Prelievo sequenziale di sangue dalla vena cava inferiore seguito da vena porta per valutare i metaboliti microbici intestinali nei topi

Riepilogo

Il protocollo dimostra un metodo per raccogliere in sequenza il sangue dalle vene porta e dalla vena cava inferiore dai topi per valutare la produzione e l'assorbimento dei metaboliti microbici intestinali.

Abstract

È noto che i prodotti microbici intestinali agiscono sia localmente all'interno dell'intestino che vengono assorbiti in circolo, dove i loro effetti possono estendersi a numerosi sistemi di organi distanti. Gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono una classe di metaboliti prodotti dai microbi intestinali durante la fermentazione di fibre alimentari indigeribili. Ora sono riconosciuti come importanti contributori al modo in cui il microbioma intestinale influenza i sistemi di organi extra-intestinali attraverso gli assi intestino-polmone, intestino-cervello e altri assi intestino-organo in tutto l'ospite. Gli SCFA vengono assorbiti dal colon, attraverso il tessuto intestinale, nella vena porta (PV). Passano quindi attraverso il fegato e vengono consumati in vari organi come il cervello, i muscoli, il tessuto adiposo e i polmoni. Gli SCFA sono più facilmente misurabili nel materiale fecale espulso, tuttavia, misurazioni più accurate sono state ottenute dal contenuto fecale intra-colon. Qui proponiamo che il campionamento del PV e del plasma circolante sistemico di un singolo soggetto possa essere preferibile per studiare l'assorbimento, il trasporto e i livelli sistemici di SCFA nei topi. Presentiamo una nuova tecnica per un efficiente prelievo di sangue dalla PV e dalla vena cava inferiore (IVC) che consente la raccolta di volumi relativamente grandi di sangue dalla circolazione portale e sistemica. Ciò si ottiene legando il PV, consentendo così la dilatazione o l'allargamento del PV mentre si riempie dalle vene mesenteriche che drenano in esso. Utilizzando questo metodo, siamo stati in grado di migliorare il tasso di raccolta riuscita e la quantità totale di sangue raccolto (fino a 0,3 ml da IVC e 0,5 ml da PV).

Introduzione

Gli acidi grassi a catena corta (SCFA) sono una delle principali classi di metaboliti prodotti dal microbiota intestinale. Il loro ruolo critico nell'interazione tra il microbioma intestinale e altri organi distanti¹ è stato supportato da ricerche che descrivono come modulano l'infiammazione, segnalano attraverso recettori dedicati e fungono da substrati nel metabolismo cellulare ^2,3,4,5. Recenti lavori del nostro gruppo hanno proposto che gli SCFA siano regolatori infiammatori chiave in vivo del tono immunitario polmonare in vivo attraverso l'asse intestino-polmone ^6,7. Ulteriori rapporti hanno descritto la loro influenza funzionale sul metabolismo attraverso l'asse intestino-cervello ^8,9. Nel complesso, l'influenza degli SCFA sulla fisiologia e sulla patologia dell'ospite è oggetto di un'intensa indagine da parte di numerosi gruppi di ricerca che abbracciano un'ampia gamma di processi patologici.

L'acetato (C2), il propionato (C3) e il butirrato (C4) sono i principali SCFA e sono generati dal microbiota intestinale attraverso la fermentazione di fibre alimentari ingeribili nel cieco e nell'intestino crasso. Tutti e tre gli SCFA possono anche essere ottenuti direttamente dalla dieta e solo l'acetato può essere prodotto anche dalle cellule di mammifero. Gli SCFA sono assorbiti nel colon e sono parzialmente utilizzati dalle cellule epiteliali intestinali (come fonte di energia, per la modulazione immunitaria locale dei tessuti e per supportare il mantenimento della barriera intestinale). Vengono anche trasportati nella vena porta attraverso il sistema venoso mesenterico¹⁰. Il butirrato viene consumato principalmente dagli epiteli intestinali, il propionato dal fegato^11,12 ed è stato riportato che l'acetato agisce sui tessuti muscolari e adiposi dopo essere entrato nella circolazione periferica^13,14.

Una valutazione completa della produzione, dell'assorbimento e dell'attività funzionale dell'SCFA richiede la conoscenza dei livelli di SCFA all'interno del lume del colon, nella circolazione portale e nel sangue periferico. Ciò può essere ottenuto mediante la raccolta di sangue dalla vena porta (PV) e dalla circolazione sistemica simultaneamente o in sequenza nello stesso animale. Poiché gli SCFA sono volatili¹⁵, la misurazione dei loro livelli nei pellet fecali espulsi potrebbe non riflettere accuratamente i livelli all'interno del colon. Inoltre, rispetto alle misurazioni del contenuto del colon, il livello di SCFA presenti nel PV può riflettere in modo più accurato la somma netta dei livelli di stato stazionario assorbiti dall'ospite rispetto ai livelli irregolari prodotti dal microbioma intestinale per tutta la lunghezza del colon¹¹. Questi livelli di SCFA PV possono quindi essere più rilevanti e appropriati per studiare gli effetti degli SCFA sulla fisiologia e sulla patologia dell'ospite al di là degli effetti locali all'interno dell'intestino.

Per eseguire la raccolta coordinata e quasi simultanea del sangue PV e del sangue circolante sistemico, il diaframma deve rimanere intatto in modo da mantenere la normale circolazione sanguigna e supportare la respirazione spontanea. Pertanto, la vena cava inferiore (IVC) presenta un sito ideale per ottenere la circolazione sistemica del sangue durante la raccolta del sangue PV. Questo sangue IVC può essere utilizzato anche per altri scopi, come la misurazione delle citochine circolanti per valutare l'infiammazione sistemica.

Attualmente, solo pochi metodi per la raccolta del sangue sia dalla circolazione sistemica che dalla PV sono stati riportati nei roditori più grandi^16,17. I metodi convenzionali, che richiedono l'incannulamento dei vasi nei ratti, sono tecnicamente difficili da eseguire nei topi. Inoltre, la quantità massima di sangue raccolta con questi metodi non è solitamente superiore a 0,3 ml¹⁸.

In questo articolo, presentiamo un nuovo metodo che semplifica il processo di doppia raccolta del sangue da IVC di topo seguita da PV nello stesso animale. La caratteristica unica del metodo è la legatura del PV vicino all'ilo epatico appena prima del prelievo di sangue PV. Questo approccio può espandere le dimensioni del PV, migliorando così significativamente il tasso di successo e aumentando il volume massimo di sangue raccoglibile fino a 0,5 ml.

Protocollo

Tutte le fasi di questa procedura di non sopravvivenza sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California di San Francisco. Il sesso e il ceppo di topo utilizzati erano topi maschi C57BL/6J (del peso di 25-35 g e di età compresa tra 12 e 15 settimane). Possono essere utilizzati anche ceppi di topi femminili e/o altri ceppi di topi standard.

1. Anestesia

1. Pulire la metà inferiore dell'addome del topo con tamponi di etanolo al 70%. Somministrare l'anestesia praticando un'iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo (250-400 mg/kg). È possibile utilizzare anche l'anestesia con ketamina/xilazina o isoflurano. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire danni alla cornea.
2. Iniettare buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) per via intraperitoneale per analgesia.
   NOTA: La buprenorfina è necessaria a causa del dolore associato alla procedura di laparotomia.

2. Laparotomia

1. Posizionare il mouse anestetizzato sulla superficie chirurgica (con un termoforo sottostante) in posizione supina. Fissare tutti gli arti del mouse sulla tavola chirurgica con del nastro adesivo. Verificare che la profondità appropriata dell'anestesia sia stata raggiunta pizzicando le dita dei piedi senza riflesso di ritiro del pedale.
2. Sollevare la pelle e praticare un'incisione longitudinale con le forbici da dissezione lungo la linea mediana dall'ombelico al processo xifoideo e caudalmente verso la base dell'addome (organo genitale esterno).
3. Praticare un'incisione simile nel peritoneo con le forbici da dissezione senza perforare o danneggiare l'intestino, il diaframma o il fegato.
4. Espandi il campo chirurgico praticando un'incisione trasversale a tutta lunghezza (estendendo la larghezza dell'addome) con le forbici su entrambi i lati dell'ombelico.
5. Sposta l'intestino crasso e tenue sul lato destro del chirurgo usando una garza pulita imbevuta di PBS caldo per esporre l'IVC sottostante.

3. Preparazione della legatura per PV

1. Manipolare delicatamente i segmenti intestinali all'interno del campo chirurgico con un batuffolo di cotone per individuare il PV alla radice del mesentere.
2. Utilizzando un microscopio da dissezione per visualizzare i vasi e le altre strutture addominali, passare con cautela una sutura di prolene 7-0 dietro il PV vicino all'ilo epatico (tra la vena duodenale e la vena splenica)¹⁹ in modo che sia pronta per la legatura nella fase 5 (Figura 1).
   NOTA: L'uso di un microscopio da questo passaggio in poi non è obbligatorio, ma migliora significativamente il tasso di successo complessivo della procedura.

4. Raccolta di campioni di sangue dall'IVC

1. Inserire l'ago da 28 G 1/2 pollice di una siringa da insulina eparinizzata da 1 cc nell'IVC. Raccogliere 0,2-0,3 mL di campione di sangue.
   NOTA: Se viene rimosso troppo sangue in questo passaggio, si otterrà una riduzione dei volumi di sangue PV raccolti nel passaggio 5.
2. Lasciare l'ago all'interno dell'IVC in modo da evitare il sanguinamento che si verificherebbe con la rimozione.

5. Prelievo di campioni di sangue dal PV

1. Legare delicatamente la legatura in prolene 7-0 attorno al PV; il fotovoltaico dovrebbe espandersi e dilatarsi durante il riempimento. Inserire l'ago da 28 G 1/2 pollice di un'altra siringa da insulina da 1 cc eparinizzata nel PV.
2. Aspirare lentamente per raccogliere fino a 0,3-0,5 ml di sangue dal PV. Il PV può collassare, ma dovrebbe riespandersi gradualmente con il riempimento del sangue dal sistema venoso mesenterico.

6. Conservazione dei campioni

1. Rimuovere gli aghi dall'IVC e dal PV dopo il prelievo del sangue.
2. Trasferire i campioni di sangue dalle siringhe a provette Eppendorf eparinizzate da 1,5 ml e metterli su ghiaccio per la successiva trasformazione in plasma per la conservazione e l'analisi secondo necessità.
3. Eutanasia del topo utilizzando un sovradosaggio di anestetico seguito da lussazione cervicale (secondo le linee guida approvate dall'UCSF IACUC).

Risultati

Utilizzando il metodo sopra descritto, possiamo raccogliere campioni di sangue dall'IVC e dal PV in sequenza nello stesso topo con un tasso di successo superiore al 95%. I volumi medi di campioni di sangue raccolti sono di 0,25 mL per l'IVC e di 0,35 mL per il PV.

Utilizzando la gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), abbiamo misurato la concentrazione di SCFA nelle feci, nel sangue PV e nel sangue IVC e siamo stati quindi in grado di tracciare l'asso...

Discussione

Questo articolo descrive un metodo innovativo in vivo per la raccolta quasi simultanea di campioni di sangue in sequenza dall'IVC e dal PV nello stesso topo sperimentale. Questo metodo è utile per misurare i livelli di prodotti generati dal microbiota intestinale, come gli SCFA, che transitano attraverso la circolazione portale. Il volume massimo medio di sangue che può essere raccolto durante una procedura terminale nei topi (del peso di 25-30 g) è di circa 1 ml/topo, che a ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2 Tribromoethanol, 97% (Avertin)	Sigma Aldrich	T48402-25G	Anesthetic agent
Buprenorphine Hydrochloride Injection 0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	Analgesic agent
Dressing Forceps	Miltex	6-100	Dissection
Graefe Forceps	Roboz	RS-5136	Dissection
Hepatin sodium 1000 USP units/mL	Hikma	NDC 0641-0391-12	Blood sample syringes/tubes heparinization
Prolene 7-0	Ethicon	8696G	Portal vein ligature
Scissors	F.S.T	14058-11	Dissection
Student Halsted-Mosquito Hemostats	F.S.T	91308-12	Dissection
Surgical tape	3M Transpore	1527-1	Mouse limbs fixation
U-100 Insulin Syringe 28G1/2	EXEL	26027	Blood sample collection