Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح البروتوكول طريقة لجمع الدم من الأوردة البابية والوريد الأجوف السفلي من الفئران بالتتابع لتقييم إنتاج وامتصاص المستقلبات الميكروبية في الأمعاء.

Abstract

من المعروف أن المنتجات الميكروبية المعوية تعمل محليا داخل الأمعاء ويتم امتصاصها في الدورة الدموية ، حيث يمكن أن تمتد آثارها إلى العديد من أنظمة الأعضاء البعيدة. الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFA) هي فئة واحدة من المستقلبات التي تنتجها ميكروبات الأمعاء أثناء تخمير الألياف الغذائية غير القابلة للهضم. يتم التعرف عليهم الآن كمساهمين مهمين في كيفية تأثير ميكروبيوم الأمعاء على أنظمة الأعضاء خارج الأمعاء عبر الأمعاء والرئة والأمعاء والدماغ ومحاور الأمعاء والأعضاء الأخرى في جميع أنحاء المضيف. يتم امتصاص SCFAs من القولون ، من خلال أنسجة الأمعاء ، إلى الوريد البابي (PV). ثم تمر عبر الكبد ، وتستهلك في أعضاء مختلفة مثل الدماغ والعضلات والأنسجة الدهنية والرئتين. يتم قياس SCFAs بسهولة أكبر في مادة البراز المطرودة ، ومع ذلك ، تم الحصول على قياسات أكثر دقة من محتويات البراز داخل القولون. نقترح هنا أن أخذ عينات من البلازما الكهروضوئية والبلازما الدائرية الجهازية لموضوع واحد قد يكون مفضلا لدراسة الامتصاص والنقل والمستويات الجهازية ل SCFAs في الفئران. نقدم تقنية جديدة لأخذ عينات الدم بكفاءة من الوريد الأجوف الكهروضوئي والسفلي (IVC) التي تسمح بجمع كميات كبيرة نسبيا من الدم من البوابة والدورة الدموية الجهازية. يتم تحقيق ذلك عن طريق ربط PV ، مما يسمح بتوسيع أو توسيع PV أثناء ردمها من الأوردة المساريقية التي تصب فيه. باستخدام هذه الطريقة ، تمكنا من تحسين معدل الجمع الناجح بالإضافة إلى الكمية الإجمالية للدم الذي تم جمعه (حتى 0.3 مل من IVC و 0.5 مل من PV).

Introduction

الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة (SCFA) هي فئة رئيسية من المستقلبات التي تنتجها ميكروبات الأمعاء. تم دعم أدوارها الحاسمة في التفاعل بين ميكروبيوم الأمعاء والأعضاء البعيدة الأخرى1 من خلال الأبحاث التي تصف كيفية تعديلها للالتهاب ، والإشارة من خلال مستقبلات مخصصة ، وتعمل كركائز في التمثيل الغذائي الخلوي2،3،4،5. اقترح العمل الأخير لمجموعتنا أن SCFAs هي المفتاح في الجسم الحي المنظمين الالتهابيين لقوة مناعة الرئة في الجسم الحي عبر محور الأمعاء والرئة6،7. وصفت تقارير إضافية تأثيرها الوظيفي على عملية التمثيل الغذائي عبر محور الأمعاء والدماغ8،9. بشكل عام ، يخضع تأثير SCFAs على فسيولوجيا وعلم الأمراض المضيف لإجراء تحقيق نشط ومكثف من قبل العديد من المجموعات البحثية التي تغطي مجموعة واسعة من عمليات المرض.

الأسيتات (C2) والبروبيونات (C3) والزبدات (C4) هي SCFAs الأولية ويتم إنشاؤها بواسطة ميكروبات الأمعاء من خلال تخمير الألياف الغذائية القابلة للابتلاع في الأعور والأمعاء الغليظة. يمكن أيضا الحصول على جميع SCFAs الثلاثة مباشرة من النظام الغذائي ، ويمكن أيضا إنتاج خلايا الثدييات الأسيتات فقط. يتم امتصاص SCFAs في القولون ويتم استخدامها جزئيا بواسطة الخلايا الظهارية المعوية (كمصدر للطاقة ، لتعديل المناعة للأنسجة المحلية ولدعم صيانة حاجز الأمعاء). يتم نقلها أيضا إلى الوريد البابي عبر الجهاز الوريدي المساريقي10. يستهلك الزبدات بشكل أساسي عن طريق ظهارة الأمعاء ، والبروبيونات بواسطة الكبد11،12 ، وقد تم الإبلاغ عن أن الأسيتات تعمل على الأنسجة العضلية والدهنية بعد دخول الدورة الدموية المحيطية13،14.

يتطلب التقييم الشامل لإنتاج SCFA وامتصاصه ونشاطه الوظيفي معرفة مستويات SCFA داخل تجويف القولون ، في الدورة الدموية البابية والدم المحيطي. يمكن تحقيق ذلك عن طريق جمع الدم من الوريد البابي (PV) والدورة الدموية الجهازية في وقت واحد أو بالتتابع في نفس. نظرا لأن SCFAs متقلبة15 ، فإن قياس مستوياتها في كريات البراز المطرودة قد لا يعكس بدقة المستويات داخل القولون. علاوة على ذلك ، بالمقارنة مع القياسات من محتويات القولون ، قد يعكس مستوى SCFAs الموجودة في PV بشكل أكثر دقة المجموع الصافي لمستويات الحالة المستقرة التي يمتصها المضيف مقابل المستويات غير المتساوية التي ينتجها ميكروبيوم الأمعاء طوال طول القولون11. وبالتالي ، قد تكون مستويات SCFA الكهروضوئية هذه أكثر صلة وملاءمة لدراسة تأثيرات SCFAs على فسيولوجيا المضيف وعلم الأمراض بما يتجاوز التأثيرات المحلية داخل الأمعاء.

لإجراء الجمع المنسق والمتزامن شبه المتزامن للدم الكهروضوئي والدورة الدموية الجهازية ، يجب أن يظل الحجاب الحاجز سليما للحفاظ على الدورة الدموية الطبيعية ودعم التنفس التلقائي. لذلك ، يقدم الوريد الأجوف السفلي (IVC) موقعا مثاليا للحصول على دم الدورة الدموية الجهازية أثناء جمع الدم الكهروضوئي. يمكن أيضا استخدام دم IVC لأغراض أخرى ، مثل قياس السيتوكينات المنتشرة لتقييم الالتهاب الجهازي.

حاليا ، تم الإبلاغ عن عدد قليل فقط من الطرق لجمع الدم من كل من الدورة الدموية الجهازية والكهروضوئية في القوارض الكبيرة16،17. الطرق التقليدية ، التي تتطلب قنية الأوعية في الفئران ، يصعب من الناحية الفنية في الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، لا يزيد الحد الأقصى لكمية الدم التي يتم جمعها بهذه الطرق عادة عن 0.3 مل18.

في هذه الورقة ، نقدم طريقة جديدة تبسط عملية جمع الدم المزدوج من IVC للفأر متبوعا بالكهروضوئية في نفس. الميزة الفريدة لهذه الطريقة هي ربط PV بالقرب من النقير الكبدي قبل أخذ عينات الدم الكهروضوئية. يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى توسيع أبعاد الكهروضوئية ، وبالتالي تحسين معدل النجاح بشكل كبير بالإضافة إلى زيادة الحد الأقصى لحجم الدم القابل للتحصيل حتى 0.5 مل.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الخطوات في إجراء عدم البقاء على قيد الحياة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها (IACUC) في جامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو. كان جنس الفأر والسلالة المستخدمة من ذكور الفئران C57BL / 6J (تزن 25-35 جم وتتراوح أعمارهم بين 12-15 أسبوعا). يمكن أيضا استخدام سلالات الفأر الأنثوية و / أو غيرها من سلالات الفئران القياسية.

1. التخدير

  1. امسح النصف السفلي من بطن الفأر بمسحات إيثانول بنسبة 70٪. قم بإعطاء التخدير عن طريق إعطاء حقنة ثلاثي البروم الإيثانول داخل الصفاق (250-400 مجم / كغ). يمكن أيضا استخدام تخدير الكيتامين / الزيلازين أو الأيزوفلوران. ضع مرهم العين على العينين لمنع تلف القرنية.
  2. حقن البوبرينورفين (0.05-0.1 مجم / كغ) داخل الصفاق للتسكين.
    ملاحظة: البوبرينورفين مطلوب بسبب الألم المصاحب لإجراء شق البطن.

2. شق البطن

  1. ضع الفأر المخدر على سطح الجراحة (مع وجود وسادة تسخين تحتها) في وضع الاستلقاء. اربط جميع أطراف الفأر على اللوحة الجراحية بشريط لاصق. تأكد من أن عمق التخدير المناسب قد تم تحقيقه عن طريق قرصة إصبع القدم دون رد فعل سحب الدواسة.
  2. ارفع الجلد وقم بعمل شق طولي بمقص تشريح على طول خط الوسط من السرة إلى عملية الخنجري وذيلية باتجاه قاعدة البطن (العضو التناسلي الخارجي).
  3. قم بعمل شق مماثل في الصفاق بمقص تشريح دون ثقب أو إتلاف الأمعاء أو الحجاب الحاجز أو الكبد.
  4. قم بتوسيع المجال الجراحي عن طريق عمل شق عرضي كامل الطول (يمتد عرض البطن) بمقص على جانبي السرة.
  5. انقل الأمعاء الغليظة والدقيقة إلى الجانب الأيمن للجراح باستخدام شاش نظيف مبلل في PBS دافئ لكشف IVC أدناه.

3. إعداد الأربطة للكهروضوئية

  1. قم بمعالجة الأجزاء المعوية داخل المجال الجراحي برفق باستخدام قطعة قطن لتحديد موقع PV في جذر المساريق.
  2. باستخدام مجهر تشريح لتصور الأوعية الدموية وهياكل البطن الأخرى ، قم بتمرير خياطة البرولين 7-0 بعناية خلف PV بالقرب من نقير الكبد (بين الوريد الاثني عشر والوريد الطحالي)19 بحيث يكون جاهزا للربط في الخطوة 5 (الشكل 1).
    ملاحظة: استخدام المجهر من هذه الخطوة فصاعدا ليس إلزاميا ولكنه يحسن بشكل كبير معدل نجاح الإجراء الإجمالي.

4. جمع عينات الدم من IVC

  1. أدخل إبرة 28G 1/2 بوصة من حقنة الأنسولين الهيبارينية 1 سم مكعب في IVC. اجمع 0.2-0.3 مل من عينة الدم.
    ملاحظة: إذا تمت إزالة الكثير من الدم في هذه الخطوة ، فسيؤدي ذلك إلى انخفاض كميات الدم الكهروضوئية التي تم جمعها في الخطوة 5.
  2. اترك الإبرة داخل IVC لتجنب النزيف الذي قد يحدث مع الإزالة.

5. جمع عينات الدم من PV

  1. اربط برفق رباط البرولين 7-0 حول الكهروضوئية ؛ يجب أن يتمدد الكهروضوئي ويتوسع أثناء الردم. أدخل إبرة 28G 1/2 بوصة من حقنة أنسولين أخرى 1cc هيبارين في PV.
  2. استنشق ببطء لجمع ما يصل إلى 0.3-0.5 مل من الدم من PV. قد ينهار الكهروضوئية ولكن يجب أن يعاد التوسع تدريجيا مع إعادة ملء الدم من الجهاز الوريدي المساريقي.

6. تخزين العينة

  1. قم بإزالة الإبر من IVC و PV بعد جمع الدم.
  2. انقل عينات الدم من المحاقن إلى 1.5 مل من أنابيب eppendorf heparinized ووضعها على الجليد لمعالجتها لاحقا في البلازما لتخزينها وتحليلها حسب الحاجة.
  3. قتل الفأر بالقتل الرحيم باستخدام جرعة زائدة مخدرة متبوعة بخلع عنق الرحم (وفقا للإرشادات المعتمدة من UCSF IACUC).

النتائج

باستخدام الطريقة الموضحة أعلاه ، يمكننا جمع عينات الدم من IVC و PV بالتتابع في نفس الماوس بمعدل نجاح يزيد عن 95٪. متوسط أحجام عينات الدم التي تم جمعها هو 0.25 مل ل IVC و 0.35 مل للكهروضوئية.

باستخدام قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا للغاز (GC-MS) ، قمنا بقياس تركيز SCFAs ...

Discussion

تصف هذه الورقة طريقة مبتكرة في الجسم الحي لجمع عينات الدم بشكل شبه متزامن بالتتابع من IVC و PV في نفس الفأر التجريبي. هذه الطريقة مفيدة لقياس مستويات المنتجات التي يتم إنشاؤها بواسطة ميكروبات الأمعاء ، مثل SCFAs ، التي تنتقل عبر دوران البوابة. يبلغ متوسط الحجم الأقصى للد?...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

يتم تمويل AP من خلال جائزة R01 من المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI (1R01HL146753). يتم تمويل DM من خلال زمالة T32 من المعاهد الوطنية للصحة ومن خلال جوائز تجريبية للمتدرب / الموظفين من مركز UCSF Benioff لطب الميكروبيوم.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2 Tribromoethanol, 97% (Avertin)Sigma Aldrich T48402-25GAnesthetic agent 
Buprenorphine Hydrochloride Injection 0.3 mg/mLPAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05Analgesic agent
Dressing ForcepsMiltex 6-100Dissection 
Graefe ForcepsRobozRS-5136Dissection 
Hepatin sodium 1000 USP units/mLHikmaNDC 0641-0391-12Blood sample syringes/tubes heparinization
Prolene 7-0Ethicon8696GPortal vein ligature
ScissorsF.S.T14058-11Dissection 
Student Halsted-Mosquito HemostatsF.S.T 91308-12Dissection 
Surgical tape 3M Transpore1527-1Mouse limbs fixation
U-100 Insulin Syringe 28G1/2EXEL26027Blood sample collection 

References

  1. vander Hee, B., Wells, J. M. Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids. Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).
  2. Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
  3. Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. Regulation of inflammation by short chain fatty acids. Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).
  4. Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets. Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).
  5. den Besten, G., et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).
  6. Tian, X., et al. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Front Microbiol. 10, 159 (2019).
  7. Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).
  8. De Vadder, F., et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).
  9. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).
  10. Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).
  11. Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).
  12. Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).
  13. Neis, E. P., et al. Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man. Gut. 68 (4), 764-765 (2019).
  14. Yamashita, H., et al. Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).
  15. Ríos-Covián, D., et al. Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health. Front Microbiol. 7, 185 (2016).
  16. Jaworska, K., et al. An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products. J Vis Exp. (140), e58456 (2018).
  17. Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985 (2023).
  18. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  19. Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).
  20. Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).
  21. Hoyles, L., et al. Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier. Microbiome. 6 (1), 55 (2018).
  22. Shimizu, J., et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. PLoS One. 13 (9), e0203657 (2018).
  23. Wang, J., et al. Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response. Front Immunol. 8, 1108 (2017).
  24. Lucas, S., et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun. 9 (1), 55 (2018).
  25. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J Vis Exp. (92), e51955 (2014).
  26. Sänger, C., et al. Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications. PLoS One. 10 (11), e0141798 (2015).
  27. Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. Portal Vein Injuries: A Review. J Emerg Trauma. 2 (2), 4 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

SCFA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved