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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Abstract

Le proteine del citoscheletro batterico come FtsZ e MreB svolgono funzioni essenziali come la divisione cellulare e il mantenimento della forma cellulare. Inoltre, FtsZ e MreB sono emersi come obiettivi importanti per la scoperta di nuovi antimicrobici. Sono stati sviluppati diversi saggi per identificare composti che hanno come bersaglio il legame nucleotidico e la polimerizzazione di queste proteine del citoscheletro, principalmente focalizzati su FtsZ. Inoltre, molti dei test sono laboriosi o costosi e l'accertamento di queste proteine come bersaglio cellulare del farmaco richiede spesso più metodi. Infine, anche la tossicità dei farmaci per le cellule eucariotiche pone un problema. Qui, descriviamo un saggio basato su cellule in un'unica fase per scoprire nuove molecole che prendono di mira il citoscheletro batterico e ridurre al minimo i colpi che potrebbero essere potenzialmente tossici per le cellule eucariotiche. Il lievito di fissione è suscettibile di screening ad alto rendimento basati sulla microscopia e uno screening visivo può facilmente identificare qualsiasi molecola che altera la polimerizzazione di FtsZ o MreB. Il nostro test utilizza la piastra standard a 96 pozzetti e si basa sulla capacità delle proteine del citoscheletro batterico di polimerizzare in una cellula eucariotica come il lievito di fissione. Sebbene i protocolli qui descritti siano per il lievito di fissione e utilizzino FtsZ da Staphylococcus aureus e MreB da Escherichia coli, sono facilmente adattabili ad altre proteine citoscheletriche batteriche che si assemblano facilmente in polimeri in qualsiasi ospite di espressione eucariotica. Il metodo qui descritto dovrebbe aiutare a facilitare l'ulteriore scoperta di nuovi antimicrobici che prendono di mira le proteine del citoscheletro batterico.

Introduzione

La diffusa resistenza a quasi tutti gli antibiotici attualmente impiegati per combattere le infezioni batteriche ha creato un'immediata necessità di nuove categorie di antibiotici. Un rapporto del 2019 ha indicato che le infezioni resistenti agli antibiotici hanno provocato la perdita di 1,27 milioni di vite, contribuendo a un conteggio complessivo di 4,95 milioni di decessi se si considerano le complicanze delle infezioni batteriche resistenti1. Sebbene sia ancora efficace nella pratica clinica, l'attuale arsenale di antibiotici si rivolge prevalentemente a uno spettro ristretto di processi cellulari, concentrandosi principalmente sulla parete cellulare, sul DNA e sulla sintesi proteica. Nell'ultimo mezzo secolo, meno di 30 proteine sono state sfruttate commercialmente come bersagli per lo sviluppo di nuovi antibatterici 2,3. Questa gamma limitata di bersagli praticabili crea in modo significativo vincoli alla scoperta di nuovi antibiotici o dei loro derivati per combattere i batteri resistenti agli antibiotici. Pertanto, per superare il problema emergente della resistenza agli antibiotici, è necessario lo sviluppo di nuovi antibiotici con nuovi bersagli e meccanismi d'azione.

Un bersaglio antibatterico dovrebbe idealmente essere una componente essenziale della crescita delle cellule batteriche, essere conservato in tutte le specie filogeneticamente diverse, mostrare meno omologia eucariotica ed essere accessibile agli antibiotici4. Dalla scoperta delle proteine del citoscheletro batterico coinvolte nella divisione cellulare e nel mantenimento della forma cellulare, sono emerse come un promettente punto focale per lo sviluppo di composti antibatterici5. Queste proteine sono essenziali per la vitalità batterica e svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della forma cellulare (MreB, CreS), della divisione (FtsZ, FtsA) e della segregazione del DNA (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), simili al citoscheletro nelle cellule eucariotiche. In particolare, FtsZ mostra un livello notevolmente elevato di conservazione in un'ampia gamma di organismi procarioti, mentre MreB si trova in quasi tutti i batteri a forma di bastoncello. Una distribuzione così ampia e rilevante nella vitalità cellulare rendono queste proteine un bersaglio affascinante nella ricerca sugli antibiotici 5,6,7.

È fondamentale adottare un approccio su più fronti che combini osservazioni in vivo, interazioni in vitro ed esperimenti enzimatici per convalidare a fondo le proteine del citoscheletro batterico come bersaglio primario di un potenziale inibitore7. Procedure laboriose o sostanziali implicazioni di costo gravano su molti test disponibili per questo scopo. Questi sono notevoli ostacoli al loro utilizzo diffuso nello screening di composti guida che potrebbero avere un impatto sul citoscheletro batterico. Tra questi, la microscopia si distingue come un metodo eccezionalmente efficiente e rapido per valutare l'efficacia dei composti esaminando direttamente i cambiamenti nella morfologia cellulare. Tuttavia, l'etero-associazione della proteina bersaglio con altri complessi del citoscheletro, gli effetti indiretti dovuti al legame off-target e ai cambiamenti nel potenziale di membrana, la difficoltà a penetrare efficacemente nella cellula e la presenza di pompe di efflusso, specialmente nei batteri Gram-negativi, rendono collettivamente complesso individuare la causa precisa della deformazione della cellula batterica 8,9,10.

Lo Schizosaccharomyces pombe, o lievito di fissione come è comunemente noto, è un organismo eucariotico unicellulare a forma di bastoncello. Il lievito di fissione è ampiamente utilizzato come organismo modello in biologia cellulare e molecolare a causa della straordinaria conservazione nei processi cellulari come il ciclo e la divisione cellulare, l'organizzazione cellulare e la replicazione cromosomica con eucarioti superiori, compresi gli esseri umani11,12. Inoltre, Errington e colleghi hanno espresso una proteina citoscheletrica batterica localizzata ai poli DivIVA nel lievito di fissione per dimostrare che DivIVA si accumulava su superfici curve negativamente13. Ancora una volta, Balasubramanian e il gruppo avevano stabilito per la prima volta il lievito di fissione come sistema modello cellulare per portare nuove intuizioni sul meccanismo, l'assemblaggio e la dinamicità della proteina del citoscheletro di actina di E. coli come MreB14 e l'omologo della tubulina FtsZ15. Dimostrano anche la capacità di A22 di impedire efficacemente la polimerizzazione di MreB attraverso la microscopia a epifluorescenza quando espresso nel lievito14. In seguito, anche altri gruppi hanno impiegato con successo il lievito di fissione per studiare le proprietà di assemblaggio delle proteine FtsZ1 e FtsZ2 dei cloroplasti16. Più recentemente, abbiamo stabilito una prova di concetto della fattibilità dell'uso del lievito di fissione come piattaforma cellulare per lo screening specifico degli inibitori del citoscheletro batterico conducendo una valutazione completa dell'impatto di tre noti inibitori di FtsZ: sanguinarina, berberina e PC190723-on proteine FtsZ derivate da due batteri patogeni, vale a dire Staphylococcus aureus e Helicobacter pylori17. Inoltre, questo test basato su cellule in un'unica fase si rivela fondamentale per ridurre al minimo il rischio di identificare composti che potrebbero essere potenzialmente tossici per le cellule eucariotiche.

In questo rapporto, utilizzando il sistema del lievito di fissione, proponiamo un flusso di lavoro sistematico utilizzando la piastra standard a 96 pozzetti per lo screening semiautomatico e la quantificazione dell'effetto di inibitori di piccole molecole che prendono di mira FtsZ da Staphylococcus aureus e MreB da Escherichia coli. Qui, abbiamo impostato e ottimizzato il flusso di lavoro semi-automatizzato utilizzando gli inibitori consolidati PC190723 e A22 che mirano specificamente rispettivamente a FtsZ e MreB. Questo flusso di lavoro utilizza un microscopio a epifluorescenza dotato di un tavolino motorizzato ad alta precisione e l'acquisizione automatizzata delle immagini in una piastra standard a 96 pozzetti per migliorare l'attuale standardizzazione. Pertanto, può essere applicato a schermi a medio e alto rendimento di librerie chimiche sintetiche e aggira alcune delle sfide sopra elencate.

Protocollo

1. Espressione di proteine del citoscheletro batterico marcate con GFP in S. pombe

NOTA: Si prega di consultare la Tabella 1 per informazioni su tutti i plasmidi e i ceppi utilizzati qui. Si prega di consultare la Tabella 2 per tutte le composizioni multimediali.

  1. Eseguire il clonaggio di MreB di E. coli con una fusione GFP N-terminale (GFP-MreB) e FtsZ di S. aureus che trasporta una GFP C-terminale (SaFtsZ-GFP) nel vettore di espressione di S. pombe, pREP42 con un promotore repressibile di tiamina di media potenza, nmt4118,19 come descritto in precedenza14,15. Mantenere, amplificare e isolare i plasmidi dai ceppi di E. coli (DH10β) come descritto in20,21.
    NOTA: Possono essere utilizzati anche altri ceppi di E. coli come DH5α, XL1Blue, TOP10, ecc. o altre cellule competenti disponibili in commercio utilizzate abitualmente per la clonazione molecolare.
  2. Trasformazione dei plasmidi pREP42-GFP-EcMreB e pREP42-SaFtsZ-GFP in S. pombe
    1. Trasformare i plasmidi pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) e pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) nel ceppo di S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) utilizzando il metodo22 dell'acetato di litio, come indicato nei passaggi seguenti.
    2. Giorno 1 - Coltura primaria: inoculare un anello di coltura di S. pombe appena striato in 3 ml di estratto di lievito autoclavato e integratori (YES) brodo. Incubarlo in un agitatore orbitale a 30 °C per una notte (O/N).
    3. Giorno 2:
      1. Coltura secondaria: aggiungere circa 500 μL di coltura primaria a 30 ml di brodo YES autoclavato. Incubare a 30 °C per 3 - 4 ore agitando fino a quando l'OD600 raggiunge 0,4 - 0,6.
        NOTA: Per ogni trasformazione vengono utilizzati 30 ml.
      2. Pellettare la coltura da 30 ml a 2.500 x g per 6-8 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante e lavare le cellule con 50 ml di acqua distillata sterile (D/W). Pellettare di nuovo e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di D/W sterile e trasferirle in una provetta da centrifuga da 2 mL. Centrifugare come sopra e scartare il surnatante.
      3. Aggiungere 1 mL di acetato di litio 0,1 M, soluzione di Tris-EDTA (LiAc-TE) e centrifugare come sopra. Eliminare il surnatante e risospendere in 1 mL di LiAc-TE 0,1 M. Centrifugare e scartare il surnatante, lasciando 100 μL di soluzione.
      4. Aggiungere 10 - 20 μg di DNA vettore (DNA spermatico di salmone; denaturato e raffreddato a flash su ghiaccio) e 2 - 3 μg di DNA plasmidico, che deve essere trasformato. Mescolare delicatamente. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
      5. Aggiungere 260 μl di PEG/LiAc-TE al 40 %; mescolare delicatamente. Incubare per 60 minuti nell'agitatore o in un termomiscelatore a 30 °C mescolando delicatamente. Aggiungere 43 μL di DMSO; mescolare delicatamente.
      6. Shock termico a 42 °C per 10 min nel termomiscelatore. Pellettare a 2.500 x g per 6-8 min e scartare il surnatante. Lavare il pellet 1 volta con 1 mL di D/W sterile.
      7. Pellettare, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 μL di D/W. Piastra sterile 100 μL su piastre Edinburgh minimal medium (EMM) contenenti 5 μg/mL di tiamina (per reprimere il promotore nmt41 ) e integratori di aminoacidi adenina (0,225 mg/mL), istidina (0,225 mg/mL) e leucina (0,225 mg/mL) ma privi di uracile (marcatore di selezione per il plasmide pREP42).
        NOTA: In alternativa, piastra da 70 μl e 130 μl in due piastre diverse. Due diversi volumi (70 μL e 130 μL) vengono piastrati per ottenere colonie isolate su almeno una delle piastre a seconda delle efficienze di trasformazione, che possono variare da esperimento a esperimento.
      8. Incubare le piastre a 30 °C per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie. Miscelare una singola colonia con 100 μL di D/W sterile e stenderla su una piastra EMM fresca contenente tiamina ma priva di uracile come descritto sopra.
      9. Incubare a 30 °C per 2-3 giorni fino a quando non appare un prato completo. Raschiare il prato coltivato di cellule utilizzando un anello di inoculazione e risospenderlo in 1 ml di terreno YES contenente il 30% di glicerolo in una fiala criogenica.
      10. Congelare rapidamente la crio-fiala in azoto liquido e conservarla a -80 °C per conservare le scorte di lievito congelate.
  3. Espressione di proteine del citoscheletro batterico nel lievito di fissione
    1. Striare asetticamente un cerotto dal brodo di glicerolo su una piastra fresca specifica per il lievito per ottenere una coltura sufficiente per ulteriori esperimenti.
      NOTA: Nel caso di pREP42, abbiamo utilizzato una piastra di agar EMM (terreno minimo) contenente adenina, istidina e leucina (come utilizzando il ceppo di S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18)) senza uracile (uracile presente in pREP42 come marcatore di selezione). Aggiungiamo 15 - 20 μM di tiamina alle piastre di agar (poiché pREP42 ha un promotore nmt41 repressibile di tiamina) per reprimere l'espressione del gene di interesse durante la crescita sulla piastra.
    2. Inoculare una piccola ansa dell'inoculo dal cerotto striato in 5 mL di terreno EMM specifico per il lievito privo di tiamina e incubarlo per 10-12 ore a 30 °C.
      NOTA: L'espressione di FtsZ e MreB di specie diverse sotto il promotore nmt41 in S. pombe può variare, tipicamente da 16 a 30 ore. Il momento ottimale per l'espressione proteica di GFP-EcMreB e SaFtsZ-GFP in S. pombe è di 20 - 24 ore e 16 - 20 ore a 30 °C, rispettivamente, senza tiamina.

2. Trattamento di colture di S. pombe che esprimono proteine citoscheletriche batteriche marcate con GFP

NOTA: Un certo numero di diverse molecole di farmaci vengono testate sulla coltura di lievito coltivata durante la notte in una piastra a 96 pozzetti.

  1. Inoculare una coltura fresca trasferendo 50 μl della coltura notturna in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente 150 μl di terreno EMM di lievito fresco utilizzando lo strumento di pipettaggio multicanale semiautomatico a 96 pozzetti.
  2. Durante il pipettaggio in entrata e in uscita per una corretta miscelazione utilizzando una pipetta multicanale semiautomatica a 96 pozzetti, introdurre lentamente diverse concentrazioni crescenti di farmaci nella coltura in crescita, ciascuna eseguita in triplice copia, come rappresentato nello schema nella Figura 1.
  3. Come controllo positivo, utilizzare i farmaci già noti, PC190723 per (S. aureus FtsZ) e A22 (per E. coli MreB) in duplice copia.
    NOTA: Come riportato in precedenza, PC190723 e A22 sono stati utilizzati rispettivamente a una concentrazione di 56,2 μM17 e 72,6 μM 14,17. Nel frattempo, il trattamento A22 di SaFtsZ e il trattamento PC190723 di EcMreB sono serviti rispettivamente come controlli negativi.
  4. Utilizzare il DMSO come controllo del solvente a tre diverse concentrazioni in base alle concentrazioni più basse e più alte di farmaci.
    NOTA: Il solvente in cui sono disciolti i farmaci viene utilizzato come controllo del solvente.
  5. Incubare le colture di controllo e trattate a 30 °C per 6-10 ore (fino a quando le cellule mostrano l'espressione di proteine fluorescenti batteriche) e quindi eseguire l'imaging utilizzando la microscopia a epifluorescenza.

3. Visualizzazione dei polimeri

  1. Applicare un rivestimento di 20 μL di 1 mg/mL di concanavalina A su ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti inferiore otticamente trasparente (con pareti nere per l'imaging a fluorescenza) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il liquido e lasciarlo asciugare all'aria per 10 min.
  2. Trasferire 20 μL di cellule dalla piastra di coltura in ciascun pozzetto e lasciare riposare per 10 minuti. Lavare la cella 3x-4x con il terreno sterile EMM.
  3. Con la lente dell'obiettivo da utilizzare in posizione (vedere il passaggio 3.6), utilizzare la modalità navigatore nel pannello di acquisizione del software di acquisizione delle immagini per l'allineamento della piastra a 96 pozzetti e la copertura del pozzetto. Allineare i bordi del pozzetto sul navigatore.
  4. Quindi, selezionare i parametri di copertura del pozzetto, che includono una selezione multiposizione della regione di interesse nel pozzetto, e utilizzare il controllo adattivo della messa a fuoco automatica con la modalità on-demand per mantenere il campione a fuoco durante l'imaging.
  5. Acquisizione di immagini utilizzando il contrasto interferenziale differenziale (DIC) e la fluorescenza. Impostare filtri di eccitazione ed emissione di 475/28 nm e 525/48 nm, rispettivamente, per visualizzare le proteine batteriche marcate con GFP espresse nel lievito. Ottenere Z-stack con una dimensione del passo di 0,2 μm attraverso lo spessore delle cellule di lievito (5 μm).
  6. Cattura immagini utilizzando un microscopio a epifluorescenza invertito dotato di un obiettivo a immersione in olio 100x da 1,4 NA e una fotocamera sCMOS da 2.000 x 2.000 (dimensione pixel 6,5 μm x 6,5 μm). Utilizzare un sistema di illuminazione a LED per l'eccitazione del fluoroforo.
    NOTA: Qualsiasi sistema di microscopio a epifluorescenza dotato di un tavolino motorizzato per una piastra a 96 pozzetti con un posizionamento multipunto preciso dovrebbe essere adatto. Acquisire tutte le immagini cellulari di controllo e trattate con farmaci con un tempo di esposizione simile (di solito nell'intervallo 0,3 - 0,5 s) con un binning di 1 x 1 e illuminazione al 15% - 20% per ridurre al minimo le variabili dell'esperimento e mantenere la coerenza.

4. Quantificazione delle immagini utilizzando ImageJ

  1. Elabora le immagini delle cellule e misura il numero di spot per cella e la densità per FtsZ17. Nel caso di MreB, misurare la densità e l'anisotropia23 e confrontare tra cellule di controllo e trattate utilizzando Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
  2. Utilizzando le immagini del canale DIC, delineare prima le singole cellule di lievito utilizzando lo strumento di disegno a mano libera e salvarle come regione di interesse (ROI) nel ROI manager. Questo passaggio non è ancora automatizzato, ma strumenti sviluppati di recente utilizzando l'apprendimento automatico25,26 potrebbero essere tentati e incorporati nel prossimo futuro.
  3. Mascherare l'area esterna della cella e riempire di nero come descritto in27.
  4. Utilizzare la macro di analisi OPS threshold IJ1, una funzione integrata nelle Figi, per contare il numero di punti24.
  5. Utilizzare il metodo otsu per la soglia automatica e mascherare le particelle segmentate. Eseguire il plug-in analizza le particelle utilizzando una macro.
  6. Per misurare la densità del polimero (quantità di citoscheletro per unità di area in una cellula), elaborare le immagini come descritto, comprese le fasi di mascheramento e scheletratura27,28. Usa il filtro 2D Lpx nel plug-in lpx per scheletrare le immagini.
  7. Per i dettagli, controlla questa recente pubblicazione17. Eseguire la quantificazione del polimero EcMreB come menzionato inprecedenza in 23, utilizzare l'anisotropia per quantificare l'organizzazione spaziale utilizzando FibrilTool29 come descritto in precedenza23.
    NOTA: Questi metodi di analisi possono essere utilizzati per quantificare qualsiasi altra proteina del citoscheletro batterico trattata o non trattata dai farmaci.

Risultati

Allestimento della piastra a 96 pozzetti per lo screening dei farmaci
L'uso di S. pombe per esprimere una GFP C-terminale marcata con S. aureus FtsZ da un vettore (pREP42) contenente il promotore repressibile della tiamina nmt41a media forza è stato precedentemente stabilito17 e, analogamente, anche l'MreB di E. coli marcato con GFP N-terminale è stato espresso in S. pombe14. Abbiamo anche dimostrato che PC1...

Discussione

La resistenza antimicrobica (AMR) è una grave minaccia per la salute globale e c'è un urgente bisogno di nuovi antibiotici con nuovi bersagli. Il citoscheletro batterico è emerso come un bersaglio interessante per lo sviluppo di nuovi antibiotici, con inibitori di piccole molecole della proteina di divisione cellulare FtsZ, come TXA709, già in studi clinici di fase I30. Sono stati sviluppati diversi metodi per identificare gli inibitori della polimerizzazione di FtsZ

Divulgazioni

Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

SMP, SR e AKS riconoscono le borse di studio ricevute dal National Institute of Science Education and Research, Dipartimento di Energia Atomica. RS riconosce il sostegno finanziario intramurale del Dipartimento di Energia Atomica e questo lavoro è supportato da una sovvenzione di ricerca a RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) dal Dipartimento di Biotecnologia (DBT). Gli autori ringraziano anche V Badireenath Konkimalla per i suoi commenti, suggerimenti e discussioni durante lo sviluppo del protocollo.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. BlackThermo Scientific™160376
96-well plateCorning  CLS3370
A22 HydrochlorideSigma SML0471Dissolved in DMSO
AdenineFormediumTMDOC0229225 mg/L of media 
Concanavalin A Sigma C5275-5MG
DMSOSigma 317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)FormediumTMPMD0210See below for composition
EDTA Sigma EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position sliderEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 mg/L of media 
Leica DMi8 inverted fluorescence microscopeLeica MicrosystemsGerman company
LeucineFormediumTMDOC0157225 mg/L of media 
Lithium acetate Sigma 517992-100G
PC190723Merck 344580Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)Sigma 202398
ThiamineSigmaT4625Filter sterilised
Tris-HydrochlorideMP194855
UracilFormediumTMDOC0214225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) AgarFormediumTMPCM0410See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) BrothFormediumTMPCM0310See below for composition
Yeast (S. pombe) media 
Yeast extract + supplements (YES)
Compositiong/L
Yeast extract5
Dextrose30
Agar17
Adenine0.05
L-Histidine0.05
L-Leucine0.05
L-Lysine HCl0.05
Uracil0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
Compositiong/Lconcentration
potassium hydrogen phthallate 314.7mM
Na2HPO4 2.215.5 mM
NH4Cl 593.5 mM
glucose2% (w/v) or 20 g/L 111 mM
Salts (stock x 50)20 mL/L (v/v)
Vitamins (stock x 1000)1 mL/L (v/v)
Minerals (Stock x 10,000)0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50 52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M) 52.50.26 M
0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM) 0.0007354.99 mM
50 g/l KCl (0.67 M) 500.67 M
2 g/l Na2SO4 (14.l mM)214.1 mM
Vitamins x 1000 1 g/l pantothenic acid 14.20 mM
10 g/l nicotinic acid 1081.2 mM
10 g/l inositol 1055.5 mM
10 mg/l biotin 0.0140.8 µM
Minerals x 10,000 boric acid580.9 mM
MnSO4  423.7 mM
ZnSO4.7H2O413.9 mM
FeCl2.6H2O  27.40 mM
molybdic acid 0.42.47 mM
KI 16.02 mM
CuSO4.5H2O 0.41.60 mM
citric acid 1047.6 mM
Strains/ Plasmids
StrainsDescriptionReference
CCD190Escherichia coli DH10β Invitrogen
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023

Riferimenti

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