בידוד תאי אנדותל של לבלב עכבר

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי אנדותל עכבר מלבלב שלם.

Abstract

הלבלב הוא איבר חיוני לשמירה על איזון מטבולי בגוף, בין היתר בשל ייצורו של הורמונים מטבוליים כגון אינסולין וגלוקגון, כמו גם אנזימי עיכול. הלבלב הוא גם איבר מאוד וסקולרי, תכונה הקלה על ידי הרשת המורכבת של נימי הלבלב. רשת נימים נרחבת זו מורכבת מתאי אנדותל בעלי הגנה גבוהה (ECs) החשובים להתפתחות הלבלב ולתפקודו. לפיכך, תפקוד לקוי של ECs יכול לתרום לזה של הלבלב במחלות כמו סוכרת וסרטן. לכן, חקר הפונקציה של ECs הלבלב (pECs) חשוב לא רק להבנת הביולוגיה של הלבלב, אלא גם לפיתוח הפתולוגיות שלה. מודלים של עכברים הם כלים יקרי ערך לחקר מחלות מטבוליות ומחלות לב וכלי דם. עם זאת, לא היה פרוטוקול מבוסס עם פרטים מספיקים המתוארים לבידוד של pECs עכבר בשל האוכלוסייה הקטנה יחסית של ECs ואנזימי העיכול השופעים שעלולים להשתחרר מרקמת acinar שיכול להוביל נזק לתאים, ולכן, תפוקה נמוכה. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו פרוטוקול להעשרה ושחזור של pECs בעכברים, המשלב דיסוציאציה פיזיקלית וכימית עדינה וברירה בתיווך נוגדנים. הפרוטוקול המוצג כאן מספק שיטה חזקה לחילוץ ECs שלמים וברי קיימא מכל לבלב העכבר. פרוטוקול זה מתאים לבדיקות מרובות במורד הזרם וניתן להחיל אותו על דגמי עכברים שונים.

Introduction

הלבלב, המפתח לשליטה מטבולית והומאוסטזיס, הוא איבר מאוד וסקולרי. הלבלב יש פונקציות אנדוקריניות ואקסוקריניות, שליטה על הרגולציה של גלוקוז בדם אנזימי עיכול, בהתאמה. שני תאים אלה מחוברים יחד על ידי רשת נרחבת של כלי דם הלבלב, המאפשרים החלפה והובלה של חמצן, הורמונים ואנזימים. באופן קריטי, רשת נימים צפופה זו חודרת לאי לנגרהנס, אשכול של תאים מווסתים הורמונים בתוך הלבלב האחראי על תפקודו האנדוקריני, המורכב מתאי אלפא מפרישי גלוקגון (α), תאי בטא מפרישי אינסולין (β) ותאי דלתא מפרישי סומטוסטטין (δ) ^1,2. למרות שהאיים מהווים רק 1-2% ממסת הלבלב, הם מקבלים 20% מזרימת הדם הכוללת³, מה שמדגיש את החשיבות של כלי הדם של האיונים. נימי הלבלב מורכבים בעיקר מתאי אנדותל בעלי fenestrated גבוהה (ECs), המוקפים בפריציטים ציורי קיר. ECs נימים אלה ממלאים תפקיד חיוני בהתפתחות האיונים, בהבשלתם ובתפקודם (דיס), ויוצרים שיחות צולבות אינטימיות עם תאים אנדו-סוקרינים ואקסוקריניים שונים⁴ (איור 1).

הפרעות אנדותל נצפו הן בסוכרת מסוג 1 והן בסוכרת מסוג 2, המצבים השכיחים ביותר הנגרמים על ידי תפקוד לקוי של אי הלבלב ^5,6. גם צפיפות כלי הדם וגם המורפולוגיה של האיונים ניתנים לשינוי בסוכרת⁷. יתר על כן, סרטן הלבלב, גידול אגרסיבי מאוד שיכול להתבטא גם כסוכרת, מאופיין בצפיפות כלי דם גבוהה עם זילוח ירוד⁸. בהתחשב בתפקידים המבניים והתפקודיים המרכזיים של ECs ברקמת לבלב נורמלית וחולה, יש צורך רלוונטי לחקור את pECs בפיתוח, פיזיולוגיה ופתולוגיה כדי לחשוף את המנגנונים המניעים בריאות או מחלות.

פרוטוקולים רבים פותחו לבידוד ECs ממורין שונים (למשל, מוח ^9,10, ריאות¹¹, לב¹², כבד¹³, שרירי שלד¹⁴ ורקמות שומן¹⁵) ובני אדם (למשל, מוח¹⁶, רקמת שומן ויסצרלית^17,18, עצבים היקפיים¹⁹, ריאות 20,21,22 ועורק מזנטרי ²³) רקמות. פרוטוקולים אלה כוללים בדרך כלל שימוש בעיכול אנזימטי (למשל, על ידי collagenase, טריפסין²⁴, dispase^24,25, ו liberase²⁶), ולאחר מכן שלב העשרה מבוסס נוגדנים. יתר על כן, פרוטוקולים אלה נוטים להסתמך על משכי עיכול ממושכים בריכוזים גבוהים של אנזימים עם תסיסה נמרצת ב-37°C (טבלה 1). בשל התכונות הייחודיות של הלבלב, כולל העובדה שהוא מכיל שפע של אנזימי עיכול אנדוגניים, לא ניתן ליישם פרוטוקולים קיימים אלה ישירות לבידוד pECs. ראשית, הרכב המטריצה החוץ תאית (ECM) של הלבלב שונה מרקמות אחרות. בעוד שקולגנאז משמש בדרך כלל לבידוד EC, ישנם תת-סוגים רבים עם יכולות דיסוציאציה ספציפיות לרקמות שונות, ולכן דורשים אופטימיזציה. שנית, וחיוני לבידוד pEC, שחרור והפעלה של אנזימים אנדוגניים בלבלב יכולים לעכב באופן משמעותי את תהליך הבידוד. לשם כך, יש לנקוט משנה זהירות כדי למזער את הקרע של תאי אצינר אקסוקריניים (המקור העיקרי של zymogens, proteases, ו RNase²⁷), אשר יכול לגרום נזק נוסף לתאים ולגרום לכדאיות תאים נמוכה ולהשפיע על התאוששות כללית 27,28,29.

כדי להתמודד עם אתגרים אלה, התאמנו שיטות מפרוטוקולי בידוד קיימים של EC וקבענו פרוטוקול חדש המתאים לבידוד EC מלבלב עכברים. באופן ספציפי, אנו מתארים כאן זרימת עבודה (איור 2) באמצעות collagenase Type I (מיושם בדרך כלל עבור בידוד EC ריאות), טמפרטורות עיכול נמוכות יותר וללא תסיסה (כדי למנוע הפעלה של zymogens הלבלב), ותוספת DNase^30,31,32 (כדי למנוע אפופטוזיס המושרה על ידי DNA ולשפר את כדאיות התא, ונוגדן עבור CD31³³ (PECAM1, סמן פאן-EC). הפרוטוקול המתואר מייצר אוכלוסיות EC מבודדות מלבלב עכברים שניתן להשתמש בהן לפרופיל ביטוי גנים ולבדיקות חלבונים.

Protocol

בידוד רקמות בוצע תחת פרוטוקול המחקר המאושר #17010 על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מכון המחקר בקמן, עיר התקווה (דוארטה, קליפורניה, ארה"ב). כאן, אנו משתמשים Tie-2CreERT2; קו העכבר Rosa26-TdTomato ברקע C57BL/6 בגיל 8 - 12 שבועות. בשורה זו, ECs מסומנים עם TdTomato כאשר מושרה עם טמוקסיפן כפי שתואר קודם³⁴. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל הגילאים של עכברים בוגרים עם גנוטיפים שונים ורקע גנטי שונה.

1. איסוף רקמות (זמן משוער: 1-2 שעות)

הערה: הערכת הזמן היא 15 דקות לכל חיה, מומלץ מקסימום 3 בעלי חיים מאוגמים לכל דגימות דיסוציאציה.

1. המתת חסד של בעלי חיים על ידי מנת יתר של פחמן דו חמצני (CO₂), ואחריה אישור משני למוות. לפני הנתיחה, יש לרסס את כל הגוף באתנול 70% (EtOH), תוך חיטוי מלא של אזור הניתוח.
2. מתחו ואבטחו גפיים באמצעות פינים. באמצעות מספריים כירורגיים, לבצע חתך קטן קו האמצע דרך העור והצפק החל מאזור הבטן התחתונה ונמשך לכיוון אזור בית החזה.
3. חשוף את כלוב הצלעות על ידי חיתוך דרך הסרעפת והרם את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב.
4. הכנס מחט (25G-30G) המחוברת למזרק המכיל PBS סטרילי קר כקרח, לחדר השמאלי של הלב.
5. התחל את הזילוח על ידי הזרקת PBS דרך הלב בקצב של 5 - 10 מ"ל / דקה. יש להפסיק לאחר הזרקת 10 מ"ל, או עד שהכבד והכליות הופכים דהויים.
6. לאחר הזילוח, אתרו את הלבלב (מתחת לקיבה ומחוברים לתריסריון)³⁵ (איור 3A) והוציאו אותו בזהירות בעזרת מספריים ומלקחיים.
7. לאחר הבידוד, העבירו את הלבלב לצינור של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של PBS קר כקרח + מעכב טריפסין 0.2 מ"ג/מ"ל, שמרו על קרח (איור 3B).
   הערה: ניתן לאגד לבלב ממקסימום 3 עכברים בשלב זה ולהעבירו לצינור אחד. דגימות ניתן לשמור על קרח לזמן מקסימלי של 2 שעות.

2. הכנת collagenase (זמן משוער: 15-30 דקות)

1. הכן פתרונות ומאגרים כמתואר להלן.
   1. תמיסת דיסוציאציה: הוסף collagenase Type I לתוך צינור 50 מ"ל לריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל במי מלח חוצצים פוספט של Dulbecco (DPBS 1x (Ca²⁺, Mg²⁺; ראה טבלה של חומרים) ו 0.001 U/mL DNase I + 0.2 מ"ג / מ"ל מעכב טריפסין.
   2. תמיסת עצירת דיסוציאציה: הוסף מלח חוצץ פוספט (PBS 1x, ללא Ca²⁺, Mg²⁺; זהה עבור כל שאר PBS בפרוטוקול זה; ראה טבלת חומרים), אלבומין בסרום בקר 5% (BSA), 0.001 U/mL DNase I או DMEM + 10% FBS + 0.001 MU/mL DNase I.
   3. חיץ שטיפה: הוסף PBS 1x, אלבומין סרום בקר 0.5% (BSA), 0.001 U/mL DNase I + 0.05 מ"ג/מ"ל מעכב טריפסין.
2. יש להמיס את המאגרים לחלוטין ולסנן דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר. מניחים בצד ושומרים על קרח.

3. עיכול (זמן משוער: 40 דקות-1 שעות)

1. מוציאים את הלבלב מ-PBS קר כקרח ומניחים על צלחת פטרי על גבי קרח. הסירו בזהירות עודפי רקמה (למשל טחול, שומן, פסולת) בעזרת מספריים כירורגיים ופינצטה כירורגיים (איור 3C).
   הערה: חיוני להסיר שומן, שכן עודף שומנים יכול להפריע לעיכול רקמות.
2. העבר את לבלב העכבר החתוך לצינור 5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של תמיסת דיסוציאציה.
3. יש לשמור את הצינור על קרח ולטחון את רקמות הלבלב בעזרת מספריים מנתחים לחתיכות דקיקות, למשל 0.5 מ"מ או 1 מ"מ. מעבירים ליזט לתוך צינור של 50 מ"ל ושומרים על קרח.
4. הוסף לבלב נוסף לצינור 5 מ"ל המשמש בתחילה לטחון את רקמת הלבלב ולהוסיף 1 מ"ל נוספים של collagenase. חזור על הפעולה לפי הצורך עבור תכשירים מרובים ללבלב.
5. הוסף 2 מ"ל של תמיסת collagenase לצינור 5 מ"ל כדי להסיר כל רקמת לבלב שיורית ולהעביר לצינור 50 מ"ל. נפח collagenase הכולל צריך להיות 5 מ"ל עבור 3 לבלב או 3 מ"ל עבור לבלב יחיד.
6. לאחר שכל הדגימות עברו דיסוציאציה מכנית, העבירו את צינורות 50 מ"ל המכילים את ליזה הרקמה ההומוגנית לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ודגרו במשך 10 דקות.
   הערה: אין להתסיס או לערבל במרץ את תערובת הרקמות במהלך תהליך זה, שכן הדבר עלול לגרום לקרע של רקמות אסינאריות ולשחרור אנזימים אנדוגניים ודנ"א בשפע.
7. מוציאים את הצינורות מאמבט המים ומערבלים בעדינות כדי לערבב היטב, ומשאירים באמבט מים למשך 10 דקות נוספות (סה"כ זמן: 20 דקות).
   הערה: אין לחרוג מ-30 דקות באמבט מים בטמפרטורה של 37°C כדי למנוע עיכול יתר.
8. הניחו צינורות על קרח, ותנו להומוגנט להתיישב על ידי כוח הכבידה. לאחר ההתיישבות, מעבירים סופרנאטנט דרך מסנן 70 מיקרומטר, ומוסיפים 5 מ"ל של תמיסת עצירת דיסוציאציה.
9. הוסף 1 מ"ל נוסף של תמיסת דיסוציאציה לגלולה הנותרת וטריטורט עם מחט 18G.
10. מעבירים את ההומוגנט הנותר דרך המסנן ושוטפים עם 5 מ"ל נוספים של תמיסת עצירת דיסוציאציה.
11. השעיית תא סחרור ב 300 x גרם במשך 10 דקות, ב 4 ° C. הסר את הסופרנאטנט לחלוטין על ידי שאיפה ושמור את גלולת התא על קרח.
12. גלולת תא השעיה עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף ולהעביר צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.
13. קח aliquot קטן מן גלולת התא resuspended (10 μL) וערבב עם כחול טריפאן ביחס של 1:1 כדי לספור תאים באמצעות מונה תאים ולמדוד את הכדאיות.

4. העשרת תאי אנדותל (EC) (זמן משוער: 2-3 שעות)

1. הוסף 1 μL של נוגדן אנטי CD31-ביוטין עבור כל 1 x 10⁷ תאים שנספרו ודגר במשך 30 דקות ב 4 ° C על מסובב (כ 5 μL לכל 3 לבלב).
2. הוסף 20 μL של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין ודגור במשך 40 דקות ב-4°C על מסובב צינור.
3. הגדר מעמד מגנטי עם מחזיק מפריד העמודים והחל את העמודה. יש לאזן את העמודה עם 3 מ"ל של חיץ כביסה.
4. הוסף דוגמה לעמודה ושטוף עם מאגר כביסה כולל של 9 מ"ל.
   הערה: אם ריכוז התאים גבוה, יש לדלל תאים ב-2 מ"ל נוספים של חיץ שטיפה בצינור נפרד. הוסף 1 מ"ל של דגימה בכל פעם לעמודה כדי למנוע סתימה של העמודה.
5. הסר את העמודה ממחזיק העמודות והנח בצינור של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של חיץ כביסה, לעמודה. השתמש בבוכנה כדי לדחוף למטה תאים בעמודה ולאסוף אלוציה (המכילה EC מועשר).
6. סובב כלפי מטה את הזרימה ואת החלק elution/EC ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. ספור תאים ומדוד כדאיות כמו בשלב 3.13.
7. אימות העשרת EC באמצעות qPCR של שברי זרימה ו- EC. השתמש ב- NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) כסמן כללי עבור תאים אנדוקריניים ומולקולת הידבקות טסיות דם ותאי אנדותל (Pecam1) כסמן עבור EC³³. השתמש ב- 36B4 (Rplp0, פוספופרוטאין ריבוזומלי חומצי p0) כבקרה פנימית לנורמליזציה של ביטוי גנים.
   הערה: דגימות שנאספו יכולות לשמש לניתוח חלבונים או RNA בשלב זה.

5. טיפוח pECs

1. הכינו את מדיום M199. תוסף M199 בריכוז בינוני עד סופי של 20% סרום בקר עוברי (FBS) ו-0.1% פניצילין-סטרפטומיצין.
2. מצפים צלחת תרבית תאים בקוטר 60 מ"מ בקולגן מסוג I (1 מ"ג/מ"ל בחומצה אצטית 0.1 מ') ומניחים לשבת 30 דקות בטמפרטורת החדר.
3. מוציאים קולגן מסוג I ושוטפים את הצלחת עם 1X PBS, פעמיים. הוסף 2 מ"ל של מדיה מוכנה M199 ומניחים צלחת תרבית תאים באינקובטור תרבית תאים סטנדרטי (5% CO₂, 37 ° C) למשך 5 דקות.
4. לאחר בידוד התאים, הוסיפו תאים מבודדים לצלחת תרבית תאי M199 שחוממה מראש. שמור תאים בתנאי תרבית במשך כ -14 ימים ולשנות מדיה כל 2-3 ימים.

תוצאות

בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לקבל כ 2 x 10⁶ תאים חיים בעת איגום 3 לבלב עכבר, ו 750,000 תאים מלבלב עכבר יחיד. כדי לאמת את ההעשרה של EC, ביצענו את הניתוחים הבאים: 1) PCR כמותי: בהשוואה לדגימות הזרימה (FT) (כלומר, השברים שאינם קשורים לנוגדנים CD31), לשברי EC היו רמות גבוהות משמעותית של Pecam1

Discussion

במאמר זה נציג פרוטוקול להעשרה ובידוד של ה-pECs. בדומה לפרוטוקולי בידוד EC קודמים מרקמות או איברים אחרים, פרוטוקול זה מורכב משלושה תהליכים עיקריים, כלומר, דיסוציאציה פיזית, עיכול אנזימטי והעשרת EC מבוססת נוגדנים. כדי להתמודד עם האתגרים הייחודיים בעיבוד הלבלב, הצגנו מספר התאמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath