의 약물을 증식 배양에 천천히 도입합니다.
  3. 양성 대조군으로, 이미 알려진 약물, PC190723 (S. aureus FtsZ) 및 A22 ( E. coli MreB)를 중복하여 사용하십시오.
    참고: 이전에 보고된 바와 같이, PC190723 및 A22는 각각 56.2 μM17 및 72.6 μM 14,17의 농도로 사용되었다. 한편, SaFtsZ의 A22 처리와 EcMreB의 PC190723 처리는 각각 음성 대조군으로 작용했다.
  4. 약물의 최저 농도와 최고 농도에 따라 세 가지 다른 농도에서 DMSO를 용매 제어로 사용하십시오.
    참고: 약물이 용해되는 용매는 용매 제어제로 사용됩니다.
  5. 대조군 및 처리된 배양액을 30°C에서 6-10시간 동안(세포가 박테리아 형광 단백질의 발현을 보일 때까지) 배양한 다음 형광 현미경을 사용하여 이미지를 생성합니다.

3. 폴리머의 시각화

  1. 광학적으로 투명한 바닥 96웰 플레이트(형광 이미징을 위한 검은색 벽)의 각 웰에 1mg/mL concanavalin A 20μL 코팅을 적용하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 액체를 흡입하고 10분 동안 자연 건조시킵니다.
  2. 배양 플레이트에서 20μL의 세포를 각 웰로 옮기고 10분 동안 그대로 둡니다. 멸균 EMM 배지로 세포를 3x-4x 세척합니다.
  3. 대물 렌즈를 장착한 상태에서(3.6단계 참조) 이미지 획득 소프트웨어의 획득 패널에서 네비게이터 모드를 사용하여 96-well plate alignment 및 well coverage를 확인하십시오. 네비게이터에서 가장자리를 잘 맞춥니다.
  4. 다음으로, 웰에서 관심 영역의 다중 위치 선택을 포함하는 웰 커버리지 매개변수를 선택하고 온디맨드 모드와 함께 적응형 자동 초점 제어를 사용하여 이미징 중에 샘플의 초점을 유지합니다.
  5. 미분 간섭 대비(DIC) 및 형광을 사용하여 이미지를 획득합니다. excitation 및 emission filter를 각각 475/28 nm 및 525/48 nm로 설정하여 효모에서 발현되는 GFP 태그 박테리아 단백질을 이미징합니다. 효모 세포의 두께(5μm)를 통해 0.2μm의 단계 크기에서 Z-stack을 얻습니다.
  6. 100x, 1.4-NA 오일 이멀젼 대물렌즈와 2,000 x 2,000 sCMOS 카메라(6.5 μm x 6.5 μm 픽셀 크기)가 장착된 도립 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 형광단의 여기를 위해 LED 조명 시스템을 사용하십시오.
    참고: 정밀한 다지점 포지셔닝이 있는 96웰 플레이트용 전동 스테이지가 있는 모든 형광 현미경 시스템이 적합해야 합니다. 실험 변수를 최소화하고 일관성을 유지하기 위해 1 x 1의 비닝(binning) 및 15% - 20%의 조명에서 유사한 노출 시간(일반적으로 0.3 - 0.5초 범위)으로 대조군 및 약물 처리된 모든 세포 이미지를 획득합니다.

4. ImageJ를 사용한 이미지 정량화

  1. 세포 영상을 처리하고 FtsZ17에 대한 세포당 반점 수와 밀도를 측정합니다. MreB의 경우 밀도와 이방성23 을 측정하고 Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24를 사용하여 대조 세포와 처리된 세포를 비교합니다.
  2. DIC 채널의 이미지를 사용하여 먼저 자유형 그리기 도구를 사용하여 개별 효모 세포의 윤곽을 그리고 ROI 관리자에 관심 영역(ROI)으로 저장합니다. 이 단계는 아직 자동화되지 않았지만 기계 학습25,26을 사용하여 최근에 개발 된 도구가 가까운 장래에 시도되고 통합 될 수 있습니다.
  3. 셀의 외부 영역을 마스킹하고27에 설명된 대로 검은색으로 채웁니다.
  4. 피지의 내장 기능인 OPS 임계값 IJ1 분석 매크로를 사용하여스폿 수 24를 계산합니다.
  5. 자동 임계값을 지정하고 분할된 입자를 마스킹하기 위해 otsu 방법을 사용합니다. 매크로를 사용하여 플러그인 analyse particles를 실행합니다.
  6. 폴리머 밀도(세포의 단위 면적당 세포골격의 양)를 측정하기 위해, 마스킹 및 골격화 단계27,28을 포함하여 설명된 대로 이미지를 처리합니다. lpx 플러그인에서 Lpx 2Dfilter를 사용하여 이미지를 스켈레톤화합니다.
  7. 자세한 내용은 최근 간행물17을 확인하십시오. 23에서 앞서 언급한 대로 EcMreB 폴리머 정량화를 수행하고, 이전에23에서 설명한 대로 FibrilTool29를 사용하여 공간 조직을 정량화하기 위해 이방성을 사용합니다.
    참고: 이러한 분석 방법은 약물에 의해 처리되거나 처리되지 않은 다른 박테리아 세포골격 단백질을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

결과

약물 스크리닝을 위한 96웰 플레이트 설정
중-강도 티아민 억제성 프로모터 nmt41을 함유하는 벡터(pREP42)로부터 C-말단 GFP 표지된 S. aureus FtsZ를 발현하기 위한 S. pombe의 사용은 사전에 확립된17 및 유사하게, N-말단 GFP로 표지된 E. coli MreB도 S. pombe14에서 발현되었다. 우리는 또한 SaFtsZ의 특정 억제제인 PC190723와 MreB 억?...

토론

항생제 내성(AMR)은 전 세계적으로 심각한 건강 위협이며, 새로운 표적을 가진 새로운 항생제가 시급히 필요합니다. 박테리아 세포골격은 TXA709와 같은 세포 분열 단백질 FtsZ의 저분자 억제제와 함께 새로운 항생제 개발을 위한 매력적인 대상으로 부상했으며, 이미 1상 임상시험에서30. FtsZ중합 7,31의 억제제를 확인하기 위해 여러 가지 ?...

공개

모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

SMP, SR 및 AKS는 원자력학과 국립 과학 교육 및 연구 연구소(National Institute of Science Education and Research)에서 받은 펠로우십을 인정합니다. RS는 원자력부(Department of Atomic Energy)의 교내 자금 지원을 인정하며, 이 작업은 생명공학부(DBT)에서 RS(BT/PR42977/MED/29/1603/2022)에 대한 연구 보조금을 통해 지원됩니다. 저자들은 또한 프로토콜 개발 전반에 걸쳐 V Badireenath Konkimalla의 의견, 제안 및 토론에 대해 감사를 표합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. BlackThermo Scientific™160376
96-well plateCorning  CLS3370
A22 HydrochlorideSigma SML0471Dissolved in DMSO
AdenineFormediumTMDOC0229225 mg/L of media 
Concanavalin A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)FormediumTMPMD0210See below for composition
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position sliderEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L of media 
Leica DMi8 inverted fluorescence microscopeLeica MicrosystemsGerman company
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L of media 
Lithium acetate Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)Sigma 202398
ThiamineSigmaT4625Filter sterilised
Tris-HydrochlorideMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) AgarFormediumTMPCM0410See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) BrothFormediumTMPCM0310See below for composition
Yeast (S. pombe) media 
Yeast extract + supplements (YES)
Compositiong/L
Yeast extract5
Dextrose30
Agar17
Adenine0.05
L-Histidine0.05
L-Leucine0.05
L-Lysine HCl0.05
Uracil0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
Compositiong/Lconcentration
potassium hydrogen phthallate 314.7mM
Na2HPO4 2.215.5 mM
NH4Cl 593.5 mM
glucose2% (w/v) or 20 g/L 111 mM
Salts (stock x 50)20 mL/L (v/v)
Vitamins (stock x 1000)1 mL/L (v/v)
Minerals (Stock x 10,000)0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) 52.50.26 M
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) 0.0007354.99 mM
50 g/l KCl (0.67 M) 500.67 M
2 g/l Na2SO4 (14.l mM)214.1 mM
Vitamins x 1000 1 g/l pantothenic acid 14.20 mM
10 g/l nicotinic acid 1081.2 mM
10 g/l inositol 1055.5 mM
10 mg/l biotin 0.0140.8 µM
Minerals x 10,000 boric acid580.9 mM
MnSO4  423.7 mM
ZnSO4.7H2O413.9 mM
FeCl2.6H2O  27.40 mM
molybdic acid 0.42.47 mM
KI 16.02 mM
CuSO4.5H2O 0.41.60 mM
citric acid 1047.6 mM
Strains/ Plasmids
StrainsDescriptionReference
CCD190Escherichia coli DH10β Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023

참고문헌

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  2. Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
  3. Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
  4. Sanchez, S., Demain, A. L. . Antibiotics: current innovations and future trends. , (2015).
  5. Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
  6. Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
  7. Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
  8. Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
  9. Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69 (2020).
  10. Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
  11. Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
  12. Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151 (2021).
  13. Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
  14. Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
  15. Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
  16. TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
  17. Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16 (2023).
  18. Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
  19. Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  22. Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  23. Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092 (2022).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26 (2022).
  26. Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
  27. Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
  28. Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
  29. Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
  30. Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
  31. Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825 (2022).
  32. Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754 (2020).
  33. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  34. Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364 (2010).
  35. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  36. Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
  37. Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804 (2022).

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