小鼠胰腺内皮细胞的分离

摘要

该方案描述了从整个胰腺中分离小鼠内皮细胞。

摘要

胰腺是维持体内代谢平衡的重要器官，部分原因是它产生胰岛素和胰高血糖素等代谢激素，以及消化酶。胰腺也是一个高度血管化的器官，错综复杂的胰腺毛细血管网络促进了这一特征。这个广泛的毛细血管网络由对胰腺发育和功能很重要的高度开孔的内皮细胞 （EC） 组成。因此，内皮细胞功能障碍会导致糖尿病和癌症等疾病中的胰腺功能障碍。因此，研究胰腺 EC （pEC） 的功能不仅对理解胰腺生物学很重要，而且对发展其病理学也很重要。小鼠模型是研究代谢和心血管疾病的宝贵工具。然而，由于 EC 的数量相对较少，并且腺泡组织中可能释放的大量消化酶可能导致细胞损伤，因此产量低，因此还没有一个既定的方案对小鼠 pEC 的分离提供足够详细的描述。为了应对这些挑战，我们设计了一种方案来富集和恢复小鼠 pEC，将温和的物理和化学解离与抗体介导的选择相结合。这里介绍的协议提供了一种从整个小鼠胰腺中提取完整和活的 EC 的稳健方法。该方案适用于多种下游分析，可应用于各种小鼠模型。

引言

胰腺是代谢控制和体内平衡的关键，是一个高度血管化的器官。胰腺同时具有内分泌和外分泌功能，分别控制血糖和消化酶的调节。这两个隔室通过广泛的胰腺血管网络连接在一起，促进氧气、激素和酶的交换和运输。至关重要的是，这个致密的毛细血管网络穿透了胰岛，胰岛是胰腺内负责其内分泌功能的激素调节细胞簇，由分泌胰高血糖素的 α （α） 细胞、分泌胰岛素的 β （β） 细胞和分泌生长抑素的 δ （δ） 细胞组成 ^1,2。虽然胰岛仅占胰腺质量的 1-2%，但它们接收总血流量的 20^{% 3}，突出了胰岛脉管系统的重要性。胰腺毛细血管主要由高度开孔的内皮细胞 （EC） 组成，这些细胞被壁周细胞包围。这些毛细血管内皮细胞在胰岛发育、成熟和（异常）功能中起着至关重要的作用，并与各种内分泌细胞和外分泌细胞形成密切的串扰⁴（图 1）。

在 1 型和 2 型糖尿病中均观察到内皮功能障碍，这是由胰岛功能障碍引起的最常见疾病 ^5,6。胰岛微血管密度和形态都可以在糖尿病中改变⁷。此外，胰腺癌是一种高度侵袭性的肿瘤，也可表现为糖尿病，其特征是微血管密度高，灌注不良⁸。鉴于 ECs 在正常和患病胰腺组织中的关键结构和功能作用，有必要研究 pECs 在发育、生理学和病理学中的作用，以揭示驱动健康或疾病的机制。

已经开发了许多方案来从不同的小鼠（例如，脑 ^9,10、肺¹¹、心脏¹²、肝脏¹³、骨骼肌¹⁴ 和脂肪组织¹⁵）和人（例如，脑¹⁶、内脏脂肪组织^17、18、周围神经¹⁹、肺^20、21、22 和肠系膜动脉²³）中分离 EC） 组织。这些方案通常涉及使用酶消化（例如，通过胶原酶、胰蛋白酶²⁴、分散酶^24,25 和 liberase²⁶），然后进行基于抗体的富集步骤。此外，这些方案往往依赖于在高浓度酶中延长消化时间，并在 37 °C 下剧烈搅拌（表 1）。由于胰腺的独特特性，包括它含有大量的内源性消化酶，这些现有的方案不能直接应用于分离 pEC。首先，胰腺的细胞外基质 （ECM） 组成与其他组织不同。虽然胶原酶通常用于 EC 分离，但有多种亚型具有不同的组织特异性解离能力，因此需要优化。其次，胰腺内源性酶的释放和激活对 pEC 分离至关重要，可以显著阻碍分离过程。为此，需要谨慎行事，尽量减少外分泌腺泡细胞（酶原、蛋白酶和 RNase²⁷ 的主要来源）的破裂，这会诱导进一步的细胞损伤并导致细胞活力低下，并影响整体恢复 27,28,29。

为了应对这些挑战，我们采用了现有 EC 分离方案的方法，并建立了一种适用于从小鼠胰腺中分离 EC 的新方案。具体来说，我们在这里描述了一种工作流程（图 2），使用 I 型胶原酶（通常用于肺 EC 分离）、较低的消化温度和无搅拌（以防止胰腺酶原的激活）和 DNase 30,31,32 补充剂（防止 DNA 诱导的细胞凋亡和提高细胞活力，以及 CD31³³ 抗体（PECAM1，一种 pan-EC 标记物）。所述方案产生从小鼠胰腺中分离的 EC 群体，可用于基因表达分析和蛋白质测定。

研究方案

组织分离由希望之城贝克曼研究所（美国加利福尼亚州杜阿尔特）的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的研究方案 #17010 进行。这里，我们使用 Tie-2CreERT2;8 - 12 周龄时 C57BL/6 背景下的 Rosa26-TdTomato 小鼠系。在该行中，如前所述，当用他莫昔芬诱导时，ECs 用 TdTomato 标记³⁴。然而，该方案可以适用于具有不同基因型和遗传背景的所有年龄的成年小鼠。

1. 组织收集（预计时间:1-2 小时）

注意:时间估计为 15 分钟/动物，建议每个解离样品最多合并 3 只动物。

1. 通过二氧化碳 （CO₂） 过量对动物实施安乐死，然后二次确认死亡。解剖前，用 70% 乙醇 （EtOH） 喷洒全身，对手术区域进行彻底消毒。
2. 使用别针伸展并固定四肢。使用手术剪刀，从下腹部开始，穿过皮肤和腹膜做一个小的中线切口，并延伸到胸部区域。
3. 通过切开横膈膜来暴露胸腔，然后提起胸腔以暴露心脏。
4. 将一根针头 （25G-30G） 插入心脏的左心室，该针头连接到装有冰冷无菌 PBS 的注射器。
5. 以 5 - 10 mL/min 的速率通过心脏注射 PBS 开始灌注。注射 10 mL 后停止，或直到肝脏和肾脏变色。
6. 灌注后，找到胰腺（在胃下方并连接到十二指肠）³⁵ （图 3A），并使用解剖剪刀和镊子小心地将其取出。
7. 分离后，将胰腺转移到含有 10 mL 冰冷的 PBS + 0.2 mg/mL 胰蛋白酶抑制剂的 50 mL 管中，保持在冰上（图 3B）。
   注意:在此步骤中，最多可以合并 3 只小鼠的胰腺并转移到 1 个试管中。样品可以在冰上保持最长 2 小时。

2. 胶原酶制备（预计时间:15-30 分钟）

1. 如下所述准备溶液和缓冲液。
   1. 解离溶液:将 I 型胶原酶加入 50 mL 试管中，至终浓度为 1 mg/mL，溶于 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS 1x（Ca²⁺，Mg²⁺;参见 材料表）和 0.001 U/mL DNase I + 0.2 mg/mL 胰蛋白酶抑制剂。
   2. 解离终止液:加入磷酸盐缓冲盐水（PBS 1x，不含 Ca²⁺、Mg²⁺;与本协议中的所有其余 PBS 相同;参见 材料表）、5% 牛血清白蛋白 （BSA）、0.001 U/mL DNase I 或 DMEM + 10% FBS + 0.001 MU/mL DNase I。
   3. 洗涤缓冲液:加入 PBS 1x、0.5% 牛血清白蛋白 （BSA）、0.001 u/mL DNase I + 0.05 mg/mL 胰蛋白酶抑制剂。
2. 完全溶解缓冲液并通过 0.22 μm 过滤器过滤。放在一边，放在冰上。

3. 消化（预计时间:40 min-1 h）

1. 从冰冷的 PBS 中取出胰腺，放在冰上的培养皿上。用手术剪刀和镊子小心去除多余的组织（例如，脾脏、脂肪、碎屑）（图 3C）。
   注意:去除脂肪至关重要，因为过量的脂质会干扰组织消化。
2. 将修剪过的小鼠胰腺转移到含有 1 mL 解离溶液的 5 mL 试管中。
3. 将试管放在冰上，用解剖剪刀将胰腺组织切碎成可移液的细块，例如 0.5 毫米或 1 毫米。将裂解物转移到 50 mL 试管中并保持在冰上。
4. 在用于最初切碎胰腺组织的 5 mL 试管中加入额外的胰腺，并额外添加 1 mL 胶原酶。对于多个胰腺准备，根据需要重复。
5. 向 5 mL 试管中加入 2 mL 胶原酶溶液，以去除任何残留的胰腺组织并转移到 50 mL 试管中。3 个胰腺的总胶原酶体积应为 5 mL，单个胰腺应为 3 mL。
6. 所有样品都经过机械解离后，将含有匀浆组织裂解物的 50 mL 试管转移到 37 °C 水浴中并孵育 10 分钟。
   注:在此过程中，请勿剧烈搅动或涡旋组织混合物，因为这会导致腺泡组织破裂并释放丰富的内源性酶和 DNA。
7. 从水浴中取出试管，轻轻旋转以充分混合，然后在水浴中再放置 10 分钟。（总时间:20 分钟）。
   注:请勿在 37 °C 水浴中超过 30 分钟，以避免过度消化。
8. 将试管放在冰上，让匀浆在重力作用下沉降。沉淀后，通过 70 μm 过滤器转移上清液，并加入 5 mL 解离终止液。
9. 向剩余的沉淀中再加入 1 mL 解离溶液，并用 18G 针头研磨。
10. 将剩余的匀浆通过过滤器，再加入 5 mL 解离终止液洗涤。
11. 在 4 °C 下以 300 x g 离心细胞悬液 10 分钟。 通过抽吸完全去除上清液，并将细胞沉淀保持在冰上。
12. 用 1 mL 洗涤缓冲液重悬细胞沉淀，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。
13. 从重悬的细胞沉淀 （10 μL） 中取出一小份等分试样，以 1:1 的比例与台盼蓝混合，以使用细胞计数器对细胞进行计数并测量活力。

4. 内皮细胞 （EC） 富集（预计时间:2-3 小时）

1. 每计数 1 x 10⁷ 个细胞加入 1 μL 抗 CD31-生物素抗体，并在 4 °C 下在旋转器上孵育 30 分钟（每 3 个胰腺约 5 μL）。
2. 加入 20 μL 抗生物素微珠，并在 4 °C 下在试管旋转器上孵育 40 分钟。
3. 设置带有色谱柱分离器支架的磁力架并应用色谱柱。用 3 mL 洗涤缓冲液平衡色谱柱。
4. 向色谱柱中加入样品，用总共 9 mL 洗涤缓冲液洗涤。
   注:如果细胞浓度较高，请在单独的试管中额外加入 2 mL 洗涤缓冲液稀释细胞。向色谱柱中一次加入 1 mL 样品，以防止色谱柱堵塞。
5. 从色谱柱支架中取出色谱柱，置于 15 mL 试管中。向色谱柱中加入 5 mL 洗涤缓冲液。使用柱塞将柱中的细胞向下推并收集洗脱液（含有富集的 EC）。
6. 在 4 °C 下以 300 x g 的速度离心流出和洗脱/EC 馏分 10 分钟。 计数细胞并测量活力，如步骤 3.13 所示。
7. 通过流出液和 EC 组分的 qPCR 验证 EC 富集。使用 NK6 同源盒 1 （Nkx6.1） 作为内分泌细胞的通用标志物，使用血小板和内皮细胞粘附分子 （Pecam1） 作为 EC³³ 的标志物。使用 36B4 （Rplp0 ，酸性核糖体磷蛋白 p0） 作为基因表达标准化的内部对照。
   注:在此步骤中，收集的样品可用于蛋白质或 RNA 分析。

5. 培养 pEC

1. 准备 M199 培养基。补充 M199 培养基至终浓度为 20% 胎牛血清 （FBS） 和 0.1% 青霉素-链霉素。
2. 用 I 型胶原（1 mg/mL 的 0.1 M 乙酸溶液）包被 60 mm 细胞培养板，并在室温下静置 30 分钟。
3. 去除 I 型胶原，并用 1X PBS 冲洗板，两次。加入 2 mL 制备的 M199 培养基，将细胞培养板置于标准细胞培养箱（5% CO 2,37 °C）中 5 分钟。
4. 分离细胞后，将分离的细胞添加到预热的 M199 细胞培养板中。将细胞在培养条件下保存约 14 天，每 2-3 天更换一次培养基。

结果

按照该方案，当汇集 3 个小鼠胰腺时，可以获得大约 2 x 10^{个 6} 个活细胞，从单个小鼠胰腺中可以获得大约 750,000 个细胞。为了验证 EC 的富集，我们进行了以下分析:1） 定量 PCR:与流穿 （FT） 样品（即非 CD31 抗体结合组分）相比，EC 组分的 Pecam1 （编码 CD31）和 Kdr （编码 VEGFR2）、两个 EC 标记基因³³ 的水平显着升高，NK6 同源框 1 （

讨论

在本文中，我们提出了一种富集和分离 pEC 的方案。与之前从其他组织或器官分离 EC 方案类似，该方案由三个主要过程组成，即物理解离、酶消化和基于抗体的 EC 富集。为了解决胰腺加工中的独特挑战，我们在我们的方案中引入了几个关键的适应和关键步骤:1） 温和的一步胶原酶消化，孵育时间短，2） 补充更高浓度的 DNase 和胰蛋白酶抑制剂，以最大限度地减少 DNA 污染...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath