عزل الخلايا البطانية البنكرياسية للفأر

Summary

يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا البطانية للفأر عن البنكرياس الكامل.

Abstract

البنكرياس هو عضو حيوي للحفاظ على التوازن الأيضي داخل الجسم ، ويرجع ذلك جزئيا إلى إنتاجه للهرمونات الأيضية مثل الأنسولين والجلوكاجون ، وكذلك الإنزيمات الهاضمة. البنكرياس هو أيضا عضو شديد الأوعية الدموية ، وهي ميزة تسهلها الشبكة المعقدة للشعيرات الدموية في البنكرياس. تتكون هذه الشبكة الشعرية الواسعة من خلايا بطانية عالية الدقة (ECs) مهمة لنمو البنكرياس ووظيفته. وفقا لذلك ، يمكن أن يساهم الخلل الوظيفي في ECs في مرض البنكرياس في أمراض مثل مرض السكري والسرطان. وبالتالي ، فإن البحث في وظيفة ECs البنكرياس (pECs) مهم ليس فقط لفهم بيولوجيا البنكرياس ولكن أيضا لتطوير أمراضه. نماذج الفئران هي أدوات قيمة لدراسة أمراض التمثيل الغذائي والقلب والأوعية الدموية. ومع ذلك ، لم يكن هناك بروتوكول محدد يحتوي على تفاصيل كافية موصوفة لعزل pECs للفأر بسبب قلة عدد السكان نسبيا من ECs والإنزيمات الهاضمة الوفيرة التي يحتمل أن يتم إطلاقها من الأنسجة الأسينار والتي يمكن أن تؤدي إلى تلف الخلايا ، وبالتالي انخفاض الإنتاجية. لمواجهة هذه التحديات ، ابتكرنا بروتوكولا لإثراء واستعادة pECs للفأر ، يجمع بين التفكك الفيزيائي والكيميائي اللطيف والاختيار بوساطة الأجسام المضادة. يوفر البروتوكول المقدم هنا طريقة قوية لاستخراج ECs سليمة وقابلة للحياة من بنكرياس الفأر بأكمله. هذا البروتوكول مناسب لفحوصات المصب المتعددة ويمكن تطبيقه على نماذج الماوس المختلفة.

Introduction

البنكرياس ، مفتاح التحكم في التمثيل الغذائي والتوازن ، هو عضو شديد الأوعية الدموية. يحتوي البنكرياس على وظائف الغدد الصماء والإفرازات ، مما يتحكم في تنظيم نسبة الجلوكوز في الدم والإنزيمات الهاضمة ، على التوالي. ترتبط هاتان الجزءان معا من خلال شبكة واسعة من الأوعية الدموية في البنكرياس ، مما يسهل تبادل ونقل الأكسجين والهرمونات والإنزيمات. بشكل حاسم ، تخترق هذه الشبكة الشعرية الكثيفة جزيرة لانجرهانز ، وهي مجموعة من الخلايا المنظمة للهرمونات داخل البنكرياس المسؤولة عن وظيفة الغدد الصماء ، وتتكون من خلايا ألفا (α) التي تفرز الجلوكاجون ، وخلايا بيتا (β) التي تفرز الأنسولين وخلايا دلتا (δ) التي تفرز السوماتوستاتين^1،2. على الرغم من أن الجزر تشكل 1-2٪ فقط من كتلة البنكرياس ، إلا أنها تتلقى 20٪ من إجمالي تدفق الدم³ ، مما يسلط الضوء على أهمية الأوعية الدموية في الجزيرة. تتكون الشعيرات الدموية البنكرياس بشكل أساسي من خلايا بطانية عالية الكثافة (ECs) ، محاطة بخلايا محيطية جدارية تلعب هذه المحيطات الشعرية دورا حيويا في تطور الجزيرة ، والنضج ، ووظيفة (dys) وتشكل أحاديث متبادلة حميمة مع العديد من الخلايا الداخلية والخارجية⁴ (الشكل 1).

لوحظ الخلل البطاني في كل من مرض السكري من النوع 1 والنوع 2 ، وهي الحالات الأكثر شيوعا التي يسببها خلل في جزيرة البنكرياس^5،6. يمكن تغيير كل من كثافة الأوعية الدموية الدقيقة والتشكل في مرض السكري⁷. علاوة على ذلك ، يتميز سرطان البنكرياس ، وهو ورم شديد العدوانية يمكن أن يتجلى أيضا في مرض السكري ، بكثافة عالية للأوعية الدموية الدقيقة مع ضعف التروية⁸. بالنظر إلى الأدوار الهيكلية والوظيفية المحورية ل ECs في كل من أنسجة البنكرياس الطبيعية والمريضة ، هناك حاجة ذات صلة لدراسة pECs في التطور وعلم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض للكشف عن الآليات التي تقود الصحة أو الأمراض.

تم تطوير العديد من البروتوكولات لعزل ECs عن الفئران المختلفة (على سبيل المثال ، الدماغ^9،10 ، الرئة¹¹ ، القلب¹² ، الكبد¹³ ، عضلات الهيكل^{العظمي 14} ، والأنسجة الدهنية¹⁵) والإنسان (على سبيل المثال ، الدماغ¹⁶ ، والأنسجة الدهنية الحشوية^17،18 ، والأعصاب الطرفية¹⁹ ، والرئة^20،21،22 ، والشريان المساريقي²³) الأنسجة. تتضمن هذه البروتوكولات عادة استخدام عمليات الهضم الأنزيمية (على سبيل المثال ، عن طريق الكولاجيناز ، والتربسين²⁴ ، والتباين^{24 ، 25} ، وليبيراز²⁶) ، متبوعة بخطوة تخصيب قائمة على الأجسام المضادة. علاوة على ذلك ، تميل هذه البروتوكولات إلى الاعتماد على فترات طويلة من الهضم بتركيزات عالية من الإنزيمات مع تحريض قوي عند 37 درجة مئوية (الجدول 1). نظرا للسمات الفريدة للبنكرياس ، بما في ذلك أنه يضم عددا كبيرا من الإنزيمات الهاضمة الذاتية ، لا يمكن تطبيق هذه البروتوكولات الحالية مباشرة لعزل pECs. أولا ، يختلف تكوين المصفوفة خارج الخلية (ECM) للبنكرياس عن الأنسجة الأخرى. بينما يستخدم الكولاجيناز بشكل شائع لعزل EC ، إلا أن هناك أنواعا فرعية متعددة ذات قدرات تفكك مختلفة خاصة بالأنسجة ، مما يتطلب التحسين. ثانيا ، وأمر بالغ الأهمية لعزل pEC ، يمكن أن يؤدي إطلاق وتنشيط الإنزيمات الداخلية للبنكرياس إلى إعاقة عملية العزل بشكل كبير. تحقيقا لهذه الغاية ، يجب توخي الحذر لتقليل تمزق خلايا الأسينار الخارجية (المصدر الأساسي للزيموجين والبروتياز و RNase²⁷) ، والتي يمكن أن تسبب مزيدا من تلف الخلايا وتؤدي إلى انخفاض قابلية الخلايا للحياة وتؤثر بشكل عام على التعافي^27،28،29.

لمواجهة هذه التحديات ، قمنا بتكييف طرق من بروتوكولات عزل EC الحالية وأنشأنا بروتوكولا جديدا مناسبا لعزل EC عن بنكرياس الفئران. على وجه التحديد ، نصف هنا سير عمل (الشكل 2) باستخدام الكولاجيناز من النوع الأول (يتم تنفيذه عادة لعزل الرئة EC) ، وانخفاض درجات حرارة الهضم وعدم الإثارة (لمنع تنشيط زيموجين البنكرياس) ، ومكملات DNase^30،31،32 (لمنع موت الخلايا المبرمج الناجم عن الحمض النووي وتحسين صلاحية الخلية ، وجسم مضاد ل CD31³³ (PECAM1 ، علامة عموم EC). ينتج البروتوكول الموصوف مجموعات EC معزولة من بنكرياس الفأر والتي يمكن استخدامها في توصيف التعبير الجيني ومقايسات البروتين.

Protocol

تم إجراء عزل الأنسجة بموجب بروتوكول الدراسة المعتمد # 17010 من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي (IACUC) التابعة لمعهد أبحاث بيكمان ، مدينة الأمل (دوارتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). هنا ، نستخدم Tie-2CreERT2 ؛ خط فأر Rosa26-TdTomato في خلفية C57BL / 6 في عمر 8-12 أسبوعا. في هذا الخط ، يتم تصنيف ECs ب TdTomato عند تحفيزها بعقار تاموكسيفين كما هو موضح^{سابقا 34}. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لجميع أعمار الفئران البالغة ذات الأنماط الجينية والخلفيات الوراثية المختلفة.

1. جمع الأنسجة (الوقت المقدر: 1-2 ساعة)

ملاحظة: تقدير الوقت هو 15 دقيقة / ، بحد أقصى موصى به 3 مجمعة لكل عينات تفكك.

1. القتل الرحيم للحيوانات عن طريق جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون (CO₂) ، يليه تأكيد ثانوي للوفاة. قبل التشريح ، رش الجسم كله بنسبة 70٪ من الإيثانول (EtOH) ، مما يؤدي إلى تطهير منطقة التشغيل تماما.
2. مد الأطراف وتأمينها باستخدام المسامير. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق صغير في خط الوسط عبر الجلد والصفاق بدءا من منطقة أسفل البطن ويمتد نحو منطقة الصدر.
3. كشف القفص الصدري عن طريق قطع الحجاب الحاجز ورفع القفص الصدري لكشف القلب.
4. أدخل إبرة (25G-30G) متصلة بحقنة تحتوي على PBS معقم مثلج ، في البطين الأيسر للقلب.
5. ابدأ التروية عن طريق حقن PBS عبر القلب بمعدل 5 - 10 مل / دقيقة. توقف بعد حقن 10 مل ، أو حتى يتغير لون الكبد والكلى.
6. بعد التروية ، حدد موقع البنكرياس (أسفل المعدة والمتصل بالاثني عشر)³⁵ (الشكل 3 أ) وقم بإزالته بعناية باستخدام مقص تشريح وملقط.
7. بمجرد عزله ، انقل البنكرياس إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من مثبط PBS المثلج + 0.2 مجم / مل مثبط التربسين ، واستمر في وضع الثلج (الشكل 3 ب).
   ملاحظة: يمكن تجميع البنكرياس من 3 فئران كحد أقصى في هذه الخطوة ونقله إلى أنبوب واحد. يمكن حفظ العينات على الجليد لمدة أقصاها 2 ساعة.

2. تحضير الكولاجيناز (الوقت المقدر: 15-30 دقيقة)

1. قم بإعداد الحلول والمخازن المؤقتة كما هو موضح أدناه.
   1. محلول التفكك: أضف الكولاجيناز من النوع الأول إلى أنبوب سعة 50 مل إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS 1x (Ca²⁺ ، Mg²⁺ ؛ انظر جدول المواد) و 0.001 U / mL DNase I + 0.2 مجم / مل مثبط التربسين.
   2. محلول إيقاف التفكك: أضف محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS 1x ، بدون Ca²⁺ ،^{Mg 2+} ؛ نفس الشيء لجميع PBS المتبقية في هذا البروتوكول ؛ انظر جدول المواد) ، 5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، 0.001 U / مل DNase I أو DMEM + 10٪ FBS + 0.001 MU / مل DNase I.
   3. محلول الغسيل: أضف PBS 1x ، 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، 0.001 وحدة / مل DNase I + 0.05 مجم / مل مثبط التربسين.
2. قم بإذابة المخازن المؤقتة تماما وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. توضع جانبا وتترك على الثلج.

3. الهضم (الوقت المقدر: 40 دقيقة - 1 ساعة)

1. يرفع البنكرياس من PBS المثلج ويوضع على طبق بتري فوق الثلج. قم بإزالة الأنسجة الزائدة بعناية (مثل الطحال والدهون والحطام) باستخدام المقص الجراحي والملاقط (الشكل 3 ج).
   ملاحظة: من الضروري إزالة الدهون ، لأن الدهون الزائدة يمكن أن تتداخل مع هضم الأنسجة.
2. انقل بنكرياس الفأر المشذب إلى أنبوب سعة 5 مل يحتوي على 1 مل من محلول التفكك.
3. احتفظ بالأنبوب على الجليد وافرم أنسجة البنكرياس بمقص تشريح إلى قطع دقيقة قابلة للسحب ، على سبيل المثال 0.5 مم أو 1 مم. انقل المحللة إلى أنبوب سعة 50 مل واحتفظ به على الثلج.
4. أضف بنكرياس إضافيا إلى أنبوب 5 مل المستخدم لفرم أنسجة البنكرياس في البداية وإضافة 1 مل إضافي من الكولاجيناز. كرر حسب الضرورة لمستحضرات البنكرياس المتعددة.
5. أضف 2 مل من محلول الكولاجيناز إلى أنبوب 5 مل لإزالة أي أنسجة بنكرياس متبقية ونقلها إلى أنبوب سعة 50 مل. يجب أن يكون إجمالي حجم الكولاجيناز 5 مل ل 3 بنكرياس أو 3 مل لبنكرياس واحد.
6. بمجرد أن تخضع جميع العينات للتفكك الميكانيكي ، انقل الأنابيب سعة 50 مل التي تحتوي على محللات الأنسجة المتجانسة إلى حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضانها لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: لا تقم بتحريك خليط الأنسجة أو دوامته بقوة أثناء هذه العملية لأن ذلك قد يتسبب في تمزق أنسجة الأسينار وإطلاق إنزيمات داخلية وفيرة والحمض النووي.
7. قم بإزالة الأنابيب من الحمام المائي ولفها برفق حتى تمتزج جيدا ، واتركها في حمام مائي لمدة 10 دقائق أخرى (الوقت الإجمالي: 20 دقيقة).
   ملاحظة: لا تتجاوز 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية لتجنب الإفراط في الهضم.
8. ضع الأنابيب على الجليد ، واترك المتجانس يستقر عن طريق الجاذبية. بمجرد تسويته ، انقل المادة الطافية من خلال مرشح 70 ميكرومتر ، وأضف 5 مل من محلول إيقاف التفكك.
9. أضف 1 مل إضافي من محلول التفكك إلى الحبيبات المتبقية وقم بترتيتورها بإبرة 18G.
10. مرر المتجانس المتبقي عبر الفلتر واغسله ب 5 مل إضافي من محلول إيقاف التفكك.
11. تعليق خلية الدوران عند 300 × جم لمدة 10 دقائق ، عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية تماما عن طريق الشفط واحتفظ بحبيبات الخلية على الجليد.
12. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 1 مل من عازلة الغسيل وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
13. خذ كمية صغيرة من حبيبات الخلية المعلقة (10 ميكرولتر) واخلطها مع التريبان الأزرق بنسبة 1: 1 لحساب الخلايا باستخدام عداد الخلايا وقياس الجدوى.

4. إثراء الخلايا البطانية (EC) (الوقت المقدر: 2-3 ساعات)

1. أضف 1 ميكرولتر من الجسم المضاد المضاد للبيوتين CD31 لكل 1 × 10⁷ خلايا يتم عدها واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية على دوار (حوالي 5 ميكرولتر لكل 3 بنكرياس).
2. أضف 20 ميكرولتر من الميكروبيدات المضادة للبيوتين واحتضانها لمدة 40 دقيقة عند 4 درجات مئوية على دوار أنبوبي.
3. قم بإعداد حامل مغناطيسي مع حامل فاصل العمود وقم بتطبيق العمود. توازن العمود مع 3 مل من المخزن المؤقت للغسيل.
4. أضف عينة إلى العمود واغسلها بإجمالي 9 مل من محلول الغسيل.
   ملاحظة: إذا كان تركيز الخلية مرتفعا ، فقم بتخفيف الخلايا بسعة 2 مل إضافية من محلول الغسيل في أنبوب منفصل. أضف 1 مل من العينة في كل مرة إلى العمود لمنع انسداد العمود.
5. قم بإزالة العمود من حامل العمود وضعه في أنبوب سعة 15 مل. أضف 5 مل من مخزن الغسيل إلى العمود. استخدم المكبس لدفع الخلايا الموجودة في العمود لأسفل وجمع الشطف (الذي يحتوي على EC المخصب).
6. قم بالدوران لأسفل التدفق والشطف / جزء EC عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. عد الخلايا وقياس الجدوى كما في الخطوة 3.13.
7. التحقق من صحة تخصيب EC عبر qPCR لكسور التدفق والإي سي. استخدم NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) كعلامة عامة لخلايا الغدد الصماء وجزيء التصاق الصفائح الدموية والخلايا البطانية (Pecam1) كعلامة ل EC³³. استخدم 36B4 (Rplp0 ، البروتين الفوسفوسي الريبوزومي الحمضي p0) كعنصر تحكم داخلي لتطبيع التعبير الجيني.
   ملاحظة: يمكن استخدام العينات التي تم جمعها لتحليل البروتين أو الحمض النووي الريبي في هذه الخطوة.

5. زراعة pECs

1. تحضير M199 متوسط. مكمل M199 بتركيز متوسط إلى نهائي من 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 0.1٪ بنسلين ستربتومايسين.
2. قم بتغطية صفيحة زراعة الخلايا مقاس 60 مم بالكولاجين من النوع الأول (1 مجم / مل في 0.1 مولار من حمض الخليك) واتركها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
3. قم بإزالة الكولاجين من النوع الأول واشطف الطبق باستخدام 1X PBS مرتين. أضف 2 مل من وسائط M199 المحضرة وضع لوحة زراعة الخلايا في حاضنة زراعة الخلايا القياسية (5٪ CO₂ ، 37 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
4. بمجرد عزل الخلايا ، أضف الخلايا المعزولة إلى لوحة زراعة الخلايا M199 الدافئة مسبقا. احتفظ بالخلايا في ظروف المزرعة لمدة 14 يوما تقريبا وقم بتغيير الوسائط كل 2-3 أيام.

النتائج

باتباع هذا البروتوكول ، يمكن الحصول على ما يقرب من 2 × 10⁶ خلايا حية عند تجميع 3 بنكرياس فأر و 750,000 خلية من بنكرياس فأر واحد. للتحقق من صحة تخصيب EC ، أجرينا التحليلات التالية: 1) تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي: مقارنة بعينات التدفق (FT) (أي الكسور المرتبطة بالأجسام المضا...

Discussion

في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا لإثراء وعزل pECs. على غرار بروتوكولات عزل EC السابقة من الأنسجة أو الأعضاء الأخرى ، يتكون هذا البروتوكول من ثلاث عمليات رئيسية ، وهي التفكك الجسدي ، والهضم الأنزيمي ، وإثراء EC القائم على الأجسام المضادة. لمواجهة التحديات الفريدة في معالجة ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath