Isolement de cellules endothéliales pancréatiques de souris

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement de cellules endothéliales de souris à partir de pancréas entier.

Résumé

Le pancréas est un organe vital pour le maintien de l’équilibre métabolique dans le corps, en partie en raison de sa production d’hormones métaboliques telles que l’insuline et le glucagon, ainsi que d’enzymes digestives. Le pancréas est également un organe hautement vascularisé, une caractéristique facilitée par le réseau complexe de capillaires pancréatiques. Ce vaste réseau capillaire est composé de cellules endothéliales (CE) hautement fenestrées importantes pour le développement et la fonction du pancréas. En conséquence, le dysfonctionnement des CE peut contribuer à celui du pancréas dans des maladies comme le diabète et le cancer. Ainsi, la recherche sur la fonction des CE pancréatiques (pEC) est importante non seulement pour comprendre la biologie du pancréas, mais aussi pour développer ses pathologies. Les modèles murins sont des outils précieux pour étudier les maladies métaboliques et cardiovasculaires. Cependant, il n’y a pas eu de protocole établi avec suffisamment de détails décrits pour l’isolement des CEp de souris en raison de la population relativement petite de CE, et de l’abondance d’enzymes digestives potentiellement libérées par le tissu acineux qui peuvent entraîner des lésions cellulaires et, par conséquent, un faible rendement. Pour relever ces défis, nous avons conçu un protocole permettant d’enrichir et de récupérer les pEC de souris, en combinant une dissociation physique et chimique douce et une sélection médiée par les anticorps. Le protocole présenté ici fournit une méthode robuste pour extraire des CE intactes et viables de l’ensemble du pancréas de la souris. Ce protocole convient à plusieurs tests en aval et peut être appliqué à divers modèles de souris.

Introduction

Le pancréas, clé du contrôle métabolique et de l’homéostasie, est un organe hautement vascularisé. Le pancréas a à la fois des fonctions endocriniennes et exocrines, contrôlant la régulation de la glycémie et des enzymes digestives, respectivement. Ces deux compartiments sont reliés entre eux par le vaste réseau de vaisseaux sanguins pancréatiques, facilitant l’échange et le transport d’oxygène, d’hormones et d’enzymes. Ce réseau capillaire dense pénètre dans l’îlot de Langerhans, un groupe de cellules régulatrices d’hormones au sein du pancréas responsables de sa fonction endocrine, composé des cellules alpha (α) sécrétant du glucagon, des cellules bêta sécrétant de l’insuline (β) et des cellules delta sécrétant de la somatostatine (δ) ^1,2. Bien que les îlots ne représentent que 1 à 2 % de la masse pancréatique, ils reçoivent 20 % du flux sanguin total³, ce qui souligne l’importance de la vascularisation des îlots. Les capillaires pancréatiques sont principalement constitués de cellules endothéliales (CE) hautement fenestrées, qui sont entourées de péricytes muraux. Ces CE capillaires jouent un rôle essentiel dans le développement, la maturation et la (dys)fonction des îlots et forment des interactions intimes avec diverses cellules endo- et exocrines⁴ (Figure 1).

Un dysfonctionnement endothélial a été observé dans le diabète de type 1 et de type 2, les affections les plus courantes causées par le dysfonctionnement des îlots pancréatiques ^5,6. La densité microvasculaire et la morphologie des îlots peuvent être modifiées dans le diabète⁷. De plus, le cancer du pancréas, une tumeur très agressive qui peut également se manifester par le diabète, est caractérisé par une densité microvasculaire élevée avec une faible perfusion⁸. Étant donné les rôles structurels et fonctionnels essentiels des CE dans le tissu pancréatique normal et malade, il est pertinent d’étudier les CEP dans le développement, la physiologie et la pathologie afin de dévoiler les mécanismes qui régissent la santé ou les maladies.

De nombreux protocoles ont été développés pour l’isolement des CE à partir de différents tissus murins (par exemple, cerveau ^9,10, poumon¹¹, cœur¹², foie¹³, muscles squelettiques¹⁴ et tissus adipeux¹⁵) et humains (par exemple, cerveau¹⁶, tissu adipeux viscéral^17,18, nerfs périphériques¹⁹, poumon 20,21,22 et artère mésentérique ²³) tissus. Ces protocoles impliquent généralement l’utilisation de digestions enzymatiques (par exemple, par la collagénase, la trypsine²⁴, la dispase^24,25 et la libérase²⁶), suivies d’une étape d’enrichissement à base d’anticorps. De plus, ces protocoles ont tendance à reposer sur des durées prolongées de digestion dans de fortes concentrations d’enzymes avec une agitation vigoureuse à 37 °C (Tableau 1). En raison des caractéristiques uniques du pancréas, notamment le fait qu’il abrite une pléthore d’enzymes digestives endogènes, ces protocoles existants ne peuvent pas être directement appliqués pour isoler les pEC. Tout d’abord, la composition de la matrice extracellulaire (MEC) du pancréas est différente de celle des autres tissus. Bien que la collagénase soit couramment utilisée pour l’isolement de la CE, il existe plusieurs sous-types avec différentes capacités de dissociation spécifiques aux tissus, nécessitant ainsi une optimisation. Deuxièmement, et c’est crucial pour l’isolement de la pEC, la libération et l’activation d’enzymes endogènes pancréatiques peuvent entraver considérablement le processus d’isolement. À cette fin, des précautions doivent être prises pour minimiser la rupture des cellules acineuses exocrines (la principale source de zymogènes, de protéases et de RNase²⁷), qui peuvent induire d’autres dommages cellulaires et entraîner une faible viabilité cellulaire et affecter globalement la récupération 27,28,29.

Pour relever ces défis, nous avons adapté les méthodes des protocoles d’isolement EC existants et établi un nouveau protocole adapté à l’isolement des CE à partir du pancréas de souris. Plus précisément, nous décrivons ici un flux de travail (Figure 2) utilisant la collagénase de type I (généralement mise en œuvre pour l’isolement de la CE pulmonaire), des températures de digestion plus basses et sans agitation (pour empêcher l’activation des zymogènes pancréatiques), et une supplémentation en DNase ^30,31,32 (pour prévenir l’apoptose induite par l’ADN et améliorer la viabilité cellulaire, et un anticorps pour CD31³³ (PECAM1, un marqueur pan-CE). Le protocole décrit produit des populations EC isolées du pancréas de souris qui peuvent être utilisées pour le profilage de l’expression génique et les dosages protéiques.

Protocole

L’isolement des tissus a été effectué selon le protocole d’étude approuvé #17010 par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, Californie, États-Unis). Ici, nous utilisons Tie-2CreERT2 ; Ligne de souris Rosa26-TdTomato en fond C57BL/6 à l’âge de 8 à 12 semaines. Dans cette ligne, les CE sont marqués avec TdTomato lorsqu’ils sont induits avec du tamoxifène comme décrit précédemment³⁴. Cependant, ce protocole peut être adapté à tous les âges de souris adultes avec des génotypes et des antécédents génétiques différents.

1. Prélèvement de tissus (temps estimé : 1-2 h)

REMARQUE : L’estimation du temps est de 15 min/animal, maximum recommandé de 3 animaux regroupés par échantillons de dissociation.

1. Euthanasier les animaux par surdose de dioxyde de carbone (CO₂), suivie d’une confirmation secondaire de la mort. Avant la dissection, vaporisez tout le corps avec de l’éthanol à 70 % (EtOH), désinfectant complètement la zone opératoire.
2. Étirez et fixez les membres à l’aide d’épingles. À l’aide de ciseaux chirurgicaux, faites une petite incision médiane à travers la peau et le péritoine en partant de la région abdominale inférieure et en s’étendant vers la région thoracique.
3. Exposez la cage thoracique en coupant à travers le diaphragme et soulevez la cage thoracique pour exposer le cœur.
4. Insérez une aiguille (25G-30G) reliée à une seringue contenant du PBS stérile glacé, dans le ventricule gauche du cœur.
5. Commencer la perfusion en injectant le PBS à travers le cœur à un débit de 5 à 10 mL/min. Arrêtez après l’injection de 10 ml, ou jusqu’à ce que le foie et les reins se décolorent.
6. Après la perfusion, localisez le pancréas (sous l’estomac et attaché au duodénum)³⁵ (Figure 3A) et retirez-le soigneusement à l’aide de ciseaux à dissection et d’une pince.
7. Une fois isolé, transférez le pancréas dans un tube de 50 mL contenant 10 mL de PBS glacé + 0,2 mg/mL d’inhibiteur de la trypsine, et conservez-le sur de la glace (figure 3B).
   REMARQUE : Le pancréas d’un maximum de 3 souris peut être regroupé à cette étape et transféré dans 1 tube. Les échantillons peuvent être conservés sur glace pendant une durée maximale de 2 h.

2. Préparation de la collagénase (temps estimé : 15-30 min)

1. Préparez les solutions et les tampons comme décrit ci-dessous.
   1. Solution de dissociation : Ajouter la collagénase de type I dans un tube de 50 mL jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS 1x (Ca²⁺, Mg²⁺ ; voir le tableau des matériaux) et 0,001 U/mL de DNase I + 0,2 mg/mL d’inhibiteur de trypsine.
   2. Solution d’arrêt de la dissociation : Ajouter une solution saline tamponnée au phosphate (PBS 1x, sans Ca²⁺, Mg²⁺ ; idem pour tous les autres PBS dans ce protocole ; voir tableau des matériaux), 5 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,001 U/mL de DNase I ou DMEM + 10 % de FBS + 0,001 MU/mL de DNase I.
   3. Tampon de lavage : Ajouter du PBS 1x, 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,001 U/mL de DNase I + 0,05 mg/mL d’inhibiteur de trypsine.
2. Dissoudre complètement les tampons et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Réservez et gardez sur glace.

3. Digestion (temps estimé : 40 min-1 h)

1. Retirez le pancréas du PBS glacé et placez-le sur une boîte de Pétri sur de la glace. Retirez soigneusement l’excès de tissu (p. ex. rate, graisse, débris) à l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince à épiler (figure 3C).
   REMARQUE : Il est crucial d’éliminer les graisses, car l’excès de lipides peut interférer avec la digestion des tissus.
2. Transférez le pancréas de souris paré dans un tube de 5 ml contenant 1 ml de solution de dissociation.
3. Gardez le tube sur de la glace et émincez les tissus pancréatiques avec des ciseaux à dissection en petits morceaux pipetables, par exemple 0,5 mm ou 1 mm. Transférez le lysat dans un tube de 50 ml et conservez-le sur de la glace.
4. Ajoutez du pancréas supplémentaire dans le tube de 5 ml utilisé pour émincer initialement le tissu pancréatique et ajoutez 1 ml de collagénase. Répétez l’opération au besoin pour plusieurs préparations de pancréas.
5. Ajoutez 2 ml de solution de collagénase dans le tube de 5 ml pour éliminer tout tissu pancréatique résiduel et transférez dans un tube de 50 ml. Le volume total de collagénase doit être de 5 ml pour 3 pancréas ou de 3 ml pour un seul pancréas.
6. Une fois que tous les échantillons ont subi une dissociation mécanique, transférez les tubes de 50 mL contenant les lysats tissulaires homogénéisés dans un bain-marie à 37 °C et incubez pendant 10 min.
   REMARQUE : Ne pas agiter vigoureusement ou vortex le mélange de tissus pendant ce processus car cela peut provoquer la rupture des tissus acineux et la libération d’enzymes endogènes abondantes et d’ADN.
7. Retirez les tubes du bain-marie et remuez doucement pour bien mélanger, et laissez-les dans le bain-marie pendant encore 10 min. (Temps total : 20 min).
   REMARQUE : Ne pas dépasser 30 min dans un bain-marie à 37 °C pour éviter une surdigestion.
8. Placez les tubes sur de la glace et laissez l’homogénat se déposer par gravité. Une fois installé, transférez le surnageant à travers un filtre de 70 μm et ajoutez 5 mL de solution d’arrêt de dissociation.
9. Ajoutez 1 ml supplémentaire de solution de dissociation à la pastille restante et triturquez avec une aiguille de 18 G.
10. Passez l’homogénat restant dans le filtre et lavez-le avec 5 ml supplémentaires de solution d’arrêt de dissociation.
11. Suspension à cellules de centrifugation à 300 x g pendant 10 min, à 4 °C. Éliminer complètement le surnageant par aspiration et maintenir la pastille cellulaire sur de la glace.
12. Remettre en suspension la pastille de cellule avec 1 mL de tampon de lavage et transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
13. Prélever une petite aliquote de la pastille de cellules remises en suspension (10 μL) et mélanger avec du bleu de trypan dans un rapport de 1:1 pour compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et mesurer la viabilité.

4. Enrichissement des cellules endothéliales (CE) (temps estimé : 2-3 h)

1. Ajouter 1 μL d’anticorps anti-CD31-biotine pour 1 x 10⁷ cellules comptées et incuber pendant 30 min à 4 °C sur un rotateur (environ 5 μL pour 3 pancréas).
2. Ajouter 20 μL de microbilles d’anti-biotine et incuber pendant 40 min à 4 °C sur un rotateur de tube.
3. Installez un support magnétique avec le support de séparateur de colonne et appliquez la colonne. Équilibrez la colonne avec 3 mL de tampon de lavage.
4. Ajouter l’échantillon dans la colonne et laver avec un total de 9 ml de tampon de lavage.
   REMARQUE : Si la concentration des cellules est élevée, diluez les cellules avec 2 ml supplémentaires de tampon de lavage dans un tube séparé. Ajouter 1 mL d’échantillon à la fois dans la colonne pour éviter que celle-ci ne se bouche.
5. Retirer la colonne du support de colonne et la placer dans un tube de 15 ml. Ajouter 5 ml de tampon de lavage dans la colonne. Utilisez le piston pour enfoncer les cellules dans la colonne et recueillir l’élution (qui contient de l’EC enrichie).
6. Rotation vers le bas et fraction élution/EC à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Comptez les cellules et mesurez la viabilité comme à l’étape 3.13.
7. Validez l’enrichissement en EC par qPCR des fractions à flux continu et EC. Utilisez NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) comme marqueur général pour les cellules endocrines et la molécule d’adhésion des cellules plaquettaires et endothéliales (Pecam1) comme marqueur de EC³³. Utiliser 36B4 (Rplp0, phosphoprotéine ribosomique acide p0) comme contrôle interne pour la normalisation de l’expression génique.
   REMARQUE : Les échantillons collectés peuvent être utilisés pour des analyses de protéines ou d’ARN à cette étape.

5. Culture des pEC

1. Préparez le M199 medium. Supplément M199 à une concentration moyenne à une concentration finale de 20 % de sérum de bovin fœtal (FBS) et de 0,1 % de pénicilline-streptomycine.
2. Enduire une plaque de culture cellulaire de 60 mm de collagène de type I (1 mg/mL dans de l’acide acétique 0,1 M) et laisser reposer 30 min à température ambiante.
3. Retirez le collagène de type I et rincez la plaque avec 1X PBS, deux fois. Ajouter 2 mL de milieu M199 préparé et placer la plaque de culture cellulaire dans un incubateur de culture cellulaire standard (5 % de CO₂, 37 °C) pendant 5 min.
4. Une fois les cellules isolées, ajoutez les cellules isolées dans la plaque de culture cellulaire M199 préchauffée. Conservez les cellules dans des conditions de culture pendant environ 14 jours et changez de milieu tous les 2-3 jours.

Résultats

En suivant ce protocole, environ 2 x 10⁶ cellules vivantes peuvent être obtenues en regroupant 3 pancréas de souris et 750 000 cellules d’un seul pancréas de souris. Pour valider l’enrichissement de la CE, nous avons effectué les analyses suivantes : 1) PCR quantitative : par rapport aux échantillons à flux continu (FT) (c’est-à-dire les fractions non liées aux anticorps CD31), les fractions EC présentaient des niveaux significativement plus élevés de Peca...

Discussion

Dans cet article, nous présentons un protocole d’enrichissement et d’isolation des pEC. Semblable aux protocoles précédents d’isolement des CE à partir d’autres tissus ou organes, ce protocole se compose de trois processus principaux, à savoir la dissociation physique, la digestion enzymatique et l’enrichissement des CE à base d’anticorps. Pour relever les défis uniques du traitement du pancréas, nous avons introduit plusieurs adaptations clés et étapes critiques da...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath